夏前林，單孟林，丁 滔，朱延軍，侯 君，鄭江花,5

1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學檢驗科，上海 201508；

2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院泌尿外科，上海 201499；

3.復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032；

4.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032；

5.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心感染控制科，上海 201508

前列腺癌差異表達基因的篩選及相互作用的生物信息學分析

夏前林1，單孟林1，丁 滔2，朱延軍3，侯 君4，鄭江花1,5

1.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心醫(yī)學檢驗科，上海 201508；

2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院南院泌尿外科，上海 201499；

3.復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海 200032；

4.復旦大學附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032；

5.復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心感染控制科，上海 201508

背景與目的：基因芯片技術是利用雜交測序方法，可大規(guī)模高通量地檢測不同組織、細胞中的基因表達水平的技術。該研究采用基因芯片技術篩選前列腺癌及前列腺炎癥穿刺組織中差異表達的基因并對其進行生物學信息分析。方法：采用美國Affymetrix Human U133 plus 2.0基因表達譜芯片，按一步法分別抽提惡性程度較高的前列腺癌及前列腺炎癥組織的總RNA，并分離純化這兩種組織的mRNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成摻入生物素標記的cDNA合成探針，與芯片雜交和嚴格洗片后，用熒光掃描儀掃描芯片熒光信號圖像。用生物信息學方法分析前列腺癌及前列腺炎癥組織中差異表達基因。結(jié)果：按照表達差異倍數(shù)大于等于2，P＜0.05的篩選條件，篩選出差異基因1 819條，其中上調(diào)表達基因1 025條和下調(diào)表達基因794條。采用GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要涉及細胞周期、分子代謝等分子功能以及生物學過程；KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因主要涉及嘌呤核苷酸代謝等代謝通路。STING在線工具分析對差異基因編碼的蛋白質(zhì)間的相互作用進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白間的相互作用主要集中在TPX2、ANLN、NUSAP1、MELK、DLGAP5、KIF11、TOP2A及RRM2等20個關鍵節(jié)點基因。最后對重要節(jié)點基因進行文獻挖掘，發(fā)現(xiàn)CEP55和ANLN基因可能與前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關。結(jié)論：在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中，促使細胞進入增殖周期的相關基因的活化、代謝相關酶類基因活性的異常、細胞黏附功能相關基因的抑制以及細胞移行相關基因的激活等因素發(fā)揮了重要的作用。系統(tǒng)的分析這些基因發(fā)現(xiàn)，CEP55和ANLN基因與前列腺癌的發(fā)生和預后關系密切，為下一步研究實驗提供有價值的線索。進一步研究相關差異基因?qū)⒂型l(fā)現(xiàn)新的早期診斷指標，為建立個體化治療方案和預后評估系統(tǒng)提供幫助。

前列腺癌；基因芯片；差異基因；生物信息學

前列腺癌在許多歐美國家是男性最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率僅次于肺癌，居男性腫瘤的第二位［1］。雖然我國前列腺癌的發(fā)病率較低，但隨著我國人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整及診斷技術的提高，該發(fā)病率逐年增高，躍居男性泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第3位?；蛐酒夹g是將大量的靶基因全長或片段有序而高密度地固定排列在玻片、硅片或尼龍膜固相支持物上的一項技術，具有高通量、多參數(shù)、平行化等優(yōu)點，在功能基因組學研究中正發(fā)揮越來越重要的作用。自問世以來基因芯片技術已廣泛用于人類多種腫瘤基因表達譜等方面的研究，為腫瘤相關基因的研究提供了一種全新的方法。目前，利用基因芯片進行前列腺癌的研究主要集中在三個方面，包括通過分析前列腺癌以及正常前列腺組織進行前列腺癌發(fā)生、發(fā)展相關的基因研究［2］，通過分析原發(fā)性前列腺癌組織和轉(zhuǎn)移性前列腺癌組織進行前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關的基因研究［3］以及通過分析治療后復發(fā)和未復發(fā)的前列腺癌患者組織標本進行前列腺癌預后和復發(fā)傾向預測的研究［4］。雖然，利用基因芯片篩選前列腺癌差異基因的報道較多，但對前列腺癌與前列腺炎癥組織差異表達基因分析的報道甚少。因此，有必要對相關的差異表達基因進行篩選分析。本實驗應用基因芯片技術檢測了惡性程度較高的前列腺癌和前列腺炎癥穿刺組織中基因表達的不同，初步篩選出相關的基因，為進一步深入研究其在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用以及找到更客觀的臨床診斷指標提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因芯片

所用基因芯片為美國Affymetrix公司的U133 plus 2.0基因表達譜芯片，由上海伯豪生物技術有限公司提供。該芯片包含了人類基因組47 000個轉(zhuǎn)錄本，涵蓋了38 500個明確的人類基因。其芯片數(shù)據(jù)庫來源于GenBank、dbEST和RefSeq。序列簇信息由UniGene(2003年1月25日)數(shù)據(jù)庫建立，并經(jīng)由華盛頓大學、加州大學圣克魯斯分校和美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的公共數(shù)據(jù)庫共同整合而成。

1.1.2 前列腺癌組織標本

按照我國醫(yī)學倫理委員會制度與操作規(guī)程進行臨床標本的資料和收集。4例前列腺癌組織及4例前列腺炎癥組織穿刺標本來自于上海市復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科，均按照2014年《中國前列腺癌診斷治療指南》經(jīng)組織病理學檢查確診。患者年齡57～73歲，平均65歲。將標本收集后迅速置于-80 ℃冰箱冷凍保存待檢。

1.2 方法

1.2.1 前列腺組織RNA的提取和純化

前列腺炎癥組織和前列腺癌組織總RNA的提取采用TRIzol一步法抽提，用超微量分光光度計NanoDrop ND-2000在260 nm和280 nm處分別測定吸光度值(D)，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100(購自美國Agilent科技有限公司)電泳質(zhì)檢合格后使用RNeasy迷你試劑盒(型號：74004，購自德國QIAGEN公司)和RNase-Free DNase Set(型號：79254，購自德國QIAGEN公司)純化總RNA。

1.2.2 樣品RNA的放大和標記

實驗樣品RNA采用Affymetrix表達譜芯片配套試劑盒GeneChip 3’ IVT PLUS反轉(zhuǎn)試劑盒(型號：902416，購自美國Affymetrix公司)對樣品總RNA中的mRNA進行放大、標記和純化，獲得帶有生物素標記的cRNA。

1.2.3 芯片雜交

按照Affymetrix表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒GeneChip? 雜交清洗染色試劑盒(型號：900720，購自美國Affymetrix公司)說明書進行操作。在滾動雜交爐中在45 ℃的條件下滾動雜交16 h，雜交完成后把雜交好的芯片進行洗脫、染色。

1.2.4 芯片掃描和檢測分析

芯片雜交結(jié)果采用GeneChip? 3000掃描儀(型號：00-00212，購自美國Affymetrix公司)進行掃描，用Command Console 4.0軟件(購自美國Affymetrix公司)讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用R軟件中Affy包進行歸一化處理，所用的算法為MAS 5.0。

1.2.5 芯片數(shù)據(jù)生物信息學分析

采用GO富集分析、KEGG通路、STING在線分析工具等生物信息學方法分析前列腺癌及前列腺炎癥組織中差異表達基因，并通過對重要節(jié)點基因文獻挖掘的方法，找到與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關的基因。

2 結(jié) 果

2.1 芯片檢測質(zhì)量判斷

2.1.1 RNA質(zhì)檢結(jié)果

所抽提的總RNA經(jīng)超微量分光光度計NanoDrop檢測A260nm和A280nm值，算得A260nm/ A280nm均大于1.8，表明所提取總RNA純度較高；經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100定量電泳儀檢測，RIN(RNA完整系數(shù))大于7.0且28s/18s大于0.7 (圖1)。符合電泳質(zhì)控標準，表明總RNA質(zhì)量完好，可以進行芯片實驗(表1)。

圖 1 8例樣本的電泳圖Fig. 1 Electrophoresis map of 8 samples

2.1.2 基因表達譜芯片熒光信號掃描結(jié)果

采用GeneChip? Scanner 3000基因芯片掃描系統(tǒng)對8個樣本芯片進行掃描，其熒光信號掃描圖顯示：芯片信號整體分布均勻，陽性質(zhì)控探針信號清晰，陰性質(zhì)控探針無明顯信號存在，可以進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 基因芯片檢測結(jié)果的分布情況

2.2.1 芯片數(shù)據(jù)的散點圖分析

芯片的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理，轉(zhuǎn)化為log2的值后，在一個二維坐標系中繪制散點圖。分布在對角線兩側(cè)平行線上的點是表達水平無明顯差異的基因，分布在對角線之外的點為表達有差異的基因，且距離對角線越遠表示表達差異倍數(shù)越大，分布在對角線兩側(cè)平行線之外的點為差異表達倍數(shù)大于2倍的基因。如圖2所示，表達譜芯片的散點圖中的點分布大部分集中在對角線兩側(cè)平行線之外，說明存在許多表達顯著改變的基因。

表 1 總RNA的質(zhì)量檢測結(jié)果Tab. 1 The results of total RNA detection

圖 2 R軟件歸一化處理樣本原始數(shù)據(jù)的散點圖Fig. 2 The scatter plot of the normalized raw data with R software

2.2.1 芯片數(shù)據(jù)的熱圖分析

熱圖直觀地顯示了各個樣本中不同基因的表達水平。黑色代表0，表示基因表達水平?jīng)]有變化，紅色代表表達水平升高，綠色代表表達水平降低；顏色的亮度代表基因表達水平升高或降低的程度。表達相似的基因(探針)和樣本聚類在一起。如圖3所示，可以看出炎性組織和前列腺癌組織間的表達譜明顯不同。

圖 3 R軟件歸一化處理樣本原始數(shù)據(jù)的熱圖Fig. 3 The heatmap of the normalized raw data with R software

2.3 基因芯片檢測的數(shù)據(jù)結(jié)果及生物信息學分析

2.3.1 基因表達譜芯片數(shù)據(jù)結(jié)果

本研究選擇4例確診的惡性程度較高的前列腺癌組織標本，以4例前列腺炎癥組織作為對照，按照Fold Change大于等于2，t檢驗P＜0.05的篩選條件，篩選與前列腺癌有關的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達差異基因1 819條中上調(diào)的有1 025條，下調(diào)的有794條。以Fold Change大于等于5、t檢驗P＜0.01為條件進一步篩選基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達差異基因241條，其中上調(diào)的有128條，下調(diào)的有113條，部分上調(diào)和下調(diào)基因見表2，其中負號表示與炎癥組織比較，在癌組織中該基因表達下調(diào)。

2.3.2 差異表達基因的相互作用網(wǎng)絡分析

通過STING在線工具對241個前列腺癌差異基因的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡進行分析。結(jié)果顯示，在整個網(wǎng)絡中，TPX2、ANLN、

NUSAP1、MELK、DLGAP5、KIF11、TOP2A、CDC6、RRM2、PBK、ASPM、KIF20A、CCNB1、PBC1、CDK1、BUB1、CDC20、NCAPG、NUF2、CENPF、CEP55、 CENPA、UBE2C、MUC、EZH2、CCN、CKAP2和MLF1IP6蛋白與其他大于等于5個蛋白存在相互作用關系，這些蛋白節(jié)點為蛋白互作網(wǎng)絡的中心節(jié)點(圖4)。

表 2 部分上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因(癌/炎癥組織)Tab. 2 Parts of up-regulated and down-regulated differentially expressed genes (cancer/inflammation)

圖 4 差異表達基因的蛋白與蛋白相互作用圖Fig. 4 The protein-protein interactions among differentially expressed genes

2.3.3 差異表達基因的GO富集及KEGG通路分析

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，上述差異基因主要涉及上皮細胞的生長、細胞周期的進程、細胞移行、纖維母細胞生長因子受體信號通路調(diào)節(jié)、細胞骨架蛋白結(jié)合小分子代謝過程、細胞表面受體信號通路、細胞黏附、細胞調(diào)節(jié)氨基酸代謝過程等分子功能、細胞組成以及生物學過程。

同時將基因芯片差異表達基因作KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集在谷胱甘肽代謝、p53信號通路、細胞周期、細胞外基質(zhì)受體相互作用、蛋白的消化和吸收以及 TGF-β信號通路上(表3)。

表 3 差異表達基因KEGG通路路徑列表Tab. 3 The KEGG pathways of differentially expressed genes

3 討 論

前列腺癌的發(fā)生是一個復雜的過程，是許多腫瘤相關基因表達失常或多種腫瘤抑制基因失活所致，因此在腫瘤組織癌變過程中對相關基因及基因組的變化研究顯得尤為重要［1，5］。隨著人類基因組計劃的完成，基因芯片作為后基因組時代發(fā)展起來的一項DNA分析技術，具有快速、高效、平行化地檢測大規(guī)模基因表達的優(yōu)勢，結(jié)合基因芯片表達數(shù)據(jù)的生物信息學分析，為我們更好地理解前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的機制提供了有益的線索。本實驗中我們采用了美國Affymetrix公司的U133 plus 2.0寡聚核苷酸點陣基因表達譜芯片，在前列腺癌組織中篩選出1 819條差異表達的前列腺癌相關基因，表明前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因、多途徑相互作用和相互影響的復雜過程。

從基因的功能分類來看，這些差異表達的基因主要涉及上皮細胞的生長、細胞周期的進程、細胞移行、纖維母細胞生長因子受體信號通路調(diào)節(jié)、細胞骨架蛋白結(jié)合小分子代謝過程、細胞表面受體信號通路、細胞黏附、細胞調(diào)節(jié)氨基酸代謝過程等分子功能、細胞組成等生物學過程。通過對這些基因分類有助于我們從分子水平了解前列腺癌發(fā)生的機制，為尋找新的前列腺癌標志物和探索基因治療提供依據(jù)。在KEGG通路分析中我們注意到前列腺癌組織中大量與代謝相關的基因表達，涉及糖原降解、膽固醇合成、脂肪酸的氧化、3-磷酸肌醇的生物合成、嘌呤核苷酸的合成、谷胱甘肽的代謝通路，表明在前列腺癌中脂類代謝、核酸代謝以及糖代謝都發(fā)生了顯著改變，也說明了與前列腺炎癥組織相比，前列腺癌細胞獲取能量的范圍更廣，可以從碳水化合物到脂肪酸和氨基酸。這與多項研究報道的結(jié)果一致［6-9］。由于前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)在臨床前列腺癌診斷中存在很多缺陷，因此，通過對代謝分子及相關基因的研究來找到新的特異度和靈敏度更高的腫瘤標志物，成為前列腺癌研究的一個新的熱點。

對這些差異基因進行相互作用網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)以TPIP13、TPX2、ANLN、NUSAP1、MELK、DLGAP5、KIF11、TOP2A、CDC6、RRM2、PBK、ASPM、KIF20A、CCNB1、PBC1、CDK1、BUB1、CDC20、NCAPG、NUF2、CENPF、CEP55、CENPA、UBE2C、MUC、EZH2、CCN、CKAP2、MLF1IP等基因為中心構(gòu)成了相互作用的網(wǎng)絡，其中TOP2A、CDC6、CCNB1、CDK1、BUB1、CDC20、UBE2C、MUC、EZH2和CCN等基因與前列腺癌的關系已有大量文獻報道。我們通過文獻挖掘發(fā)現(xiàn)目前CEP55和ANLN基因與前列腺癌的關系報道較少，且這兩個基因可能與前列腺癌的發(fā)生和預后關系密切。CEP55蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的典型卷曲螺旋蛋白家族成員之一，定位于人染色體10q23.33，其轉(zhuǎn)錄的cDNA由464個氨基酸構(gòu)成，包含9個外顯子［10］。其主要功能是錨定微管聚合相關蛋白，參與紡錘體形成，進而調(diào)控細胞增殖。既往研究顯示，CEP55可能是通過PLKl和TEXl4等信號通路參與腫瘤多種生物學功能［11-12］。CEP55在前列腺癌中的報道很少，Shiraishi等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在根治性前列腺癌切除術的術后復發(fā)患者中，CEP55表達量顯著增高，且術后隨訪資料顯示CEP55水平越高，患者生存率越低，提示CEP55與前列腺癌的預后密切相關。本實驗中，CEP55表達上調(diào)5.5倍，也提示在前列腺癌中該基因可能存在過表達現(xiàn)象。但其在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用以及具體機制還不明確，值得進一步研究。ANLN是一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，位于染色體7p14.2，全長84 kb，編碼1 124個氨基酸。ANLN作為卵裂溝形成的一個關鍵蛋白，在細胞有些分裂過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，ANLN在多種腫瘤中存在過表達現(xiàn)象［14-16］。Zhou等［17］研究發(fā)現(xiàn)，ANLN在乳腺癌組織中存在過表達現(xiàn)象，進一步在乳腺癌細胞中敲除ANLN基因發(fā)現(xiàn)，細胞生長受到抑制，并且可通過顯著提高Cdc2的磷酸化水平和降低Cyclin D1的表達來抑制乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。同時發(fā)現(xiàn)，在敲除ANLN基因后大多數(shù)乳腺癌細胞處于G2/M期，這也與ANLN基因參與調(diào)節(jié)細胞質(zhì)分裂的功能一致。ANLN蛋白在前列腺癌中的研究報道甚少，Tamura等［18］等在激素抵抗性前列腺癌組織標本的全基因組表達譜中發(fā)現(xiàn)ANLN存在過表達現(xiàn)象，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及到許多基因的異常表達，而這些異常表達的基因參與了多種分子生物學過程，深入研究這些基因?qū)⒂欣谶M一步了解前列腺癌的發(fā)病機制。GO和KEGG通路分析結(jié)果也說明了前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素的過程，雖然涉及到許多基因，但其中相當一部分可能是繼發(fā)性改變，所以只有進一步篩選出關鍵的基因或信號通路，才有可能為疾病的診斷、治療提供有效的指導，為建立個體化治療方案和預后評估提供幫助。

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Screening for differential genes of the prostate cancer and bioinformatics analysis of their interaction

XIA Qianlin1, SHAN Menglin1, DING Tao2, ZHU Yanjun3, HOU Jun4, ZHENG Jianghua1,5(1.Department of Laboratory Medicine, Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China; 2. Department of Urology, Southern Branch of the Sixth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 201499, China; 3. Department of Urology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 4. Department of Pathology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 5. Department of Infection Control, Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China)

ZHENG Jianghua E-mail: zhengjianghua2015@163.com

Background and purpose: Gene chip is a nucleic acid sequence analysis method which is based on hybridization. It is a high-through put assay which can widely detect the level of gene expression in different tissuesand cell types. This study aimed to compare and bioinformatically analyze differentially expressed genes between higher malignant degree of prostate cancer tissues and prostate inflammation tissues. Methods: The total RNAs were isolated from tissues of prostate cancer and prostate inflammation by TRIzol method and then purified, reversely transcribed to cDNA with incorporating biotin labeling probe, hybridized with Affymetrix Human U133 Plus 2.0 (covering 47 000 transcripts，representing 38 500 distinct genes). Picture signals of fluorescence in gene array were scanned and differential expression of gene in two tissues were compared by Command Console Software 4.0. These differential expressed genes were analyzed by bioinformatics methods finally. Results: According to the fold change ≥2, P＜0.05, 1 819 differential expression genes including 1 025 up-regulated genes and 794 down-regulated genes were discovered. GO enrichment analysis displayed that these differentially expressed genes were mainly involved in cell cycle, cell metabolism, etc. KEGG pathway analysis found that these genes were mainly involved in some metabolism pathways including purine nucleotide metabolism. The interactions between the proteins encoded by these genes were analyzed by STING. Twenty key nodes genes including TPX2, ANLN, NUSAP1, MELK, DLGAP5, KIF11, TOP2A, RRM2 were discovered. Then this study revealed CEP55 and ANLN might be related to the occurrence and metastasis of prostate cancer by looking through literature. Conclusion: During the development of prostate cancer, the activation of genes related to cell cycle and cell migration, the abnormalities of genes related to metabolism and the inhibition of genes related to cell adhesion play critical roles in the development of prostate cancer. CEP55 and ANLN were related to the occurrence and prognosis of prostate cancer by systematic analysis which provided a valuable clue for the next experiment.

Prostate cancer；Gene chip；Differential genes；Bioinformatics

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.002

R737.25

A

1007-3639(2017)03-0169-08

2016-08-05

2016-12-30）

國家自然科學基金面上項目(81372318)；上海市2014年度“科技創(chuàng)新行動計劃”實驗動物研究領域科技支撐項目重點項目(14140901400)；上海市自然科學基金項目(13ZR1435000 )。

鄭江花 E-mail:zhengjianghua2015@163.com