張 杰，鄭 慧，盧仁泉，郭 林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

不同HER-2表達(dá)水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

張 杰，鄭 慧，盧仁泉，郭 林

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)屬于受體酪氨酸激酶中的生長(zhǎng)因子受體家族，其表達(dá)差異在乳腺癌靶向藥物的臨床使用中起決定作用。該研究旨在篩選出HER-2不同表達(dá)水平的乳腺癌細(xì)胞株，研究HER-2表達(dá)差異對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法：對(duì)乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3進(jìn)行克隆純化，利用德國(guó)西門(mén)子公司ADVIA Centuar CP系統(tǒng)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可溶性HER-2(soluble HER-2, sHER-2)的表達(dá)水平，篩選出sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株(大于50.0 ng/mL)、中表達(dá)細(xì)胞株(15.8～50.0 ng/mL)及低表達(dá)細(xì)胞株(小于15.8 ng/mL)。通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)觀察以上3種乳腺癌細(xì)胞株的形態(tài)學(xué)變化，并通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括克隆形成實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell檢測(cè)等。結(jié)果：與正常乳腺上皮細(xì)胞相比，乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3表達(dá)的sHER-2水平明顯增高。其中，sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的克隆形成率為(51.3±3.4)%，明顯高于中表達(dá)細(xì)胞株［(42.0±3.7)%］和低表達(dá)細(xì)胞株［(26.7±2.9)%］；sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的遷移率為(50.0%±0.6)%，明顯高于sHER-2中表達(dá)細(xì)胞株［(19.5±3.4)%］和sHER-2低表達(dá)細(xì)胞株［(13.6±1.0)%］；sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的侵襲能力為(53.5±4.2)%也明顯比sHER-2中表達(dá)細(xì)胞株［(33.2±3.9)%］和低表達(dá)細(xì)胞株［(28.9±5.4)%］細(xì)胞株強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論：乳腺癌sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株具有促增殖、促細(xì)胞動(dòng)力等生物學(xué)效應(yīng)，因此能為臨床合理使用乳腺癌靶向藥物提供參考依據(jù)。

乳腺癌；可溶性人表皮生長(zhǎng)因子受體-2；細(xì)胞侵襲；增殖；遷移

乳腺癌是危害女性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤，且其死亡率呈明顯上升趨勢(shì)。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)是一種與細(xì)胞的增殖和分化有關(guān)的上皮生長(zhǎng)因子受體，在多種正常組織中低表達(dá)。前期研究證實(shí)，有25%～30%的乳腺癌患者HER-2基因高表達(dá)［1］。還有研究表明18%～20%乳腺癌患者體內(nèi)血清可溶性HER-2(soluble HER-2，sHER-2)過(guò)高表達(dá)與乳腺癌患者的預(yù)后復(fù)發(fā)及治療方案均有關(guān)系，提示預(yù)后差，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平的檢測(cè)已作為一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)用于對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的判斷［2］。本研究通過(guò)建立不同sHER-2表達(dá)水平的乳腺癌細(xì)胞株，并且對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，不但可以為研究sHER-2過(guò)表達(dá)與乳腺癌治療方面相關(guān)性提供理想的細(xì)胞模型，而且還能為乳腺癌個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。目前HER-2基因及蛋白表達(dá)的研究主要采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和ADVIA Centaur檢測(cè)等。本研究利用FISH與ADVIA Centaur檢測(cè)的方法進(jìn)行分析、探討。

1 材料和方法

1.1 材料

人乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3來(lái)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)，正常人乳腺上皮細(xì)胞由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺癌研究中心惠贈(zèng)。通過(guò)化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中sHER-2的表達(dá)水平，檢測(cè)儀器為ADVIA Centuar CP，購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子公司。細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑包括DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶及青、鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及sHER-2測(cè)定

細(xì)胞在包含15%胎牛血清和含青、鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境中培養(yǎng)，待對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%，吸出培養(yǎng)液，檢測(cè)培養(yǎng)液中sHER-2值。

1.3 sHER-2不同表達(dá)細(xì)胞株篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，每孔接種100個(gè)細(xì)胞于24孔板上，每24～48 d后傳代1次，共10次。對(duì)傳代細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行sHER-2濃度檢測(cè)(共24個(gè)孔)，并篩選出高、中和低表達(dá)水平的細(xì)胞克隆進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，共3組(sHER-2高表達(dá)組、中表達(dá)組和低表達(dá)組)，每孔接種100個(gè)細(xì)胞于6孔板上，待細(xì)胞數(shù)達(dá)50%生長(zhǎng)融合時(shí)，用FISH法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞克隆形成率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，共3組(sHER-2高表達(dá)組、中表達(dá)組和低表達(dá)組)，每孔接種100個(gè)細(xì)胞于6孔板上，10～14 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，顯微鏡下計(jì)數(shù)有效克隆數(shù)(超過(guò)50個(gè)細(xì)胞數(shù)的克隆為有效克隆)并計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)＝克隆數(shù)/實(shí)際接種細(xì)胞數(shù)×100%，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)判斷細(xì)胞生長(zhǎng)能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，共3組(sHER-2高表達(dá)組、中表達(dá)組和低表達(dá)組)，以每孔105個(gè)接種于24孔板，待細(xì)胞數(shù)達(dá)50%生長(zhǎng)融合時(shí)，用移液槍頭沿培養(yǎng)板底部呈一字型劃痕，分別于培養(yǎng)1和48 h時(shí)倒置顯微鏡下測(cè)量劃痕的寬度。細(xì)胞遷移率(%)=(1-測(cè)量時(shí)劃痕寬度/初始劃痕寬度) ×100%。重復(fù)試驗(yàn)4次［3］。

1.6 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，共3組(sHER-2高表達(dá)組、中表達(dá)組和低表達(dá)組)，每孔接種5 000個(gè)細(xì)胞于Transwell孔板內(nèi)。24～36 d后終止培養(yǎng)。固定、染色后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞穿孔情況并進(jìn)行計(jì)數(shù)。相對(duì)細(xì)胞侵襲率(%)=穿透細(xì)胞總數(shù)/5 000×100%。

1.7 CA153的檢測(cè)方法

使用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，使用儀器為羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司COBAS 600(CA153使用國(guó)際單位U/mL)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞生長(zhǎng)及存活曲線用SigmaPlot 10.0統(tǒng)計(jì)軟件擬合，圖表使用GraphPad Prism軟件繪制。計(jì)量資料用表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析比較組間差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌細(xì)胞系sHER-2水平明顯增高

乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3和正常乳腺上皮細(xì)胞均培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸出培養(yǎng)液，檢測(cè)培液中sHER-2表達(dá)水平。SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sHER-2濃度為(51.9±4.4)ng/mL，明顯高于對(duì)照組正常乳腺上皮細(xì)胞(10.0±1.8)ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖 1 兩組細(xì)胞株之間sHER-2表達(dá)水平的比較Fig. 1 The comparison of sHER-2 expression levels between the two groups of cell lines

2.2 乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3中sHER-2不同濃度表達(dá)細(xì)胞株建立

將SK-BR-3細(xì)胞系經(jīng)克隆化培養(yǎng)，得到不同sHER-2表達(dá)濃度的細(xì)胞株。將15.8 ng/mL作為sHER-2最佳的cut-off值具有99.1%的特異度和16.1%的靈敏度，小于15.8 ng/mL的細(xì)胞株作為sHER-2低表達(dá)株；15.8～50.0 ng/mL的細(xì)胞株作為sHER-2中表達(dá)株；大于50.0 ng/mL的細(xì)胞株作為sHER-2高表達(dá)株［4］。

將上述克隆純化后培養(yǎng)的3株sHER-2不同表達(dá)水平細(xì)胞株再利用FISH法進(jìn)行驗(yàn)證，F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果與ADVIA Centaur法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中sHER-2濃度結(jié)果相一致(圖2)。

圖 2 sHER-2高、中和低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株建立Fig. 2 Establishment of breast cancer cell clones with high, medium and low sHER-2 expression

2.3 細(xì)胞克隆形成率的檢測(cè)

sHER-2高表達(dá)、中表達(dá)和低表達(dá)細(xì)胞株克隆形成率分別為(51.3±3.4)%、(42.0±3.7)%和 (26.7±2.9)%，sHER-2高表達(dá)組細(xì)胞的克隆形成能力明顯高于其他兩組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖 3 高、中和低表達(dá)細(xì)胞染色后的鏡下克隆Fig. 3 The image of cell clones with high, medium and low sHER-2 expression concentration

2.4 細(xì)胞生長(zhǎng)能力比較

劃痕后培養(yǎng)1 h時(shí)，sHER-2高表達(dá)組細(xì)胞sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株遷移率與中、低兩組細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。48 h后，發(fā)現(xiàn)sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的生長(zhǎng)能力明顯強(qiáng)于中、低兩組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1，圖4)。

表 1 sHER-2不同表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Tab. 1 The effect of sHER-2 expression level on cell mobility

表 1 sHER-2不同表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Tab. 1 The effect of sHER-2 expression level on cell mobility

*: P＜0.05, as compared with other two groups

Group 1 h 48 h Mobility sHER-2 high expression 20.5±1.3 10.3±1.0 (50.0±0.6)%*sHER-2 medium expression 21.3±1.1 16.3±1.8 (19.5±3.4)% sHER-2 low expression 20.5±1.7 17.5±1.3 (13.6±1.0)%

2.5 細(xì)胞侵襲能力比較

本研究通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SKBR-3細(xì)胞系中分選出來(lái)的sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的穿膜率為(53.5±4.2)%，明顯強(qiáng)于sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株［(33.2±3.9)%］和sHER-2低表達(dá)細(xì)胞株［(28.9±5.4)%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

2.6 sHER-2檢測(cè)與CA153檢測(cè)情況比較

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、中和低表達(dá)組sHER-2檢測(cè)結(jié)果與CA153檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)(圖6)。

3 討 論

乳腺癌是我國(guó)最常見(jiàn)的女性惡性腫瘤，發(fā)展迅速，發(fā)病率更是位居女性癌癥首位?；熌退幒娃D(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是乳腺癌難以根治的主要原因［5］。本研究通過(guò)檢測(cè)sHER-2在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平，建立不同表達(dá)水平的乳腺癌細(xì)胞系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究分析，也可為臨床醫(yī)生使用靶向藥物提供依據(jù)。

目前曲妥珠單抗主要用于治療HER-2過(guò)表達(dá)的乳腺癌患者［6］。然而，并非所有患者都對(duì)此藥物敏感，原因可能是由于腫瘤細(xì)胞內(nèi)sHER-2表達(dá)水平的差異，致使在同一治療條件下患者的治療效果也會(huì)有所不同。

圖 4 高、中和低表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig. 4 The cell growth status of sHER-2 high, medium and low expression cell clones

圖 5 高、中和低表達(dá)細(xì)胞侵襲能力Fig. 5 The invasion ability of sHER-2 high, medium and low expressions cell clones

圖 6 3組sHER-2檢測(cè)與CA153之間相關(guān)性比較Fig. 6 Correlation between sHER-2 and CA153 in 3 groups

本研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞組和正常乳腺上皮細(xì)胞之間sHER-2表達(dá)水平差異顯著，本研究在乳腺癌細(xì)胞系中通過(guò)sHER-2檢測(cè)區(qū)分建立高、中和低表達(dá)水平的細(xì)胞株，再對(duì)三者進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)特性研究。通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在相同條件下，sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株增殖更快。此外，本研究通過(guò)增殖遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)sHER-2高表達(dá)細(xì)胞株的遷移和侵襲能力要明顯強(qiáng)于sHER-2中、低表達(dá)細(xì)胞株，與克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。王英哲等［7］的研究結(jié)果顯示，惡性乳腺癌中sHER-2高表達(dá)患者病情嚴(yán)重程度、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的概率以及預(yù)后等都要高于其他乳腺癌患者。本研究結(jié)果與該文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)sHER-2的乳腺癌細(xì)胞具有促增殖、促細(xì)胞動(dòng)力等生物學(xué)效應(yīng)，在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。這一研究結(jié)果可為臨床上針對(duì)sHER-2表達(dá)不同患者合理使用靶向藥物治療提供數(shù)據(jù)支持及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有關(guān)sHER-2高表達(dá)是否為乳腺癌預(yù)后不良的因子之一，還值得進(jìn)一步研究、探索。

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The effect of different expression levels of HER-2 on the biological characteristics of breast cancer cells

ZHANG Jie, ZHENG Hui, LU Renquan, GUO Lin (Department of Clinical Laboratory, Fudan University Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: GUO LIN E-mail: guolin500@hotmail.com

Background and purpose: Human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) is the member of tyrosine kinase receptor family. Its differential expression plays the key role in choosing targeted drug for breast cancer. This study focused on screening the breast cancer cell clones of different HER-2 expression levels, and studying the biological characteristics of these cells. Methods: Breast cancer SK-BR-3 cells were clonally purified, and the expression level of soluble HER-2 (sHER-2) from the culture supernatant was detected by the ECLIA on ADVIA Centaur CP System. Cell clones with high expression (＞50.0 ng/mL), medium expression (15.8-50.0 ng/mL) and low expression (＜15.8 ng/mL) of sHER-2 were identified, respectively. This study observed the morphological changes of cell strains with differential expression levels of sHER-2 by cell culture. Besides, biological characteristics were compared by a series of experiments in vitro, such as clone formation, scratch assay, and transwell detection. Results: Compared with normal breast cells, sHER-2 was overexpressed significantly in SK-BR-3 breast cancer cells. Furthermore, the abilities of clone formation, mobility and invasion of sHER-2 high expression cell strain [(51.3±3.4)%, (50.0±0.6)% and (53.5±4.2)%] were significantly higher than those of sHER-2 medium expression [(42.0±3.7)%, (19.5±3.4)% and (33.2±3.9)%] or sHER-2 low expression [(26.7±2.9)%, (13.6±1.0)% and (28.9±5.4)%], and the differences were all statistically significant (P＜0.05).Conclusion: Breast cancer cell strain with high expression level of sHER-2 can enhance cell proliferation, promote cell motility and other biological effects, which may lay the foundation for clinical screening of targeted drug therapies for breast cancer.

Breast cancer; Soluble human epidermal growth factor receptor-2; Cell invasion; Proliferation; Migration

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.007

R737.9

A

1007-3639(2017)03-0201-06

2016-08-01

2016-11-30）

郭 林 E-mail:guolin500@hotmail.com