劉榮榮，張曉磊，張進順

(河北北方學院病原生物學與免疫學研究所，河北張家口 075000)

剛地弓形蟲棒狀體蛋白18及其作為基因工程疫苗候選分子研究進展

劉榮榮，張曉磊，張進順*

(河北北方學院病原生物學與免疫學研究所，河北張家口 075000)

剛地弓形蟲棒狀體蛋白18(rhoptry protein18,ROP18)是由棒狀體分泌的、屬于棒狀體蛋白2家族的一員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在蟲體入侵和毒力的發(fā)揮方面起著重要作用。論文就ROP18蛋白的結(jié)構(gòu)、毒力和作用機制及其作為基因疫苗候選分子的研究現(xiàn)狀進行綜述。

剛地弓形蟲；棒狀體蛋白18；毒力；作用機制；基因疫苗

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)屬于頂復門原蟲，是專性細胞內(nèi)寄生蟲，是人類重要的機會致病性病原體，尤其對于與T細胞相關(guān)的先天或獲得性免疫缺陷的患者更具有危害性[1]。貓及其他貓科動物是其終宿主，人類及豬、牛、羊等畜禽類動物為其中間宿主。人類感染弓形蟲后在免疫功能良好的患者表現(xiàn)為無臨床癥狀的慢性持續(xù)性感染，蟲體可以包囊形式持續(xù)存在于感染者組織中，如大腦、骨骼肌、心臟等。但是在免疫功能受損的患者，比如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、腫瘤患者和器官移植者等其他免疫功能受到抑制的個體，感染弓形蟲后會對身體健康造成嚴重損害[2],如果CD4+T細胞數(shù)小于200 μL蟲體將會處于有侵襲性的速殖子狀態(tài)[3],速殖子可感染任何類型細胞和組織并在其內(nèi)復制最終導致細胞裂解死亡，進而侵襲臨近正常細胞和組織，可表現(xiàn)為視網(wǎng)膜脈絡炎和腦炎等，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)已將弓形蟲列為食源性感染性寄生蟲[4]，弓形蟲感染引起了全球性的關(guān)注。弓形蟲感染的流行不僅對人類健康產(chǎn)生嚴重危害，而且對畜牧業(yè)造成相當大的經(jīng)濟損失[5]。Luo H等[6]運用間接血凝試驗對江西省動物園內(nèi)的野生動物進行弓形蟲抗體檢測，結(jié)果顯示長頸鹿陽性率為27%，狼的陽性率為20%，河馬的陽性率為17%，凍原天鵝的陽性率為22%，同時用同樣的方法對江西省13個縣境內(nèi)的畜類進行調(diào)查，山羊的陽性率為10%，水牛的陽性率為17%，牛的陽性率為11%。鑒于弓形蟲感染的危害和流行，弓形蟲致病機理的研究和預防弓形蟲感染的疫苗研制引起了廣大學者的重視，研究成果正在不斷刷新。本文就弓形蟲棒狀體ROP18及其作為基因疫苗候選分子的研究進展進行綜述。

1 ROP18的結(jié)構(gòu)、毒力和作用機制

弓形蟲在與宿主接觸并入侵過程中主要有3類細胞器發(fā)揮作用，包括微線體(microneme)、棒狀體(rhoptry)和致密顆粒(dense granule)。棒狀體蛋白在蟲體侵入宿主細胞的初期分泌至納蟲空泡或是插入在納蟲空泡膜上[7]，多數(shù)棒狀體蛋白與蟲株的毒力和蟲體在宿主細胞內(nèi)的增殖有關(guān)[8]。ROP18屬于棒狀體蛋白2家族的一員，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，被認為是重要的毒力決定因子而被廣泛關(guān)注[9]。

1.1 ROP18的結(jié)構(gòu)

了解ROP18的結(jié)構(gòu)是探究其作用機制和研制疫苗的先決條件。生物信息學分析表明ROP18是含有554個氨基酸的親水性分泌蛋白，保守結(jié)構(gòu)區(qū)域有10個，其中含有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化區(qū)域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化位點區(qū)域[10]，證明ROP18是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該蛋白序列C端是含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的疏水區(qū)[11]，N端富含精氨酸，該區(qū)突變的ROP18突變體在蟲體入侵宿主細胞后ROP18不能與納蟲空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)結(jié)合[12]，表明N端富含精氨酸的區(qū)域介導ROP18與納蟲空泡膜的結(jié)合，對于ROP18發(fā)揮關(guān)鍵毒力因子的作用是至關(guān)重要的。ROP18的三維晶體結(jié)構(gòu)呈絲氨酸/蘇氨酸激酶折疊方式，激酶結(jié)構(gòu)域位于187-554位氨基酸之間，有兩個配體結(jié)構(gòu)域，一個為N端223-347位氨基酸之間的蔗糖結(jié)合口袋，另一個為ATP結(jié)合口袋[13]，其中蔗糖結(jié)合口袋中的兩個關(guān)鍵位點ROP18Arg223和ROP18Met284與弓形蟲的毒力直接相關(guān)[14]。

1.2 ROP18的毒力

弓形蟲的基因型主要分為強毒力株Ⅰ型、中等毒力株Ⅱ型和弱毒力株Ⅲ型[15]。研究發(fā)現(xiàn)[16]，將Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型弓形蟲蟲株雜交，篩選出與弓形蟲毒力高度相關(guān)的棒狀體蛋白激酶基因ROP18，該基因位于弓形蟲第Ⅶ號染色體上。ROP18是Ⅰ型弓形蟲在鼠體內(nèi)的重要毒力決定因子[17]，是不同蟲株間毒力差異的原因之一。 將Ⅰ型蟲株的ROP18基因轉(zhuǎn)染Ⅲ型蟲株，結(jié)果使蟲株的增殖速率急劇增大，對小鼠模型的致死力提高4～5個數(shù)量級[18]，證明ROP18 在不同蟲株的毒力調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵蛋白分子之一。

1.3 ROP18的作用機制

弓形蟲在侵入宿主細胞的過程中逐漸在其周圍形成PVM將蟲體包圍，以此來躲避宿主的殺傷機制。免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)是GTP酶家族的一員，也稱p47，Irgb6、Irgb10、Irga6和Irgd是IRGs的四大成員。細胞在正常狀態(tài)下IRGs處于低表達水平，但在IFN-γ的誘導下可高度表達[19]。當蟲體入侵后，宿主的抗弓形蟲適應性免疫反應被激活，T細胞和巨噬細胞產(chǎn)生多種與抗弓形蟲感染相關(guān)的免疫上調(diào)因子如γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和IL-12等，以及下調(diào)因子如IL-4、 IL-6、IL-10 等。在IFN-γ的誘導下，新合成的IRGs被轉(zhuǎn)運至PVM上(轉(zhuǎn)運機制有待研究)[20]，最終使PVM破裂達到清除蟲體的目的。研究表明[21]，在感染弓形蟲90 min之內(nèi)IRGs完成在 PVM 上的積累，是宿主細胞抑制鼠弓形蟲的主要途徑。但Ⅰ型蟲株感染時，ROP18分泌并被運送至PVM上，磷酸化IRGs的一個關(guān)鍵激酶結(jié)構(gòu)域，從而阻止IRGs在PVM的聚集，發(fā)揮毒力作用，打破宿主固有的抗感染機制。其中Irgb6被認為是ROP18磷酸化的特定作用對象[22]。ROP18磷酸化IRGs是通過和ROP5形成復合物滅活I(lǐng)RGs的活性的[23]，ROP5是ROP18的輔助因子，可以將IRGs蛋白鎖定在無活性的GDP結(jié)合狀態(tài)，同時將IRGs上的蘇氨酸位點暴露給ROP18，被ROP18磷酸化，使IRGs上的GTP結(jié)合位點被破壞，IRGs不再被激活，IRGs堆積的級聯(lián)反應不能發(fā)生。最近研究表明[22]，致密顆粒7(GRA7)為ROP18/ROP5復合物的輔助因子，對于ROP18激酶活性的實現(xiàn)和特異性地使Irga6失活是必需的。GRA7通過與ROP5直接結(jié)合而錨定在PVM上，三者共同發(fā)揮作用阻止PV被宿主免疫系統(tǒng)裂解。GRA7的缺失將導致PVM上磷酸化Irga6的IRGs蛋白數(shù)量增多，并且會使蟲株的毒力減弱。

Yamamoto M等[24]發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄因子6β(ATF6β)是ROP18的另一個作用靶點，ATF6β是定位于宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)錄因子，ROP18通過磷酸化ATF6β的至少一個蘇氨酸位點使ATF6β經(jīng)蛋白酶體途徑降解，下調(diào)由CD8+T細胞介導的Ⅰ型獲得性免疫反應，從而干擾宿主的獲得性免疫系統(tǒng)。

此外，ROP18還可以抑制NF-κB信號通路。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB蛋白家族包括p50 (NF-κB1)、p52 (NF-κB2)、p65 (RelA)、RelB和c-Rel等5個亞單位。ROP18N-末端部分與p65的二聚化結(jié)構(gòu)域相關(guān)，ROP18磷酸化p65蛋白的468位蘇氨酸并靶向泛素依賴性途徑將p65降解[25]。除上述作用機制外，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出7種人胎腦cDNA文庫中與ROP18相互作用的因子，包括DDB1、TOR1AIP1、integrin、SLC3A2、TPST2、DERL2和OCIAD1[26]，說明ROP18與宿主的作用機制復雜多樣。

2 ROP18作為基因疫苗候選分子的研究

免疫預防是控制弓形蟲病的有效途徑，基因疫苗是繼全蟲疫苗和亞單位疫苗之后的第三代新型疫苗，已被國內(nèi)外學者廣泛探究和運用。ROP18在弓形蟲入侵和毒力的發(fā)揮方面扮演重要角色，具有較好免疫原性，因此作為抗弓形蟲疫苗的候選蛋白被高度重視和研究。

2.1 ROP18單基因疫苗

張穎等[27]構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pET30a(+)-TgROP18，經(jīng)Western blotting分析表明ROP18能被鼠抗弓形蟲多克隆抗體識別，驗證了ROP18具有良好的抗原性，可以作為疫苗候選分子。Yuan Z G等[28]構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒PVAX1-ROP18免疫昆明小鼠，產(chǎn)生較高水平的抗弓形蟲IgG2a抗體,CD69表達增高，說明ROP18可以刺激小鼠產(chǎn)生CD4+和CD8+T淋巴細胞，激發(fā)體液免疫和Th1型細胞免疫；小鼠存活時間(27.9±15.1 d)較對照組(7 d)明顯延長，證明ROP18具有良好的免疫保護作用。

2.2 復合基因疫苗

復合基因疫苗是將多個不同抗原的編碼基因克隆到一個表達載體上，一次可表達多個抗原達到更多的靶向作用，以此來提高免疫效果。石娜等[29]用重組質(zhì)粒pBudCE4.1-AMA1-ROP18免疫小鼠，結(jié)果顯示復合基因組的小鼠血清抗體OD值明顯高于單基因組(P<0.05)；對小鼠脾細胞培養(yǎng)液中的細胞因子進行測定，結(jié)果表明復合基因組的細胞因子濃度要高于單基因組(P<0.05)；用弓形蟲RH株速殖子攻擊小鼠后，復合基因組的生存率明顯高于單基因組(P<0.05)。陳琳等[30]成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pBudCE4.1-ROP18-MIC2,免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)復合基因組的特異性抗體IgG1和IgG2值、細胞因子IFN-γ和IL-4濃度都高于單基因組(P<0.05)；進行弓形蟲速殖子攻擊后，復合基因組的小鼠生存率也明顯高于單基因組(P<0.05)。說明復合基因的免疫效果存在一定的優(yōu)勢，能產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫。目前商品化的抗弓形蟲疫苗只有用于免疫綿羊的疫苗，用于人的疫苗還未見報道，這是未來研制弓形蟲疫苗面臨的一大挑戰(zhàn)。

綜上所述，關(guān)于宿主和弓形蟲相互作用機制的研究取得了較大成果，但由于弓形蟲生活史和致病機理的復雜性，許多機制還沒有被完全闡明。隨著分子生物學和生物信息學的發(fā)展，相信弓形蟲的免疫機制和致病機理將會得到更深入了解，針對作用機制研制的基因疫苗也將會更加有效。

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2017-04-17

河北省自然科學基金項目(H2013405091)；河北北方學院校級重大課題(ZD201312)

劉榮榮(1990-)，女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事寄生蟲分子生物學研究。*

S852.4

A

1007-5038(2017)12-0104-04