羅 偉，朱小年，譚盛葵,

·論 著·

胰腺癌中PcG相關(guān)蛋白R(shí)YBP的表達(dá)及臨床意義

羅 偉1，朱小年2，譚盛葵1,2

目的 探討PcG相關(guān)蛋白R(shí)YBP在胰腺癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測(cè)51例胰腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中RYBP的表達(dá)，分析其表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系。Kaplan-Meier法分析RYBP表達(dá)與胰腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果 RYBP在胰腺癌中的陽(yáng)性率(31.4%，16/51)明顯低于癌旁組織(66.7%，34/51)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RYBP表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤數(shù)目、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血清CA199水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤直徑及腫瘤病理分級(jí)有相關(guān)性(P<0.05)。Kaplan-Meier法分析顯示RYBP陽(yáng)性組患者的總生存率明顯高于陰性組(P<0.05)。結(jié)論 PcG相關(guān)蛋白R(shí)YBP在胰腺癌中低表達(dá)，RYBP表達(dá)降低可能與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

胰腺腫瘤；RYBP；細(xì)胞凋亡

PcG蛋白是一類在轉(zhuǎn)錄過(guò)程發(fā)揮表觀遺傳調(diào)控作用的蛋白，廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化以及腫瘤發(fā)生等重要過(guò)程。RYBP作為PcG蛋白家族成員，參與多梳蛋白抑制復(fù)合物(PRC1)的組成，在個(gè)體發(fā)育、抑制基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡以及調(diào)控表觀遺傳等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。近年研究表明，RYBP與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前有關(guān)RYBP與胰腺癌的關(guān)系尚未見報(bào)道，本文應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為尋找胰腺癌早期診斷及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物及分子靶向治療的有效靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2007～2013年存檔的配對(duì)胰腺癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本51例，臨床和病理診斷均為胰腺癌，選取的癌旁組織距癌灶距離>2 cm。所有患者均在本院行手術(shù)治療，術(shù)前均未行放、化療，且有完整的臨床資料。所有標(biāo)本獲取均征得患者及家屬同意，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化 將收集的蠟塊4 μm厚切片，采用免疫組化SP兩步法檢測(cè)RYBP的表達(dá)，具體步驟如下：切片經(jīng)60 ℃烤片1 h后經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，置于EDTA緩沖液(pH 8.0)中高壓加熱抗原修復(fù)3 min，浸泡于3%過(guò)氧化氫溶液15 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶，馬血清室溫封閉30 min，滴加RYBP一抗(購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司，工作濃度1 ∶100)，37 ℃溫箱孵育1 h，加二抗酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物(購(gòu)自福州邁新公司)，37 ℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，鏡下觀察3～5 min至顯色合適為止。蘇木精復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，最后脫水、透明、固定。

1.3 結(jié)果判定 在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占細(xì)胞總數(shù)百分比，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)按染色強(qiáng)度記分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比記分：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。最后將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：總分≤4分為陰性，>4分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。臨床病理特征與RYBP表達(dá)的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法、單因素及多因素Cox回歸分析，組間生存曲線采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá) RYBP在胰腺癌組織中呈陰性；癌旁組織中呈陽(yáng)性，陽(yáng)性部位主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖1)。RYBP在胰腺癌中表達(dá)明顯低于癌旁組織。RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的陽(yáng)性率分別為31.4%(16/51)和66.7%(34/51)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.925，P<0.05，表1)。

圖1 RYBP在胰腺癌癌旁組織中呈陽(yáng)性，SP兩步法

表1 RYBP在胰腺癌和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 RYBP表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系 胰腺癌組織中RYBP表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、飲酒、腫瘤數(shù)目、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血清CA199水平無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，與腫瘤直徑及腫瘤病理分級(jí)有相關(guān)性(P<0.05，表2)。

2.3 RYBP表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系 對(duì)51例獲得隨訪資料的胰腺癌患者采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示：RYBP蛋白高表達(dá)組患者的總生存率明顯高于低表達(dá)組，用Log-rank進(jìn)行組間生存率檢驗(yàn)結(jié)果顯示：RYBP蛋白低表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)(χ2=6.907，P=0.008 6，圖2)。經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，單因素及多因素分析均顯示RYBP蛋白表達(dá)、病理分級(jí)與患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05，表3)，說(shuō)明RYBP表達(dá)是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=0.410，95%CI：0.170～0.986，P=0.046)，病理分級(jí)也是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=3.697，95%CI：1.384～9.879，P=0.009)。

3 討論

表2 RYBP表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Kaplan-Meier法分析RYBP表達(dá)對(duì)胰腺癌患者術(shù)后生存時(shí)間的影響

隨著發(fā)病率和病死率的逐年增加，癌癥已經(jīng)成為困擾全球的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題[3-4]。胰腺癌作為我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為癌癥相關(guān)死亡前10位的腫瘤。胰腺癌因其早期確診率不高，發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于中晚期，預(yù)后極差，全球范圍內(nèi)胰腺癌病死率高居第4位[5]，因此尋找新的胰腺癌早期診斷、靶向治療以及判斷預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物迫在眉睫。

表3 胰腺癌預(yù)后Cox模型分析

PcG相關(guān)蛋白R(shí)YBP是最早于1999年利用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠中篩選而出，由228個(gè)氨基酸殘基組成的一個(gè)具有鋅指結(jié)構(gòu)域的堿性蛋白質(zhì)[6]。人類RYBP蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，在淋巴組織和胎盤內(nèi)表達(dá)較高。天然狀態(tài)下，RYBP處于非折疊狀態(tài)，當(dāng)與蛋白質(zhì)或DNA相互作用時(shí)，其構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)折疊[7]。RYBP還是經(jīng)典的泛素結(jié)合蛋白，其自身被單泛素化，在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中廣泛表達(dá)[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)RYBP與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。RYBP在腫瘤中的表達(dá)高低存在差異。有研究表明RYBP在肝癌、肺癌、子宮頸癌、前列腺癌等組織中低表達(dá)并與患者預(yù)后不良相關(guān)[9-13]。在肝癌組織中RYBP表達(dá)明顯低于癌旁組織，并可作為肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。在非小細(xì)胞肺癌組織中RYBP蛋白及mRNA水平明顯降低，且與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，過(guò)表達(dá)RYBP可抑制細(xì)胞存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，相反敲低RYBP的表達(dá)后這些現(xiàn)象發(fā)生逆轉(zhuǎn)[11]。子宮頸癌中RYBP表達(dá)降低與患者放、化療后存活率降低密切相關(guān)。Sanchez-Beato等[14]發(fā)現(xiàn)RYBP在部分腫瘤中表達(dá)升高，主要表現(xiàn)在垂體腺瘤、霍奇金淋巴瘤、T細(xì)胞淋巴瘤和少突膠質(zhì)瘤。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察胰腺癌及癌旁組織中RYBP的表達(dá)，進(jìn)一步明確其在腫瘤組織中的表達(dá)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：51例胰腺癌組織中RYBP陽(yáng)性率僅為31.4%(16/51)，癌旁組織中RYBP陽(yáng)性率高達(dá)66.7%(34/51)，組間比較差異有顯著性(P<0.05)，支持RYBP在胰腺癌中低表達(dá)的結(jié)論。

增殖、凋亡是正常及腫瘤細(xì)胞重要的生物學(xué)行為，RYBP可與細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)多種蛋白相互作用，調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡。當(dāng)前RYBP介導(dǎo)的凋亡已成為研究熱點(diǎn)。酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)RYBP可與凋亡蛋白(apoptin)相互作用，凋亡蛋白突變導(dǎo)致其與RYBP結(jié)合減少，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)間延遲，提示RYBP可通過(guò)凋亡蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡[15]。RYBP可與細(xì)胞質(zhì)中的FADD、Caspase 8/10前體及細(xì)胞核中的DEDD相互作用，也可在細(xì)胞膜上通過(guò)增強(qiáng)CD95-FADD-Caspase 8復(fù)合體的形成，促進(jìn)死亡受體和DEDD介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。最近Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，RYBP表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者腫瘤病理分級(jí)及腫瘤直徑相關(guān)，同時(shí)在體外肝癌細(xì)胞株中過(guò)表達(dá)RYBP后肝癌細(xì)胞侵襲能力和凋亡增加，相反在用siRNA干擾RYBP的表達(dá)后該現(xiàn)象又發(fā)生逆轉(zhuǎn)，說(shuō)明RYBP調(diào)控的細(xì)胞凋亡與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密不可分。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RYBP蛋白表達(dá)在不同腫瘤直徑、病理分級(jí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明RYBP蛋白表達(dá)與胰腺癌腫瘤直徑及病理分級(jí)具有相關(guān)性，提示RYBP介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能在胰腺癌中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，RYBP蛋白低表達(dá)與一些腫瘤患者的預(yù)后不良和(或)低生存率呈正相關(guān)[9-13]，這與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本組實(shí)驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)期隨訪，進(jìn)一步探討RYBP蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的遠(yuǎn)期生存率之間的關(guān)系。隨訪資料經(jīng)Kaplan-Meier分析、單因素Cox回歸及多因素Cox回歸分析均顯示RYBP蛋白表達(dá)與胰腺癌的預(yù)后有關(guān)，RYBP蛋白低表達(dá)提示患者預(yù)后差，因此RYBP蛋白表達(dá)可作為判斷胰腺癌預(yù)后的指標(biāo)之一。另外，單因素及多因素Cox回歸分析顯示病理分級(jí)與胰腺癌預(yù)后相關(guān)，說(shuō)明病理分級(jí)是影響胰腺癌預(yù)后的重要因素。

綜上，RYBP與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)，RYBP能否成為新的腫瘤標(biāo)志物和分子靶向治療的有效靶點(diǎn)，值得更進(jìn)一步探討證實(shí)。

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Expression of PcG related protein RYBP in pancreatic carcinoma and its clinical significance

LUO Wei1, ZHU Xiao-nian2, TAN Sheng-kui1,2

(1DepartmentofHepatobiliarySurgery,theAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China;2SchoolofPublicHealth,GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China)

Purpose To investigate the expression and clinical significance of RINGI and YYI binding protein (RYBP) in pancreatic carcinoma (PC). Methods RYBP expression was detected in 51 cases of PC tissues and paired adjacent non-tumor tissues by immunohistochemistry. The correlation between RYBP expression and the survival time of PC patients after surgery was analyzed by Kaplan-Meier method. Results Compared to the expression in adjacent non-tumor tissues, RYBP was significantly lower expressed in PC tissues (P<0.05). In addition, RYBP expression had a significant correlation with tumor diameter and tumor staging of patients (P<0.05), but no significant correlation with other characteristics of patients, such as gender, age, smoking, alcohol intake, tumor number, metastasis or CA199 level (P>0.05). The survival analysis showed that the survival time of PC patients with positive expression of RYBP was significantly longer than patients with negative expression of RYBP (P<0.05). Conclusion RYBP is significantly lower expressed in PC tissues, which might be involved in the pathogenesis of PC.

pancreatic neoplasms; RYBP; cell apoptosis

時(shí)間：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1014.006.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460515)

1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，桂林 5410002桂林醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，桂林 541000

羅 偉，男，碩士研究生。E-mail: luoweidoctor@163.com 譚盛葵，男，教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: sktan2008@sina.cn

R 735.9

A

1001-7399(2017)02-0125-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.002

接受日期：2016-12-16