王 倩 張養(yǎng)東,3* 鄭 楠,3 李松勵,3 文 芳,3 趙圣國,3 王加啟,3

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京100193)

代謝組學在奶牛營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量安全方面的研究進展

王 倩1,2張養(yǎng)東1,2,3*鄭 楠1,2,3李松勵1,2,3文 芳1,2,3趙圣國1,2,3王加啟1,2,3

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，北京100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶及奶制品監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京100193)

代謝組學是檢測低分子質(zhì)量(通常分子質(zhì)量小于1 000 u)代謝物的變化，并以此來研究生物體受到病理/生理刺激或基因改變后所產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的構(gòu)成及其變化規(guī)律的學科。它是后基因時代發(fā)展起來的一門新的學科，是系統(tǒng)生物學的重要組成部分。代謝組學已經(jīng)廣泛應用于生理學、病理學、藥理學、動物營養(yǎng)學、動物學和植物學等各個領域，但代謝組學在奶牛營養(yǎng)與牛奶質(zhì)量安全研究中的應用還比較少。本文從代謝組學的基本概念、研究思路和方法等入手，綜述了目前代謝組學在奶牛營養(yǎng)、疾病、熱應激、牛奶質(zhì)量與奶品安全中的應用。

代謝組學；奶牛；營養(yǎng)；牛奶；質(zhì)量；安全

牛奶中除含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類和脂類外，還含有很多微量卻可以承擔重要生理功能的生物活性物質(zhì)，例如免疫球蛋白、核苷酸和寡糖等[1-2]。許多因素可以影響到牛奶的產(chǎn)量和成分，例如遺傳因素、飼料組成、季節(jié)性變化、奶產(chǎn)品加工過程以及動物健康狀況等[2-5]。因此，通過檢測奶中各種成分的變化，我們不僅可以了解奶產(chǎn)品質(zhì)量，還可以追溯奶牛的生理或是病理狀況[6-7]。通過生化或是感官等常規(guī)指標能夠監(jiān)測奶牛健康狀況或牛奶品質(zhì)，但檢測指標較為簡單，因此不可避免地使結(jié)果帶有局限性。另外，如果檢測參數(shù)之間缺乏關聯(lián)，也會給了解研究對象的完整信息帶來更多的困難。對于生命體來說，其內(nèi)部生物化學反應不僅是連續(xù)的，而且這些反應所涉及到的代謝途徑之間還是相互關聯(lián)的，因此是以代謝網(wǎng)絡的形式在生命體內(nèi)存在，所以需要用整體和系統(tǒng)的研究思想去認識機體代謝。系統(tǒng)生物學的誕生使得生命科學的研究思想、方法和技術跨越到了整體和系統(tǒng)研究的階段[8]。隨著研究思想、方法和技術的創(chuàng)新和進步，代謝組學的出現(xiàn)給我們提供了全面了解動物健康及動物產(chǎn)品質(zhì)量與安全的新契機[8-9]。

1 代謝組學的基本概念、分類及應用范圍

1.1概念

代謝組學是研究生命體受到內(nèi)外界刺激或基因修飾后所產(chǎn)生的與時間序列相關聯(lián)的眾多代謝產(chǎn)物的一門學科[8,10]。它測定的生理參數(shù)能夠直接反映機體營養(yǎng)、應激或者疾病狀態(tài)，且代謝物反應速度比轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組要快得多。因此，代謝組學提供了一種更加直接的檢驗方法，這也是它有別于其他組學方法的重要特征。此外，機體代謝物的種類要遠小于基因和蛋白的數(shù)目，而且研究中使用的儀器和方法更為一致，這也有利于不同研究結(jié)果間的相互比較。以上優(yōu)點使得代謝組學研究在近年來得到快速發(fā)展，并在許多領域得到廣泛運用，如營養(yǎng)學、毒理學、疾病診斷以及藥物研發(fā)等領域[10]。

1.2研究目標、所涉及儀器類別及分析方法

代謝組學檢測方式的特點決定了其檢測的產(chǎn)物不僅分子質(zhì)量小，而且種類較多。因此也就要求有高靈敏度、高精度和高通量的儀器來檢測這些代謝物質(zhì)[8,10]。目前，常見的代謝組學的數(shù)據(jù)采集主要釆用質(zhì)譜(mass spectrometer,MS)和核磁共振譜(nuclear magnetic resonance,NMR)為核心的分析技術，在輔助以一些高效的分離設備，共同組合成代謝組學所使用的設備，設備類型包括：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS或LC-MS/MS)、高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用(high-performance liquid chromatography-nuclear magnetic resonance,HPLC-NMR)、高效液相色譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-NMR-MS)技術等[8,10]。其中，NMR技術比較適合分析含量高的代謝物，樣品只需要簡單的處理，因此基本不會破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，所以NMR具有良好的試驗重現(xiàn)性和較高的靈敏度。另外，NMR還允許樣品在一定的溫度和生理緩沖范圍內(nèi)選擇試驗條件，所以能更加接近生理狀態(tài)，也因而能夠進行實時和動態(tài)的監(jiān)測和檢驗[8,10]。NMR的檢測對象是元素的同位素原子核，目前最為常見的NMR波譜分析是氫譜核磁共振(1H NMR)、碳譜核磁共振(13C NMR)及磷譜核磁共振(31P NMR)3種。基于這3種波譜的分析方法可以檢測的生物樣本包含生物體液、細胞提取液、組織液和活體組織，其中1H NMR可引起生物樣本中的含氫化合物響應，這個特點使得生物樣品中大多數(shù)的代謝物都能被檢測到[8,10]。GC-MS的靈敏度高，適合分析易揮發(fā)或經(jīng)衍生化后易揮發(fā)有機化合物，還具有大量可檢索的標準質(zhì)譜庫的優(yōu)勢，例如美國國家標準技術學院(National Institute of Standards Technology)數(shù)據(jù)庫。在這些數(shù)據(jù)庫輔助下可以準確定性化合物種類[8,10-11]。目前的技術已經(jīng)可以通過采用GC-MS方法同時測定幾百個化學性質(zhì)不同的代謝物，包括有機酸、大多數(shù)氨基酸、糖、糖醇、芳胺和脂肪酸等[8,10-11]。LC-MS不同于GC-MS技術的地方在于其以測定物質(zhì)的質(zhì)荷比差別來區(qū)分和鑒定代謝物。由于LC-MS分析樣品無需衍生化處理，樣品范圍不受制于化合物的性質(zhì)，因此GC-MS分析難以分離和檢測的，不穩(wěn)定、難揮發(fā)的極性和極性低的成分均可以用LC-MS來分析。這個特點使得LC-MS分析化合物的類型最為廣泛。但是LC-MS得到的代謝物的鑒定還沒有標準的數(shù)據(jù)庫作為比對標準。若要鑒定代謝物種類，需要在線數(shù)據(jù)庫的幫助下，如人類代謝組學數(shù)據(jù)庫(Human Metabolome Database，HMDB)[12]。每種技術均有其優(yōu)勢和不可避免的缺點，但是可通過多種分析技術聯(lián)合應用來彌補相互間的不足，這也是代謝組學研究中的一個重要發(fā)展趨勢[8,10]。在HPLC-NMR和HPLC-NMR-MS的代謝組學研究中，高通量的HPLC分離技術，可高效地分離代謝物，簡化成分的復雜性。NMR可提供代謝物的分子質(zhì)量及子離子信息，對代謝物定性、定量分析具有高選擇性和髙靈敏度，而一維、二維NMR波譜還可以用來確定分子結(jié)構(gòu)[13]。

代謝組學數(shù)據(jù)的分析方法包括無監(jiān)督(unsupervised method)和有監(jiān)督方法(supervised method)2類。無監(jiān)督方法包括主成分分析(principal components analysis,PCA)、層次聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)、自組織圖(self-organizing maps,SOMs)。有監(jiān)督方法包括判別分析(discriminant analysis,DA)、偏最小二乘法(partial least squares,PLS)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘-判別分析(OPLS-DA)、軟獨立建模分類法(soft independent modeling of class analogy,SIMCA)、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(artificial neural network,ANN)[8,10]。

1.3分類及優(yōu)缺點

隨著試驗技術和數(shù)據(jù)分析方法的進步，基于代謝組學的各種研究和試驗方法成功地運用到了營養(yǎng)學、毒理學、病理學、藥理學、疾病診斷、動物模型、微生物、植物、生物醫(yī)學、環(huán)境科學等領域[8,10]。雖然代謝組學的研究方向各不相同，但是大致可將代謝組學的研究分為4類：即靶向代謝組學分析、非靶向代謝組學分析、代謝指紋分析和代謝物譜圖分析。靶向代謝組學分析可以驗證已鑒定的生物標記物，但需要標準品在定性和定量分析上的輔助。因此這類研究通常只能對大量樣本中數(shù)量有限的化合物進行定量。非靶向代謝組學主要是將對照組和試驗組的代謝物(某一生物體中的全部代謝物)進行比對，以找出其代謝物的差異。代謝輪廓分析需要研究人員先期假定某類或是某個特定的代謝途徑，并對此通路上不同代謝物進行更深入的研究。代謝指紋圖譜需要分析個體中代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜峰，從而可以最終了解不同化合物的結(jié)構(gòu)，建立一套完備的，識別這些不同化合物特征的分析方法[8,10]。

1.4牛奶及奶制品作為檢測對象的優(yōu)勢和必要性

現(xiàn)代奶牛營養(yǎng)研究和牛奶質(zhì)量安全檢測需要進行實時、連續(xù)、快速和非損傷的取樣和檢測技術。以往借鑒其他研究領域里所使用的血液、唾液、尿液或者是糞便等樣品類型很難做到定時或是頻繁取樣，此外，這類樣品的獲得數(shù)量也很不穩(wěn)定，有時甚至是微量獲取，因此也就不易做到連續(xù)和精確檢驗。奶及奶制品相對前述的幾種樣品來說，有著自己獨特的優(yōu)勢。第一，可以做到定時取樣，尤其是在大型的配備專用擠奶設備的牧場,都有著較為固定的擠奶時間，取樣時間較為固定。第二，獲得的樣品量大，例如單頭奶牛每次擠奶可以獲得幾千克到十幾千克樣品，這就提供了大量的研究樣品。第三，由于是固定時間采樣，動物已經(jīng)適應了擠奶的規(guī)律性擾動，因此樣品收集給動物造成的應激反應小，這也保證了樣品中盡可能少的包含干擾因素。第四，可獲得的樣品類型多。牛奶是人類最為重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，原奶及以其為原料制成不同的奶產(chǎn)品，諸如各種類型的奶粉、液態(tài)奶、黃油、奶酪、乳清、奶油和酸奶等都可以作為樣本來檢測，這些樣品不僅可以用來檢測其品質(zhì)和安全狀況，還可以追溯產(chǎn)奶動物的營養(yǎng)狀況、品系和種類[14-16]。

牛奶是人類獲得優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和脂類的重要來源物質(zhì)。此外，牛奶中含有的維生素、礦物質(zhì)和免疫球蛋白也在人類健康飲食中扮演了很重要的角色[1]。由于加工過程的不同，奶及奶制品所含有的營養(yǎng)物質(zhì)各有不同。相應地，不同奶制品對人類健康的影響也各不相同[2]。也因此，奶及奶制品的質(zhì)量和安全研究的重要意義得以凸顯。代謝組學可以檢測研究對象中的小分子物質(zhì)，因此是鑒別和定量奶及奶制品中代謝物的極具潛力的技術手段[8,15-18]。由于不同種類奶本身所蘊含的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值不同，不同奶畜所產(chǎn)奶的成分也有差異，有些差異還比較大，所以在實際檢測過程中需要通過生物標記物來有效地區(qū)分出不同奶畜奶間的差異[14]。奶的質(zhì)量安全問題越來越成為公眾的關注點。奶及奶制品中是否含有違禁物質(zhì)也是檢測中重點關注的，靶向代謝組學可以很好的承擔這一工作，例如基于NMR分析的代謝組學方法可以準確迅速地鑒定出奶中混入的三聚氰胺[19]。

2 代謝組學方法在牛奶質(zhì)量安全中的應用

2.1在奶產(chǎn)品加工性能檢測中的運用

原料奶對于乳品行業(yè)來說非常重要，因為這會直接影響牛奶的可加工性及后期產(chǎn)品中所蘊含的經(jīng)濟價值。如果原料奶本身可加工性能差，那么基于這類原料奶的奶制品也很難具有高品質(zhì)的特征[20-21]。歐洲原奶產(chǎn)量的40%被用來制作奶酪，而且多用酶凝結(jié)法來制作。因此,凝乳酶誘導的凝結(jié)性能是奶品加工性能的重要指標之一[20]。此外，影響牛奶凝固特征因素還包括物種、品系、季節(jié)性以及其本身成分等[20]，而且牛奶在凝固過程中不可避免地涉及到許多生化過程，這些生化改變對于奶品加工工藝來說非常重要。已有的研究表明奶酪制作過程中重要的處理步驟通常包括凝乳酶凝固和脫水收縮凝乳。凝乳酶凝固是酶水解酪蛋白的產(chǎn)生對位κ-酪蛋白、親水酪蛋白巨肽(caseinomacropeptide)和糖巨肽(glycomacropeptide)的過程，這一過程依賴于κ-酪蛋白分子的糖基化程度[20-21]。這些生化過程涉及到許多中間或是終末代謝物，但究竟有哪些代謝物發(fā)生了變化，我們還知之甚少。已有一些研究者在這個研究領域做出來一些有益的探索。Sundekilde等[17]使用NMR方法分析了不同品系奶牛所產(chǎn)的凝固性不同的牛奶代謝輪廓譜，試圖找出牛奶代謝產(chǎn)物與其品系及工藝特性間的內(nèi)在聯(lián)系。通過分析發(fā)現(xiàn)，牛奶代謝物輪廓與奶牛品種和聚沉性質(zhì)有關，而且牛奶組分中的肉堿和奶糖的變化可作為奶牛品種分類的指標。檸檬酸鹽、膽堿、肉堿和奶糖代謝物的變化與奶汁的沉聚性有關。在使用LC-MS/MS方法對易凝固和不易凝固牛奶的代謝物分析后發(fā)現(xiàn)，寡聚糖也是影響牛奶凝固性能的關鍵因素之一[21]。另外一個影響奶品加工性能的因子是原奶熱穩(wěn)定性。牛奶熱加工過程中有時需要超過130 ℃的加熱條件，這會造成奶品的某些成分的生化變化。加熱可能導致蛋白質(zhì)的凝固，例如乳清蛋白的變性、酪蛋白變性(去磷酸化、κ-酪蛋白水解)等[22-23]。代謝組學還可以用來動態(tài)分析和監(jiān)測奶中各成分的變化。31P NMR方法可以用來檢測超高溫瞬時處理超高溫瞬時滅菌奶在貯存期間的含磷成分的代謝變化[23]。奶品在生產(chǎn)、加工和貯存中都有可能沾染到微生物，從而造成奶品的腐敗變質(zhì)。重度的微生物學變化可以通過檢測氣味和顏色的變化來區(qū)分，然而有很多情況下，我們很難用普通感官和生化分析去檢測一些輕微腐敗奶品中的細微發(fā)生的生化過程。但是，代謝組學分析可以幫助我們了解這個過程中的代謝物的變化情況。例如，有研究者在牛奶中接種假單胞菌，分析了其中代謝物的變化特征，找到了可以指征腐敗的數(shù)個代謝產(chǎn)物。這個研究同時也證明了外源性微生物確實會影響到分析結(jié)果[24]。因此，此類研究中的樣品采集是個問題，因為外源進入的微生物可能會干擾到最后的結(jié)果。

2.2在牛奶營養(yǎng)研究中的運用

牛奶中營養(yǎng)物質(zhì)含量高低和組成是生產(chǎn)者和消費者都極為關注的指標[1]。NMR以其本身具有的對樣品破壞小、檢測速度快等特征，成為了食品檢測領域強有力的檢測工具。對比人奶、牛奶和嬰兒配方奶粉中代謝物后發(fā)現(xiàn)，牛奶代謝物種類明顯比人奶和奶粉中要多，而且不同泌乳期的牛奶代謝物含量也有區(qū)別[25-26]。人奶和獼猴奶的代謝物對比分析發(fā)現(xiàn)，人奶中的寡糖和氨基酸含量比獼猴奶高，而獼猴奶甘油磷酸膽堿、馬尿酸、三甲胺-N-氧化物等代謝物含量比人奶中含量高[27]。膽堿是構(gòu)建肝臟和腦細胞膜磷脂層的重要組分，水溶性乙酰膽堿還是重要的神經(jīng)遞質(zhì)，在生物體內(nèi)起到了非常重要的生理功能。在對比人初乳和牛初乳中膽堿含量后發(fā)現(xiàn)，人初乳中總膽堿含量要比產(chǎn)后數(shù)天所采集的牛奶中低，另外據(jù)推測人母乳中膽堿含量可能并不能滿足嬰兒生長和發(fā)育所需，因此需要嬰兒配方奶粉中的膽堿能彌補不足[28-29]。其實，膽堿除了可以用NMR檢測外，親水作用液相色譜法(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC LC-MS/MS)也可以較好檢測樣品中膽堿及膽堿代謝物，如乙酰膽堿、甜菜堿、甘油磷酸膽堿和溶血磷脂膽堿等。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸膽堿是奶牛泌乳早期奶中膽堿的主要存在形式，其含量與人奶中接近，但其后呈指數(shù)下降。與此相反的是，磷脂酰膽堿是泌乳中期及后期的膽堿主要存在形式，其含量隨著泌乳時長的延長而不斷增加[30]。磷脂微粒參與到許多生物功能中，并且是細胞膜的關鍵組分。奶中磷脂參與形成乳脂球蛋白的骨架，并且有益于動物腦的發(fā)育，因此磷脂含量也是重要的奶營養(yǎng)評估指標。

奶中不僅含有不同營養(yǎng)成分，而且含有多種元素。例如，31P NMR可以用來比較不同奶中含磷成分的含量差異[30]。但是現(xiàn)有的奶營養(yǎng)研究大多局限于單個同位素譜系的研究(如1H、13C和31P NMR譜)，極少有針對多個同位素譜NMR同時開展的代謝組學的研究。例如奶中脂類代謝組可以采用1H NMR方法，這種方法敏感而且也可以快速獲得結(jié)果，但就脂類的定性和定量來說，13C NMR更為合適，因其能夠獲得更多的信息[31-32]。由此看來，需要更多的開展多個同位素譜NMR，乃至是與質(zhì)譜結(jié)合的研究工作。

2.3在奶及奶制品標記物中的運用

牛奶占據(jù)了世界奶類產(chǎn)量的絕大部分比重，但仍有一些小品種奶畜所產(chǎn)奶為營養(yǎng)學界所推崇，例如水牛奶、牦牛奶、駱駝奶和馬奶等。這些種類的奶可作為功能食品，起到促進健康、預防疾病的作用[33]。由于營養(yǎng)價值高、經(jīng)濟價值可觀，在利益的驅(qū)使下，常有不法商人用別種奶摻假或冒充小品種奶畜所產(chǎn)奶的行為出現(xiàn)，而僅從感官或是普通的檢測手段又很難區(qū)分樣品中是否混有別種奶或者為別種奶假冒，這給監(jiān)管造成了極大的困難。因此，亟待發(fā)展出快速準確的技術手段來找出不同奶畜奶的生物標記物[34]。牛奶中的代謝產(chǎn)物是乳腺上皮細胞、外周血和微生物基因表達的最終產(chǎn)物的綜合體現(xiàn)，因此奶中代謝物譜往往會帶有物種的特征。NMR可以用來幫助鑒別不同奶牛品系(丹麥、荷斯坦和澤西)奶牛奶中代謝物差異，而且這些代謝物中所含的肉堿、膽堿和檸檬酸可以作為潛在的生物標記物來進行品系鑒定[27-29]。GC-MS分析表明纈氨酸和甘氨酸可以作為特定代謝標記物，用在牛奶和在山羊奶的區(qū)分中[35]。LC-MS和NMR聯(lián)用可以有效區(qū)分牛奶、羊奶、水牛奶、牦牛奶、駱駝奶和馬奶。對比發(fā)現(xiàn)，荷斯坦牛奶分別與娟姍牛奶、水牛奶、牦牛奶、山羊奶、駱駝奶和馬奶間有著68、74、54、58、77和91個代謝物的差異。此外，荷斯坦牛奶中乳酸、乙酸膽堿、丁二酸和丙酮酸的含量顯著高于其他動物奶，但荷斯坦牛奶中肉堿、尿苷和焦谷氨酸含量則低于顯著高于其他種類奶[14]?！叭樘遣荒汀焙汀叭轭愡^敏”人群可以飲用脫乳糖奶品或者以大豆、燕麥和谷物為基料制成的代乳食品。1H NMR可以用來檢測無乳糖飲料(含乳糖奶、脫乳糖奶以及大豆、燕麥和谷物為基料的代乳食品)的品質(zhì)。以煙堿作為內(nèi)標物可以定量分析乳糖含量，從而實現(xiàn)對無乳糖飲料的檢測。因此，NMR適合對奶及代乳食品進行快速分析[36]。

此外，不同產(chǎn)地原料奶所制作的奶制品往往蘊含著不同的社會文化和經(jīng)濟價值，而隨著城市化進程的加快，運輸工具的進步以及人類活動距離的擴大，即使是地方性食品，也可以在遠離產(chǎn)地的地區(qū)購買到，那么這些食品是否道地？品質(zhì)是否和產(chǎn)地所售商品質(zhì)量一致？這些疑問都需要解答。因此需要有快速可靠的技術手段來加以鑒定和檢測。Sacco等[37]聯(lián)合使用NMR、高效離子色譜(HPIC)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)、同位素比值質(zhì)譜(IRMS)和化學計量學方法來區(qū)分意大利南部采集奶與中東歐地區(qū)采集奶中代謝成分的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中東歐地區(qū)奶中乳糖含量要顯著高于意大利南部所采集的奶。在將NMR和IRMS所得數(shù)據(jù)整合分析后發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地奶中代謝物區(qū)分特征明顯。氫譜高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振-核磁共振聯(lián)用(1H HRMAS-NMR)可以用來評估馬蘇里拉奶酪品質(zhì)，還可以用來追溯此種奶酪是否為坎帕尼亞水牛奶所制作。代謝組學和微生物學整合分析表明，水牛奶所制作馬蘇里拉奶酪中微生物多樣性高，但是嗜冷菌多樣性低。牛奶嗜熱細菌(Streptococcusthermophilus)和更高水平的半乳糖和苯丙氨酸含量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)乳清酸是唯一的與物種區(qū)分有關的奶代謝產(chǎn)物[38]。

3 代謝組學方法在奶牛(代謝)疾病和熱應激監(jiān)測中的運用

泌乳早期會出現(xiàn)能量負平衡代謝，攝食量不足是其中最為關鍵的影響因素。已有的研究多從血液生化及生理角度去研究泌乳早期的負能量平衡代謝特征，但這類研究很難全面地理解泌乳早期的負能量平衡代謝特征[18,26]，但代謝組學卻可以從系統(tǒng)生物學的高度去理解這個生理時期動物的代謝特征。

Klein等[26]通過NMR和MS檢測泌乳初期和晚期牛奶代謝產(chǎn)物，目的是鑒定奶成分和奶牛代謝狀態(tài)之間的關系。結(jié)果表明丙酮和β-羥基丁酸與泌乳早期乳腺代謝狀態(tài)密切相關。NMR分析表明，除了牛奶中β-羥基丁酸和乙酰乙酸可以作為急性酮癥檢測的生物標志物外，泌乳第1個月牛奶中甘油磷酸膽堿和磷酸膽堿比例也可以作為酮病預后健康評估的潛在標記物，同時動物育種中也可以使用這些指標來定向選擇代謝穩(wěn)定的動物作為親體[39-40]。此外，葡萄糖、丙酮酸、乳酸和丙氨酸在負能量平衡奶牛血漿中濃度也顯著下降，這與β-羥基丁酸含量超過隱性酮病的限量參考值表明了食物已經(jīng)不能滿足機體葡萄糖的需求，需要依靠酮體作為能量來源。血漿甘氨酸的隨之增加不僅反映了蛋白質(zhì)儲備的過度消耗，也同時預示了機體未來可能會缺乏維生素B6[41-42]。

奶牛產(chǎn)后的泌乳高峰期由于攝食量不能滿足因泌乳失去的能量，不可避免的要動員體脂來補充能量不足。目前的研究表明奶牛主要動用脂肪組織中甘油三酯來彌補不足，其進一步酯解得到的非酯化脂肪酸可以直接作為代謝燃料來彌補糖代謝燃料的不足。雖然對這個替代途徑的內(nèi)在機理已經(jīng)有所研究，但大多是從單一代謝物的角度去開展研究，其中涉及的整體代謝途徑和代謝規(guī)律我們?nèi)圆磺宄18,26]?；诟咝б合嗌V-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-LC-MS/MS)技術的靶向代謝組學可以獲得更多的代謝產(chǎn)物信息，因此可以給出一個更全面的關于泌乳早期奶牛過度酯解的代謝規(guī)律[41]。肝臟內(nèi)極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein)合成途徑中涉及的磷脂酰膽堿類是脂類代謝的一類關鍵代謝物。脂肪代謝組學分析表明高酯解動物出現(xiàn)脂肪過度分解，胰島素敏感性受損和?；鈮A變化的特征。在這些代謝通路中共鑒定出了37種關鍵代謝物，其中涉及到的鞘磷脂，磷脂、溶血磷脂等脂類代謝物[41,43]。然而，以上的研究局限在奶牛中，亟待開展其他小品種奶畜中的工作，這樣可以獲得更多關于家畜負能量平衡中機體代謝調(diào)整的信息[32,41]。

奶牛乳腺炎不僅涉及受感染的奶牛的健康和福利問題，同時，治療中所使用的藥物在牛奶中也可能有所殘留，這也是牛奶質(zhì)量安全的威脅因素[43]。因此，尋找奶牛乳腺炎生物標志物的研究工作就顯得極為重要。有研究表明結(jié)合珠蛋白、血清淀粉樣蛋白A和三磷酸腺苷酶可以作為乳腺炎的標記物[43]。然而，這類研究都局限于單個或是幾個代謝物的相關研究。乳腺炎在其發(fā)生和發(fā)展過程中涉及到很多代謝過程，代謝產(chǎn)物包括多種內(nèi)源性和外源性化學分子如多肽、氨基酸、核酸、糖類、有機酸、維生素、茶多酚、生物堿等等，因此很難從少量的信息去全面系統(tǒng)認識乳腺炎的發(fā)生和發(fā)展。質(zhì)譜和NMR技術使我們可以監(jiān)測代謝過程的眾多代謝物質(zhì)[44]。前列腺素是乳腺炎相關的炎癥過程的重要介質(zhì)。在對其相關代謝途徑中代謝物監(jiān)測后發(fā)現(xiàn)，感染病菌的動物所產(chǎn)奶中血栓素A2，前列腺素E2以及牛奶前列環(huán)素等花生四烯酸代謝產(chǎn)物含量增加。這些代謝物的濃度增加，表明它們在大腸桿菌釋放致炎癥因子引起乳房炎炎癥反應的病理生理過程中起到了重要介導作用[45]。Hettinga等[46]使用GC-MS方法發(fā)現(xiàn)了患乳房炎奶牛與健康個體所產(chǎn)奶中的乙酸乙酯和乙酸等揮發(fā)性代謝物含量存在顯著差異。這個研究也證明了通過奶中代謝物譜的檢測可以追溯動物的健康狀況。其后的研究表明這些揮發(fā)性代謝產(chǎn)物主要由病原菌誘導形成，而且這些代謝產(chǎn)物是由牛血液中酯酶所形成的。此外，因為在患乳腺炎動物所產(chǎn)奶中檢測到酯酶，這表明患乳腺炎動物血液和乳腺之間的屏障泄漏程度增加，這可能就是酯酶參與代謝的物質(zhì)被大量檢測到的原因[47]。然而，也有研究表明處于代謝改變中的奶牛血液和奶代謝組學參數(shù)間聯(lián)系還有不同的結(jié)果[39,43]。因此需要更多的工作來闡明不同體液在不同生理或病理狀態(tài)下的代謝組學特征間的區(qū)別和聯(lián)系。

奶牛常在夏季高溫天氣出現(xiàn)“熱應激”癥狀。這會損害動物健康，降低牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)，導致巨大經(jīng)濟損失。然而，傳統(tǒng)的利用溫濕度指數(shù)等指標來確定奶牛是否處于熱應激狀態(tài)的方法雖然簡便，但并不準確。此外，奶牛熱應激發(fā)生的生理機理目前仍不清楚，熱應激生理狀態(tài)的代謝標記物也不明確[16]?；贚C-MS的血漿靶向代謝組學檢測表明，熱應激造成了泌乳奶牛血漿出現(xiàn)了41種熱應激代謝標記物。其中的13種代謝物，包括三甲胺、葡萄糖、乳酸、甜菜堿、肌酸、丙酮酸、乙酰乙酸乙酯、丙酮、β-羥丁酸、C16鞘氨醇、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿和花生四烯酸，在診斷熱應激狀態(tài)時有較高的敏感性和特異性，這些物質(zhì)可能是診斷奶牛是否處于熱應激狀態(tài)的潛在生物標記物。此外，這些潛在的診斷標記物也參與碳水化合物、氨基酸、脂類以及腸道微生物來源的代謝途徑，表明了熱應激影響奶牛的各類代謝途徑[48]。Tian等[15-16]比較和整合分析了熱應激和非熱應激條件下牛奶樣品所測定的LC-MS和NMR數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)了53個可用于熱應激診斷的生物標記物。它們分別參與了機體碳水化合物、氨基酸、脂類以及腸道微生物的代謝途徑。在與已有的研究結(jié)果比較后發(fā)現(xiàn)，熱應激前后，乳酸、丙酮酸、肌酸、丙酮、β-羥基丁酸、三甲胺、油酸、亞油酸磷脂酰膽堿和卵磷脂在牛奶和血漿中存在顯著相關性，這提示了熱應激使得血-奶屏障通透性增強。關于熱應激奶代謝組學的研究已經(jīng)取得一些進展，但以上的研究也只是篩查了熱應激變化后在不同體液中的代謝物變化。因此，需要進一步的試驗來驗證這些標記物是否確實可以起到指征處于熱應激狀態(tài)中機體代謝變化的作用。另外，還需要研究來闡明不同動物類群和不同檢測樣品間的熱應激代謝標記物的異同。最后，要在實際應用中評估這些生物標志物的可靠性，并盡可能地闡明生物標志物引起的后續(xù)效應的生理機制。

4 小結(jié)與展望

代謝組學從被廣泛認可為一門學科至今不到二十年時間，因此是一門新興的學科。作為一種具備高通量、高靈敏度、高精確度特點的現(xiàn)代分析技術，在諸多領域得到了大量應用，其研究思想也已經(jīng)取得了巨大的進步和成功，但是仍存在許多不足之處。例如，由于沒有標準數(shù)據(jù)庫作為參考，基于NMR和LC-MS方法的代謝物鑒定還比較困難；樣品的前處理方法和上樣基質(zhì)也不盡相同，這也導致了不同研究結(jié)果間的可比性較差。其次，由于代謝物種類、結(jié)構(gòu)和組成復雜，單一檢測方法很難做到全面檢測。最后也是最重要的不足在于目前還缺乏由代謝組學方法延伸出的并且成熟的研究思想，因此很難用代謝組學去闡明一些基本的科學問題。然而，不可否認的是，系統(tǒng)生物學的研究思想驅(qū)動著試驗方法和分析技術的不斷進步，使得我們有機會從亞細胞、細胞、組織、器官和生物整體等不同層次全面了解生命的內(nèi)涵。傳統(tǒng)的動物營養(yǎng)研究通常依據(jù)少數(shù)指標及其間關聯(lián)來討論問題，無法全面反映機體代謝規(guī)律，同時也很難做到動態(tài)監(jiān)測。這些傳統(tǒng)方法不足之處正好是代謝組學的長處，它能測定與生物體有關的大量小分子代謝產(chǎn)物，依據(jù)這些數(shù)據(jù)得到的代謝圖譜可以反映生理或病理狀態(tài)的全貌，提供了動物代謝調(diào)控機制的更全面的信息。因此，代謝組學正在日益成為動物營養(yǎng)研究的重要系統(tǒng)性方法。此外，隨著經(jīng)濟和社會的高速發(fā)展、人民生活水平的不斷提高，動物產(chǎn)品質(zhì)量安全得到了越來越高的關注度。代謝組學可以全面分析奶品成分和組成，不論是在代謝指紋分析，還是在代謝輪廓分析方面都有著其他檢驗方法所不具備的優(yōu)勢，因此在奶品質(zhì)量安全研究和監(jiān)測領域也有著良好的應用前景。綜上所述，代謝組學本身同時具備的宏觀高通量和微觀檢測的特征能夠幫助我們更加全面了解和掌握奶牛營養(yǎng)、健康狀況、乳品質(zhì)量、乳品加工性能以及奶品安全等信息。代謝組學檢測手段和數(shù)據(jù)分析方法的不斷進步和完善，以及代謝組學與其他組學方法的融合及整合，都將為以奶牛養(yǎng)殖為代表的畜牧業(yè)發(fā)展提供更大的智力支持。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: yangdongzhang1982@163.com

(責任編輯 王智航)

Research Progress on Metabolomics Application in Dairy Cow Nutrition and Milk Quality and Safety

WANG Qian1,2ZHANG Yangdong1,2,3*ZHENG Nan1,2,3LI Songli1,2,3WEN Fang1,2,3ZHAO Shengguo1,2,3WANG Jiaqi1,2,3

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Dairy Products of Ministry of Agriculture (Beijing), Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China; 3. Milk and Milk Products Inspection Center of Ministry of Agriculture (Beijing), Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

Metabolomics can detect changes of metabolites with trait of low molecular weight (usually less than 1 000 u). Based on this, it can be used to study the constituents and variation of the metabolites produced by stimulation of pathological and physiological infectors or gene change. It is a new subject that is developing in the post-genomic era, and is an important part of system biology. At present, it has been widely used in physiology, pathology, pharmacology, animal science, zoology, botany and other fields, but the researches on cow nutrition and milk safety and quality are still relatively less. Starting from basic concept, ideas and methods of metabolomics firstly, this article overviewed the current research on dairy cows’ nutrition, disease, heat stress, milk quality and milk products safety by application of metabolomics.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3035-3043]

metabolomics; cow; nutrition; milk; quality; safety

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.003

2017-02-13

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項資金(nycytx-04-01)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403071)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS12)

王 倩(1977—)，男，安徽滁州人，博士，研究方向為奶牛營養(yǎng)與飼料科學。E-mail: sousawang@163.com

*通信作者：張養(yǎng)東，副研究員，E-mail: yangdongzhang1982@163.com

S852.2

：A

：1006-267X(2017)09-3035-09