王亞君，周廣航，季春麗，薛金愛，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

埃氏小球藻對(duì)11種抗生素的敏感性

王亞君，周廣航，季春麗，薛金愛，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西太谷030801）

為了探討埃氏小球藻（Chlorella emersonii）株系SXND-12對(duì)11種抗生素的敏感性，采用分光光度法研究了氯霉素、潮霉素、紅霉素、利福平霉素、卡那霉素、硫酸新霉素、頭孢霉素、大慶霉素、氨芐霉素、羧卞霉素、鏈霉素等11種抗生素對(duì)埃氏小球藻生長(zhǎng)的影響，從而來(lái)確定分離、純化藻株時(shí)對(duì)藻細(xì)胞無(wú)害并能抑制伴生雜菌生長(zhǎng)的抗生素濃度。結(jié)果表明，埃氏小球藻對(duì)頭孢霉素、氨芐霉素、羧卞霉素、硫酸新霉素敏感性較弱，對(duì)利福平霉素較為敏感，200 μg/mL（致死劑量）即0.243 mmol/mL（致死濃度）時(shí)，在固體培養(yǎng)中抑制了埃氏小球藻的生長(zhǎng)；對(duì)潮霉素、氯霉素、紅霉素、鏈霉素、大慶霉素、卡那霉素非常敏感，在固體培養(yǎng)中的致死劑量分別達(dá)到20 μg/mL（0.101 mmol/mL），50 μg/mL（0.155 mmol/mL），30 μg/mL（0.041 mmol/mL），50 μg/mL（0.086 mmol/mL），50 μg/mL（0.105 mmol/mL），100 μg/mL（0.206 mmol/mL）。研究可為篩選出小球藻基因工程藻株的篩選試劑、誘變篩選的初篩試劑、建立無(wú)菌體系的選擇試劑奠定基礎(chǔ)。

埃氏小球藻；抗生素；敏感性；生長(zhǎng)抑制

隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人口的不斷增加，全球范圍內(nèi)的能源枯竭現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，傳統(tǒng)石化資源的開發(fā)和利用面臨著前所未有的嚴(yán)峻形勢(shì)：石油、天然氣在50 a內(nèi)將消耗殆盡，煤炭在100 a后也將枯竭[1]，因此，發(fā)展新型的可再生生物能源——生物柴油已刻不容緩。生物柴油是一種可替代石化柴油的新型能源，而以動(dòng)植物油脂、廢棄油脂來(lái)制備生物柴油[2]，原料成本占到70%以上，并且原料供給不穩(wěn)定，產(chǎn)品質(zhì)量無(wú)法保證。能源微藻是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型的產(chǎn)油材料，在缺氮的條件下油脂可大量積累，并且主要化學(xué)成分非常適合制備生物柴油，其被認(rèn)為具有廣闊的發(fā)展前景[3]。

微藻是一種光合自養(yǎng)型生物，同等條件下光合速率高于其他植物數(shù)倍，不僅具有較短的生長(zhǎng)周期，而且在適應(yīng)性、生物量等方面具有巨大的優(yōu)勢(shì)。小球藻可大規(guī)模培養(yǎng)[4]，油脂含量又高，使其具備了制備一種新型油料物質(zhì)的潛力[5]。但是目前自然界存在的藻種都無(wú)法滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的需求。所以，當(dāng)前獲得優(yōu)異工業(yè)藻株是微藻規(guī)?；囵B(yǎng)和聯(lián)產(chǎn)微藻燃油的一個(gè)關(guān)鍵制約因素。培育優(yōu)異藻種通常有遺傳轉(zhuǎn)化和誘變2種主要方法。其中，遺傳轉(zhuǎn)化目標(biāo)針對(duì)性強(qiáng)，誘變產(chǎn)生的突變株較多，短時(shí)間內(nèi)就可能產(chǎn)生一個(gè)巨大的突變庫(kù)。但是如何高效地篩選目標(biāo)變異藻株是這2種方法面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。在遺傳轉(zhuǎn)化體系中，外源基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，會(huì)使新的菌株帶有某種特殊的性質(zhì)，即抗生素陽(yáng)性選擇性標(biāo)記，可為大規(guī)模的藻種鑒定提供強(qiáng)有力的幫助。而對(duì)于誘變產(chǎn)生的不定向突變體的初篩，工作量十分龐大。選取合適的抗生素[6]作為初篩試劑，可大大減少篩選工作量，提高篩選效率。

為篩選得到可用作埃氏小球藻基因工程和誘變產(chǎn)生突變體的選擇試劑，本試驗(yàn)選取了常見的11種不同抗生素，研究埃氏小球藻對(duì)它們的敏感性，旨在為建立和完善埃氏小球藻突變體篩選體系提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 藻種

試驗(yàn)所用的埃氏小球藻（Chlorella emersonii）株系SXND-12由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所從山西省境內(nèi)分離、鑒定獲得，現(xiàn)保存于山西省科技重大專項(xiàng)微藻燃油基地實(shí)驗(yàn)室。

表1 BG11培養(yǎng)基（母液）配方

本試驗(yàn)主要以埃氏小球藻在含有不同種類和不同濃度的抗生素固體培養(yǎng)基上藻落長(zhǎng)出的時(shí)間、一定時(shí)間內(nèi)藻落存活的數(shù)量以及整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)速度及狀態(tài)，作為抗生素影響埃氏小球藻生長(zhǎng)的指標(biāo)，并計(jì)算出各條件下的致死率，進(jìn)而篩選出適合遺傳轉(zhuǎn)化和化學(xué)物理誘變初篩的抗生素試劑。

1.2 培養(yǎng)基

BG11液體和固體培養(yǎng)基按照表1，2的配方進(jìn)行配制，121℃高壓滅菌20 min。滅菌前固體培養(yǎng)基中添加1.2%的瓊脂。按照實(shí)驗(yàn)要求加入各種抗生素。

表2 BG11工作液配方

1.3 主要試劑

鏈霉素（Streptomycin）、氯霉素（Chlorampheni col）購(gòu)自華美生物工程公司，卡那霉素（Kanamycin）、氨芐霉素（Ampicillin）、羧芐霉素（Carbenicillin）、潮霉素（Hvgromvcin）購(gòu)自廣州博衍生物科技有限公司，頭孢霉素（Cefotaxime）、慶大霉素（Gentamycin）購(gòu)自鄭州豫新制藥公司，利福平霉素（Rifampicin）、紅霉素（Erythromycin）、硫酸新霉素（Neomycin）購(gòu)自Invitrogen公司。其中，潮霉素購(gòu)買的是100 mg/mL母液，其他的均是粉末，母液的配制參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行，并用0.22 μm/mL濾膜過(guò)濾除菌。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 接種物的制備 在平板上挑取體積較大、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的埃氏小球藻藻落，利用接種針將其接種于含有一定量新鮮培養(yǎng)液的三角燒瓶中，7 d后轉(zhuǎn)接到體積為250 mL的三角燒瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，長(zhǎng)至指數(shù)期離心，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，時(shí)間5 min，倒掉上清液，無(wú)菌水洗滌2～3次，用一定量新鮮的滅菌培養(yǎng)液懸浮，用于接種。

1.4.2 液體培養(yǎng) 將懸浮液轉(zhuǎn)接到含有一定量培養(yǎng)液的100 mL三角燒瓶中，利用紗布將瓶口包裹若干層，防止細(xì)菌侵入。設(shè)置培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在（25± 0.5）℃，光暗比12 h∶12 h，pH值8.5。

1.4.3 固體培養(yǎng) 取一定量對(duì)數(shù)期的藻液，取100μL涂布于BG11固體平板上，設(shè)置培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度5 000 lx，濕度控制在50%，溫度控制在（25± 0.5）℃。

1.5 埃氏小球藻對(duì)11種抗生素敏感性測(cè)試

將埃氏小球藻進(jìn)行固體培養(yǎng)并按抗生素的種類分為11組試驗(yàn)，每組6～8個(gè)梯度，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，其中，將抗生素濃度為0的試驗(yàn)組作為對(duì)照，以消除試驗(yàn)誤差。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，各種抗生素的最終濃度設(shè)置列于表3。每天觀察各平板上藻落生長(zhǎng)情況，30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出的藻落數(shù)目，計(jì)算致死率。

式中，X0表示對(duì)照組平板上長(zhǎng)出的藻落數(shù)，X1表示各種抗生素平板上長(zhǎng)出的藻落數(shù)目。

表3 11種抗生素的最終質(zhì)量濃度梯度 μg/mL

2 結(jié)果與分析

2.1 埃氏小球藻對(duì)氨芐霉素、羧芐霉素、硫酸新霉素和頭孢霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

在固體培養(yǎng)中，在設(shè)定的試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，Amp（氨芐霉素），Car（羧芐霉素），NM（硫酸新霉素），Cefo（頭孢霉素）等4種抗生素基本不影響小球藻的正常生長(zhǎng)。光照培養(yǎng)箱內(nèi)適宜條件下培養(yǎng)7 d左右，對(duì)照組和試驗(yàn)組均能長(zhǎng)出大量的藻落，10 d左右時(shí)，平板上的藻落數(shù)目趨于穩(wěn)定。圖1～圖4是各試驗(yàn)組在相同條件下培養(yǎng)10 d時(shí)的圖片。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，圖1～圖4每個(gè)平板上的藻落數(shù)分別大約為3 500，1 500，1 800，2 200個(gè)，每個(gè)試驗(yàn)組內(nèi)各個(gè)濃度平板上的藻落數(shù)量基本一致，誤差在±5%左右。因此，從藻落長(zhǎng)出的時(shí)間和數(shù)目這2個(gè)方面進(jìn)行判斷可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)這4種抗生素對(duì)小球藻的生長(zhǎng)沒有影響。

2.2 埃氏小球藻對(duì)氯霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

氯霉素通過(guò)阻礙蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，對(duì)很多藻類的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用[8-12]。黃健等[8]研究表明，新月菱形藻（Nitzschia closterium Ehr.）、牟勒氏角刺藻（Chaetoceros muelleri Lemm.）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohl.）、綠光等鞭金藻8701（Isochrysis galbana Parke 8701）、亞心形扁藻（Platymonas subcordiformis（Wille）Hazen）、小球藻（Chlorella vulgaris Beij.）等6種海洋微藻對(duì)氯霉素普遍敏感。曹軍平等[10]對(duì)金藻的研究也得出了相似的結(jié)論。本試驗(yàn)的結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。由圖5可知，質(zhì)量濃度在5～10 μg/mL范圍內(nèi)，氯霉素對(duì)小球藻的生長(zhǎng)起到了一定的延緩作用，因?yàn)榕c對(duì)照組相比藻落在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的時(shí)間延遲了5 d。當(dāng)氯霉素達(dá)到50μg/mL時(shí)，小球藻的致死率達(dá)到96.23%，與對(duì)照相比，在30 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)僅長(zhǎng)出了少許藻落，且生長(zhǎng)速率極慢，藻落也較小。本研究表明，小球藻對(duì)氯霉素的致死質(zhì)量濃度為50 μg/mL（0.155 mmol/mL），與其他研究結(jié)果[7]較為吻合。但是用氯霉素作為遺傳轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記時(shí)需要注意，氯霉素的溶劑是乙醇，相關(guān)研究表明，乙醇對(duì)某些藻的生長(zhǎng)具有一定的影響，所以，選擇氯霉素時(shí)要考慮乙醇對(duì)試驗(yàn)的影響。

2.3 埃氏小球藻對(duì)紅霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

紅霉素主要通過(guò)抑制mRNA的移位阻礙轉(zhuǎn)肽作用，使核蛋白體上延伸的肽鏈解離，不再形成正常功能的蛋白質(zhì)，從而抑制蛋白質(zhì)的生物合成。劉濱揚(yáng)等[11]關(guān)于紅霉素對(duì)微藻敏感性的研究證實(shí)，紅霉素對(duì)某些微藻在很低的濃度時(shí)就會(huì)有較強(qiáng)的抑制作用。小球藻對(duì)紅霉素非常敏感，在很低的濃度下就完全抑制了小球藻的生長(zhǎng)，它的抑制能力甚至超過(guò)了報(bào)道中常提到的潮霉素和氯霉素[12]。從圖6可以看出，在5～20 μg/mL范圍內(nèi)，隨著抗生素質(zhì)量濃度的不斷增加，小球藻對(duì)其敏感性也呈增強(qiáng)趨勢(shì)，當(dāng)紅霉素質(zhì)量濃度高于20 μg/mL時(shí)，小球藻的致死率急劇增加，從20 μg/mL的51.75%驟增至30 μg/mL的100%。

紅霉素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，在小球藻性基因方面應(yīng)用的比較少，但鑒于小球藻對(duì)其敏感性，紅霉素具有作為陽(yáng)性篩選標(biāo)記基因的潛在價(jià)值。

2.4 埃氏小球藻對(duì)利福平霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

利福平霉素是通過(guò)阻礙DNA正常轉(zhuǎn)錄過(guò)程而達(dá)到殺菌目的的一種抗生素，但在微藻基因工程方面關(guān)于利福平作為抗生素的報(bào)告非常少，本試驗(yàn)的研究較好地填補(bǔ)了這個(gè)空缺。由圖7可知，質(zhì)量濃度為5～100 μg/mL時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)只是在一定程度上受到影響；質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，致死率達(dá)到了94.1%，主要表現(xiàn)為經(jīng)過(guò)30 d的固體培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出少數(shù)幾個(gè)藻落，且其生長(zhǎng)速率極慢，可能是由抗生素破壞了小球藻的生理結(jié)構(gòu)所致。另外，在研究中還發(fā)現(xiàn)，與其他抗生素相比，利福平霉素會(huì)使小球藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生嚴(yán)重的滯后現(xiàn)象，在整個(gè)試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)這種現(xiàn)象都非常明顯。當(dāng)利福平霉素的質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，致死率僅為23.66%，但是它與對(duì)照相比藻落長(zhǎng)出的時(shí)間卻推遲了7 d左右；在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在數(shù)目上各試驗(yàn)組基本沒有差別，但是藻落長(zhǎng)出的時(shí)間卻隨著抗生素濃度的增加不斷地延遲，有的甚至20 d時(shí)才長(zhǎng)出藻落；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不僅最終存活藻落數(shù)大量減少，其生長(zhǎng)的速度也明顯遲緩。

2.5 埃氏小球藻對(duì)潮霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

潮霉素是小球藻基因工程中常用的抗生素[13]，主要是通過(guò)磷酸轉(zhuǎn)移酶的磷酸化作用，改變分子結(jié)構(gòu)，致使細(xì)菌死亡[14]。王長(zhǎng)海等[14]研究表明，潮霉素對(duì)海水小球藻的抑制性較低，但是淡化培養(yǎng)時(shí)5 μg/mL的質(zhì)量濃度幾天后就會(huì)造成小球藻死亡。另外，大量研究表明[15]，海帶、節(jié)旋藻、螺旋藻[16]、小球藻、裙帶、鹽藻等均對(duì)潮霉素有較高的敏感性。從圖8可以看出，質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)，小球藻的致死率達(dá)到了61.59%，與相關(guān)研究的結(jié)果基本一致；質(zhì)量濃度為7.5 μg/mL時(shí)小球藻死亡率高達(dá)94.92%，嚴(yán)重抑制了小球藻的生長(zhǎng)；質(zhì)量濃度為15 μg/mL時(shí)，小球藻全部死亡，主要表現(xiàn)在在規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)（30 d）最終存活的藻落數(shù)為0。表明埃氏小球藻對(duì)潮霉素非常敏感。

2.6 埃氏小球藻對(duì)慶大霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

慶大霉素與氯霉素的抑菌原理相近，都是通過(guò)抑制蛋白質(zhì)的合成起到殺菌的作用。臧曉南等[15]研究表明，Arthrospira341對(duì)慶大霉素比較敏感，在較低的濃度下，培養(yǎng)7 d左右就會(huì)發(fā)現(xiàn)有大量的藻絲死亡。王逸云[17]研究表明，海水小球藻對(duì)慶大霉素敏感性極低，幾乎不影響小球藻的生長(zhǎng)。由圖9可知，當(dāng)慶大霉素質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)就已對(duì)小球藻的生長(zhǎng)造成重大影響，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)30 d后的固體培養(yǎng)基中，與對(duì)照相比藻落的數(shù)目減少約60%，個(gè)體較小、顏色呈淡黃色；當(dāng)慶大霉素質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，對(duì)小球藻的致死率達(dá)到91.04%；在50 μg/mL的固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d僅僅有少許幾個(gè)藻落長(zhǎng)出，并且這幾個(gè)藻落顏色呈土黃色，藻落如同針尖，生長(zhǎng)非常緩慢。表明埃氏小球藻對(duì)慶大霉素比較敏感。

2.7 埃氏小球藻對(duì)卡那霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

目前，卡那霉素抗性基因在遺傳轉(zhuǎn)化體系中應(yīng)用非常廣泛，是一種常見的選擇性標(biāo)記基因[18-20]，主要是通過(guò)干擾蛋白質(zhì)的合成抑制葉綠體的正常功能來(lái)殺死植物細(xì)胞。雒淑珍等[21]用卡那霉素作為選擇性標(biāo)記獲得了具有良好性狀的野罌粟轉(zhuǎn)基因植株。臧曉南等[15]研究卡那霉素對(duì)Spiulina351生長(zhǎng)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL即可對(duì)其生長(zhǎng)造成明顯的影響，主要表現(xiàn)為微藻生長(zhǎng)緩慢，藻體顏色變黃下沉。王長(zhǎng)海等[14]以海水小球藻為材料進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在卡那霉素高達(dá)500 μg/mL時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)小球藻時(shí)其依然表現(xiàn)出良好的長(zhǎng)勢(shì)。由圖10可知，淡水小球藻對(duì)卡那非常敏感，在50 μg/mL的固體平板上培養(yǎng)30 d長(zhǎng)出的藻落數(shù)目約占對(duì)照數(shù)目的0.1%，這與相關(guān)報(bào)道有較大的差別，可能是由海水與淡水離子濃度種類的差異性所造成的，離子的不同造成了抗生素表達(dá)活性的差異。

2.8 埃氏小球藻對(duì)鏈霉素敏感性固體試驗(yàn)結(jié)果

Str是鏈霉素的標(biāo)記性基因，它在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用比較廣泛，其主要作用原理是通過(guò)無(wú)功能蛋白質(zhì)的合成或失去合成蛋白的功能，致使細(xì)胞膜破裂，內(nèi)溶物流出，細(xì)胞大量死亡。黃健等[8]研究表明，在其選取的5種抗生素中，亞心形扁藻對(duì)鏈霉素最不敏感，隨抗生素濃度的提高其相對(duì)增長(zhǎng)率變化不明顯。耿德貴等[9]關(guān)于微藻對(duì)抗生素敏感性的研究表明，鹽藻在較高的鏈霉素濃度下經(jīng)過(guò)超過(guò)20 d的培養(yǎng)仍能健康地生長(zhǎng)，并表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)。王長(zhǎng)海等[14]研究表明，小球藻不但對(duì)鏈霉素不敏感，而且在一定的濃度范圍內(nèi)還會(huì)起到一定的促進(jìn)作用。從圖11可以看出，小球藻對(duì)鏈霉素比較敏感，鏈霉素對(duì)小球藻的生長(zhǎng)影響較大，30 μg/mL時(shí)小球藻的致死率達(dá)到了93.45%，基本上抑制了小球藻的生長(zhǎng)；在50 μg/mL的質(zhì)量濃度下培養(yǎng)30 d，平板上長(zhǎng)出的藻落數(shù)目不到對(duì)照組的0.02%，說(shuō)明其嚴(yán)重抑制了埃氏小球藻的生長(zhǎng)。這與其他相關(guān)報(bào)道的結(jié)果相差較大，可能是這株小球藻在培養(yǎng)過(guò)程中，由于某些特殊的原因其生理性狀發(fā)生了改變，或者是因?yàn)榭股卦谝欢ǖ碾x子濃度下才起作用，本試驗(yàn)培養(yǎng)基所用水屬于硬水，鈣離子含量很高，可能影響了抗生素的某些特性，使小球藻對(duì)鏈霉素敏感性增加。

2.9 7種抗生素致死劑量的確定

在微藻的正常培養(yǎng)中，小球藻細(xì)胞壁上極易吸附細(xì)菌，這些細(xì)菌與小球藻形成共生體系，不易除去[22]。雜菌的大量繁殖會(huì)造成大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，進(jìn)而影響微藻的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)試微藻培養(yǎng)體系中埃氏小球藻藻體對(duì)抗生素的敏感性發(fā)現(xiàn)，氨芐、羧卞、頭孢、硫酸新霉素這4種抗生素在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)埃氏小球藻的生長(zhǎng)沒有影響，而細(xì)菌對(duì)抗生素卻比較敏感，因此，可以根據(jù)埃氏小球藻藻體和細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性的差異，選取這些抗生素清除微藻培養(yǎng)過(guò)程中雜菌，以求建立埃氏小球藻無(wú)菌培養(yǎng)體系，并對(duì)該體系中埃氏小球藻生長(zhǎng)環(huán)境條件進(jìn)行優(yōu)化。

雖然小球藻已經(jīng)可以大規(guī)模地培養(yǎng)，但是要真正達(dá)到工業(yè)要求的標(biāo)準(zhǔn)還需要進(jìn)一步進(jìn)行藻種的改良。改良藻種常用的方法是基因工程和誘變，這2種方法都存在目標(biāo)藻株篩選困難的情況，前人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，抗生素在突變株的初篩和目標(biāo)藻株的篩選方面具有良好的效果。本試驗(yàn)研究了對(duì)埃氏小球藻比較敏感的7種抗生素（表4）以便在埃氏小球藻的育種篩選工作中更好地選擇所需要的抗生素，從而為后續(xù)的試驗(yàn)提供參考。

表4 7種抗生素致死濃度分析

3 結(jié)論與討論

抗生素（antibiotics）是由微生物（包括細(xì)菌、真菌、放線菌屬）或高等動(dòng)植物在生活過(guò)程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，能干擾其他生活細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)。

在遺傳轉(zhuǎn)化體系中，外源基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，會(huì)使新的菌株帶有某種特殊的性質(zhì)，即抗生素陽(yáng)性選擇性標(biāo)記，可為大規(guī)模的藻種鑒定提供強(qiáng)有力的幫助。建立一個(gè)完整的轉(zhuǎn)化體系，首先需要選擇一個(gè)合適的陽(yáng)性篩選標(biāo)記，它可以在后續(xù)的轉(zhuǎn)基因藻株的篩選工作中起到非常重要的作用，使篩選更加快速、高效。本試驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，埃氏小球藻對(duì)氯霉素、紅霉素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、潮霉素等6種抗生素非常的敏感，并且這6種抗生素的標(biāo)記基因已經(jīng)被廣泛研究和應(yīng)用；潮霉素、氯霉素、卡那霉素在高等植物和藻類的遺傳轉(zhuǎn)化體系中已廣泛使用，并取得了一些良好的效果；鏈霉素、紅霉素在基因工程中應(yīng)用較少，特別是紅霉素相關(guān)的報(bào)道幾乎沒有，本試驗(yàn)研究結(jié)果可為遺傳轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性篩選標(biāo)記提供技術(shù)參考。

誘變是改良藻種的另一種常用的方法，因?yàn)槠湓诙虝r(shí)間內(nèi)就可能產(chǎn)生一個(gè)巨大的突變庫(kù)，但是誘變產(chǎn)生的不定向突變體的初篩，工作量十分龐大。選取合適的抗生素作為初篩試劑，可大大減少篩選工作量，提高篩選效率。抗生素抗性篩選是基于微生物對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性發(fā)展起來(lái)的菌株選育改良技術(shù)，實(shí)踐證明，操作簡(jiǎn)單，效果明顯，在微生物藥物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[23]。微生物的某些抗生素抗性突變會(huì)直接影響其次生產(chǎn)物的代謝調(diào)控系統(tǒng)[24]，從而改變突變株代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)水平和能力，因此，抗性篩選可用于有用產(chǎn)物生產(chǎn)優(yōu)良菌株的選育和改良，在微生物藥物領(lǐng)域抗生素抗性篩選技術(shù)原本主要用來(lái)篩選獲取高產(chǎn)菌株[25]，但近來(lái)發(fā)現(xiàn)，微生物的抗生素抗性突變還可賦予突變株新生次級(jí)產(chǎn)物的代謝生產(chǎn)能力。由于微藻和微生物具有相似的繁殖方式及代謝機(jī)制，所以，可以利用誘變和抗生素篩選相結(jié)合的方法，對(duì)微藻突變株進(jìn)行篩選。關(guān)于抗生素抗性篩選提高產(chǎn)能的生物學(xué)機(jī)制的研究在鏈霉素和利福平霉素抗性突變株的篩選中具有良好的效果[26]。

抗生素通過(guò)不同的作用機(jī)理可以抑制或殺死細(xì)菌、真菌等不同的病原微生物，因此，可作為一種建立微藻無(wú)菌體系的試劑。倘若某種抗生素對(duì)微藻的生長(zhǎng)沒有影響，同時(shí)又具有良好的除菌效果，那么它將成為建立無(wú)菌體系的最佳途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，氨芐霉素、羧卞霉素、頭孢霉素、硫酸新霉素等4種抗生素在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)不影響小球藻的生長(zhǎng)。因此，可將其用于建立埃氏小球藻的無(wú)菌體系，考慮到病原菌的耐藥性及更佳的除菌效果，可將幾種抗生素混合使用，以達(dá)到最佳的使用效果。

研究抗生素對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響，在微藻的藻種改良及培養(yǎng)工作中都具有非常重要的作用，可為獲得適合微藻規(guī)模化培養(yǎng)并聯(lián)產(chǎn)微藻燃油的工業(yè)藻株提供參考。

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Study on the Sensitivity of Chlorella emersonii to Eleven Kinds of Antibiotics

WANGYajun，ZHOUGuanghang，JI Chunli，XUE Jin'ai，LI Runzhi

（Institute ofMolecular Agriculture and Bioenergy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To investigate the sensitivity of strain SXND-12（Chlorella emersonii）to 11 antibiotics,the study was conducted by spectrophotometry to evaluate the effects of 11 antibiotics（chloramphenicol,hygromycin,erythromycin,rifampicin,kanamycin,neomycin sulfate,cephalosporins,daqingmycin,ampicillin,carboxomycin and streptomycin etc.）on growth of Chlorella emersonii to determine concentration of antibiotics in isolation and purification of algae,which was harmless to algal cells and could inhibit the growth of associated bacteria.The results showed that Chlorella emersonii was less sensitive to cephalosporin,ampicillin,carboxymycin and neomycin sulfate,was more sensitive to rifampicin（concentration of 200 μg/mL（lethal dose）as well as 0.243 mmol/mL（lethal concentration）in the solid culture which could inhibit the growth of Chlorella emersonii,and was very sensitive to hygromycin, chloramphenicol,erythromycin,streptomycin,daqingmycin,kanamycin（lethal concentration in the solid culture reached 20 μg/mL（0.101 mmol/mL）,50 μg/mL（0.155 mmol/mL）,30 μg/mL（0.041 mmol/mL）,50 μg/mL（0.086 mmol/mL）,50 μg/mL（0.105 mmol/mL）, 100 μg/mL（0.206 mmol/mL,respectively）.This study laid a foundation for screening reagents for chlorella genetic engineering, mutagenesis screening early screening reagents,and establish a selection reagent for sterile systems.

Chlorella emersonii;antibiotics;sensitivity;growth inhibition

S949.93

A

1002-2481（2017）03-0379-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.15

2016-12-06

國(guó)家“948”項(xiàng)目（2014-Z39）；山西省煤基重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（FT-2014-01）

王亞君（1990-），女，山西忻州人，在讀碩士，研究方向：生物固碳與生物質(zhì)綜合利用。李潤(rùn)植為通信作者。