黨中峰，何科基，那光瑋，孫文平，程永生，王維君，李 瑞

甘肅省腫瘤醫(yī)院腹外二科，甘肅 蘭州 730050

靶向肝癌細(xì)胞自噬提高大黃素的毒性殺傷作用

黨中峰，何科基，那光瑋，孫文平，程永生，王維君，李 瑞

甘肅省腫瘤醫(yī)院腹外二科，甘肅 蘭州 730050

背景與目的：大黃素處理肝癌細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬之間的關(guān)聯(lián)及后者作為細(xì)胞對抗應(yīng)激環(huán)境的一種自我防御機(jī)制，該研究擬探討通過抑制肝癌細(xì)胞自噬信號(hào)通路的策略提高大黃素對腫瘤細(xì)胞的毒性殺傷作用。方法：大黃素處理肝癌細(xì)胞后，應(yīng)用CYTO-ID自噬檢測試劑盒和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分別檢測大黃素誘發(fā)細(xì)胞自噬情況；利用細(xì)胞自噬抑制劑(氯喹)預(yù)先抑制肝癌細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，然后用大黃素處理肝癌細(xì)胞，最后通過ATPlite試驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞存活；通過流式細(xì)胞術(shù)檢測氯喹和大黃素聯(lián)合處理誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的凋亡率，采用Western blot檢測凋亡效應(yīng)蛋白caspase-3活化斷裂后產(chǎn)生活性片段的水平。結(jié)果：大黃素處理肝癌細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬；利用氯喹抑制肝癌細(xì)胞自噬能夠顯著能夠提高大黃素對肝癌細(xì)胞克隆存活的抑制作用；氯喹和大黃素聯(lián)合處理肝癌細(xì)胞能夠顯著提高細(xì)胞周期sub-G1期和活化caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：靶向肝癌細(xì)胞自噬能夠提高大黃素的毒性殺傷作用。

大黃素；細(xì)胞自噬；肝癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

肝癌是我國多發(fā)的一種惡性消化系統(tǒng)腫瘤。因其惡性程度高、病程進(jìn)展快，患者確診后往往已喪失手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。由于肝癌對常規(guī)化療藥物及靶向藥物不敏感，同時(shí)容易產(chǎn)生耐藥性，目前可供臨床肝細(xì)胞癌治療用的藥物極其有限。中草藥因其廣譜的抗腫瘤效果及低毒特點(diǎn)，近年來逐漸受到國際關(guān)注。其中，來源于中藥大黃的大黃素單體化合物已在臨床前模型層面被證實(shí)具有一定的抗肝癌治療效果，成為抗肝癌藥物研究領(lǐng)域的新嘗試［1］。為了進(jìn)一步提高大黃素的抗肝癌治療效果，本研究擬從聯(lián)合用藥的角度探尋提高大黃素臨床療效的潛在策略。

細(xì)胞自噬是哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過其溶酶體自我消化的一個(gè)代謝過程，通常被認(rèn)為是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏或其他外界應(yīng)激條件下誘發(fā)的一個(gè)自我保護(hù)機(jī)制［2］。迄今，細(xì)胞自噬通路已被證實(shí)是多種惡性腫瘤的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，大量研究發(fā)現(xiàn)，通過靶向細(xì)胞自噬通路也可以顯著提高其他抗腫瘤藥物的治療效果［3］。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)大黃素處理肝癌細(xì)胞后能夠誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡［4］。鑒于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞自噬之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)［5］，我們推測大黃素處理肝癌細(xì)胞后能夠激活細(xì)胞自噬通路，后者作為細(xì)胞對抗應(yīng)激環(huán)境的重要機(jī)制，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活?；诖?，本研究擬通過一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶向肝癌細(xì)胞自噬信號(hào)通路提高大黃素對腫瘤細(xì)胞的毒性殺傷效果。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

大黃素購自中國藥品生物制品檢定所，純度大于98%；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自美國Corning公司；CYTO-ID自噬檢測試劑盒購自美國Enzo Life Sciences公司；氯喹購自美國Selleck Chemicals公司；碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液購自美國Yeasen公司；Cleavedcaspase3、β-actin抗體購自美國Cell signaling公司；抗LC3A/B抗體購自美國Abcam公司；細(xì)胞存活率ATPlite檢測試劑盒購自美國PerkinElmer公司。

人肝癌HepG2和Huh7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。兩種細(xì)胞均用含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞自噬的檢測

細(xì)胞自噬用CYTO-ID自噬檢測試劑盒進(jìn)行檢測，具體實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行，其步驟如下：當(dāng)細(xì)胞長到50%～70%匯合度后，棄上清液，直接添加CYTO-ID自噬檢測染料和細(xì)胞核染料Hoechst 33342，然后在37 ℃條件下活染20 min，最后在熒光顯微鏡下觀察并拍照；同時(shí)通過蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ的表達(dá)。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

采用適當(dāng)藥物處理生長狀態(tài)良好的腫瘤細(xì)胞后，接種于96孔培養(yǎng)板(每孔2 000個(gè)細(xì)胞)上，然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，最后按照產(chǎn)品使用說明書使用ATPlite試劑盒檢測細(xì)胞的存活率。

1.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

將處于生長對數(shù)期的人肝癌HepG2、Huh7細(xì)胞分別接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種400個(gè)細(xì)胞。第2天在培養(yǎng)皿中添加氯喹、大黃素或兩者聯(lián)合處理，陰性對照用0.1% DMSO處理。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d后用含有0.1%結(jié)晶紫的染色液進(jìn)行固定與染色。按含有50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞克隆為陽性克隆，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞克隆形成情況。

1.6 流式細(xì)胞儀分析

根據(jù)以上均值方程的殘差平方序列偏相關(guān)函數(shù)(表3)，ARCH-LM檢驗(yàn)滯后期選擇10期。根據(jù)以上ARCH-LM檢驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)量和卡方統(tǒng)計(jì)量的伴隨概率均小于0.05，因此ARCH-LM檢驗(yàn)表明收益率序列存在ARCH效應(yīng)，也就是存在自回歸條件異方差特性。[4]

用濃度為0.025%的胰酶充分消化細(xì)胞，以300×g的速度離心5 min收集細(xì)胞；用PBS(pH為7.4)清洗細(xì)胞后用70%乙醇進(jìn)行固定，置冰上放置30 min以上；用適量PBS(pH為7.4)清洗后，按照使用說明書添加適量PI染色液，輕柔混勻，置室溫避光溫育15 min后，供流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.7 Western blot檢測

腫瘤細(xì)胞經(jīng)過藥物處理后，用細(xì)胞刮子直接刮下細(xì)胞，300 ×g離心5 min后收集細(xì)胞沉淀；添加適量RIPA裂解液(含50 mmol/L Tris pH為7.4，150 mmol/L氯化鈉，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS)進(jìn)行重懸，置冰上放置15 min；在4 ℃條件下18 000×g離心10 min，收集上清液并用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白樣品的濃度。蛋白樣本經(jīng)煮沸變性后供SDS-PAGE分離；電泳完畢后將蛋白通過半干法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，先后經(jīng)過膜封閉、一抗和二抗結(jié)合等實(shí)驗(yàn)步驟后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用Graph pad 5.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大黃素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬

本研究的前期工作證實(shí)，大黃素抑制肝癌細(xì)胞的效果呈劑量依賴性。其中大黃素在濃度為100 μmol/L的條件下處理細(xì)胞48 h，能夠抑制大約30%腫瘤細(xì)胞的增殖［4］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)預(yù)先用大黃素(100 μmol/L)處理肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2，然后檢測細(xì)胞自噬情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大黃素處理細(xì)胞后24 h，不但能夠誘發(fā)大量自噬泡的產(chǎn)生(圖1B)，而且可以提高細(xì)胞自噬標(biāo)記蛋白LC3-II的表達(dá)(圖1C)，表明該化合物能夠顯著誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬。盡管克隆形成試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃素(100 μmol/L)處理細(xì)胞24 h僅能夠抑制部分腫瘤細(xì)胞的克隆存活(圖1D)，但鑒于細(xì)胞自噬是細(xì)胞抵抗外界應(yīng)激環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制，我們推測肝癌細(xì)胞自噬參與抑制大黃素所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞毒性效應(yīng)。因此，抑制腫瘤細(xì)胞自噬可能有助于促進(jìn)大黃素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

2.2 抑制自噬通路提高大黃素對肝癌細(xì)胞克隆存活的抑制作用

為了驗(yàn)證靶向細(xì)胞自噬對大黃素抑制肝癌細(xì)胞生長的效果，我們首先利用氯喹預(yù)先抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生，然后用大黃素處理肝癌細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用氯喹(10 μmol/L)阻斷腫瘤細(xì)胞自噬通路后(圖2A)，大黃素能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖(圖2B)及克隆存活(圖2C)，提示自噬通路可以作為提高大黃素抗肝癌治療效果的潛在增效靶點(diǎn)。

圖 1 大黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬Fig. 1 Emodin induced autophagy in liver cancer cells

2.3 抑制自噬顯著促進(jìn)大黃素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡

在前期工作中，我們證實(shí)了大黃素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡［2］。鑒于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯喹和大黃素聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的存活，我們擬進(jìn)一步評價(jià)氯喹和大黃素聯(lián)合作用對肝癌細(xì)胞凋亡的影響。首先通過流式細(xì)胞儀分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)氯喹和大黃素聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞能夠顯著提高細(xì)胞周期的sub-G1期，提示兩者聯(lián)合作用后可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(圖3A)。為驗(yàn)證以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們通過Western blot檢測細(xì)胞cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氯喹和大黃素聯(lián)合處理腫瘤細(xì)胞后能夠顯著提高cleaved-caspase3蛋白水平(圖3B)，從而表明以上兩種藥物聯(lián)合作用能夠顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖 2 抑制細(xì)胞自噬提高大黃素對肝癌細(xì)胞的抑制作用Fig. 2 Inhibition of autophagy enhanced the inhibitory effect of emodin on liver cancer cells

圖 3 抑制細(xì)胞自噬顯著促進(jìn)大黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡Fig. 3 Blockage of autophagy significantly promoted emodin-induced apoptosis in liver cancer cells

3 討 論

在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)大黃素能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［4］。但值得關(guān)注的是，大量研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠通過錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路誘發(fā)細(xì)胞自噬。后者作為哺乳細(xì)胞抵抗細(xì)胞內(nèi)外不良環(huán)境的生理反應(yīng)，已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制密切相關(guān)［3］。為了探索細(xì)胞自噬與大黃素的抑瘤效應(yīng)之間的潛在關(guān)聯(lián)，本研究以肝癌細(xì)胞株為研究模型，首先確認(rèn)大黃素處理肝癌細(xì)胞后能夠顯著刺激肝癌細(xì)胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。基于這一實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們后續(xù)進(jìn)一步證實(shí)通過氯喹抑制肝癌細(xì)胞自噬后能夠顯著促進(jìn)大黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

事實(shí)上，大量研究已證實(shí)通過抑制細(xì)胞自噬能夠提高多種類型腫瘤對化療藥物的敏感性，其涉及機(jī)制多樣、復(fù)雜［6-7］。雖然本研究從細(xì)胞水平證實(shí)了靶向細(xì)胞自噬也能夠提高大黃素對肝癌細(xì)胞的抑制作用，同時(shí)這種抑制效應(yīng)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，但對其中的作用分子機(jī)制及動(dòng)物模型層面的評估尚未進(jìn)一步研究。這將是本項(xiàng)目今后需要解決的重要問題。本研究探索通過靶向細(xì)胞自噬提高大黃素抑制肝癌細(xì)胞生長效果的潛在治療策略將具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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［2］ WHITE E. The role for autophagy in cancer［J］. J Clin Invest, 2015, 125(1): 42-46.

［3］ YANG Z J, CHEE C E, HUANG S, et al. The role of autophagy in cancer: therapeutic implications［J］. Mol Cancer Ther, 2011, 10(9): 1533-1541.

［4］ 黨中峰, 黨雅梅, 陳 城, 等. 大黃素誘導(dǎo)對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)及肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響［J］. 蘭州大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2015, 41(2): 50-54.

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Therapeutically targeting autophagy enhances cytotoxicity of emodin in liver cancer cell lines

DANG Zhongfeng, HE Keji, NA Guangwei, SUN Wenping, CHENG Yongsheng, WANG Weijun, LI Rui (Second Department of Abdominal Surgery, Gansu Provincial Tumor Hospital, Lanzhou 730050, Gansu Province, China)

HE Keji E-mail: 13893265154@163.com

Background and purpose: The previous work of this study has showed that the treatment of liver cancer cells with emodin could induce endoplasmic reticulum (ER) stress and apoptosis. Given the cross-talk between ER stress and autophagy, this study aimed to investigate whether blockage of autophagy, a defense mechanism against environmental stress, could improve the killing effect of emodin on liver cancer cells. Methods: The CYTO-ID autophagy detection kit and Western blot were used to determine autophagy in liver cancer cells. After combined treatment with chloroquine (CQ) and emodin, cancer cell survival was analyzed by ATPlite assay and clonogenic assay. Apoptosis was detected by both flow cytometry analysis and Western blot. Results: Autophagy could be induced in liver cancer cells after treatment with emodin. Inhibition of autophagy significantly increased growth-inhibitory effect of emodin on both HepG2 and Huh7 cancer cells. The combination treatment with CQ and emodin promoted remarkable apoptosis in liver cancer cells, evidenced by the increase in the percentage of cells in sub-G1phase and the higher expression lever of cleaved caspase-3. Conclusion: Therapeutically targeting autophagy is capable of enhancing cytotoxicity of emodin in liver cancer cell lines.

Emodin; Autophagy; Liver cancer cells; Apoptosis

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.004

R735.7

A

1007-3639(2017)03-0186-05

2016-09-30

2016-12-10）

甘肅省中醫(yī)藥管理局基金項(xiàng)目(GZK-2014-71)。

何科基 E-mail: 13893265154@163.com