趙 彬，唐亞蘭，陸 珂，曹曉丹，韓 倩，呂 超，王 濤，傅志強，林矯矯, 3，洪 煬*

(1.江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇句容 212400;2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241;3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

文獻綜述

寄生蟲蛋白質磷酸化修飾及磷酸化蛋白質組學研究進展

趙 彬1，唐亞蘭2，陸 珂2，曹曉丹2，韓 倩2，呂 超2，王 濤2，傅志強2，林矯矯2, 3，洪 煬2*

(1.江蘇農林職業(yè)技術學院，江蘇句容 212400;2.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241;3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

蛋白質的磷酸化修飾是生命體內一種重要的且普遍存在的蛋白質翻譯后修飾方式之一，蛋白質的磷酸化和去磷酸化是一種動態(tài)的生物調節(jié)過程，在生命過程中起著重要的作用。論文介紹了蛋白質磷酸化修飾的研究進展及其在寄生蟲領域中的應用，并對其研究前景進行了展望。

磷酸化;寄生蟲;磷酸化蛋白質組學

蛋白質的磷酸化修飾是生物體內一種重要的并且普遍存在的蛋白質翻譯后修飾。它是通過蛋白質磷酸化激酶將ATP的磷酸基轉移到蛋白質特定位點上的過程，也是生物體內重要的共價修飾方式之一。真核生物細胞中主要的磷酸化氨基酸為酪氨酸、絲氨酸和蘇氨酸[1]。其中，磷酸化的絲氨酸最多，蘇氨酸次之，而酪氨酸最少，三者的比例約為1 800∶200∶1[2]。大多數磷酸化蛋白都有多個磷酸化位點，并且發(fā)生磷酸化的位點是可變的，因此，一種蛋白可能有多種磷酸化的形式。在哺乳動物細胞生命周期中，大約有1/3的蛋白質發(fā)生過磷酸化修飾；在脊椎動物基因組中，2%～5%基因編碼的蛋白質是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸酶[3-4]。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特性以及磷酸基團的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾成為真核細胞中一種最普遍的調控方式。蛋白質在蛋白激酶作用下發(fā)生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化，這一可逆過程幾乎調節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化、信號轉導、細胞凋亡及肌肉收縮等過程在內的所有生命活動，因此被形象地描述為細胞生理活動的分子開關[5]。目前已知許多代謝過程異常與蛋白質的磷酸化修飾相關，鑒于其在生命活動中的重要作用，近年來，探索蛋白質磷酸化的奧秘及其對蛋白功能的影響已成為眾多生物學家所關心的內容，在寄生蟲學研究領域也已有一些關于磷酸化蛋白質功能研究的相關報道。

1 寄生蟲蛋白質磷酸化修飾

真核起始因子2B(eIF2B)是參與真核翻譯起始的重要蛋白，也是鳥苷酸交換因子。其在翻譯起始過程中將eIF2上結合的GDP轉換為GTP，使eIF2可以重新參與翻譯起始，而eIF2α亞基的磷酸化修飾能夠抑制真核起始因子2B的功能。Joyce B R等[6]發(fā)現剛地弓形蟲磷酸化的eIF2α對于應激反應具有保守的調控作用，如果將該蛋白第71位的絲氨酸這一保守的氨基酸位點進行突變后，該位點便不會發(fā)生磷酸化修飾。結果發(fā)現突變蟲株在生活史中的宿主細胞外階段會受到影響，并且在體內試驗中，突變蟲株所引起的急性弓形蟲病在發(fā)病時間上會發(fā)生明顯地延遲，表明該位點的絲氨酸磷酸化修飾對蟲體的生長發(fā)育具有重要作用。如果在速殖子的裂解周期中，特別是蟲體在宿主細胞外的這個關鍵時期，將eIF2α及其所在的應激反應通路作為藥物靶標，對于抵抗急性和慢性弓形蟲病的發(fā)生可以產生多重治療效果。Avila C C等[7]對布氏錐蟲eIF2α的磷酸化修飾進行了相關研究顯示，將196位可發(fā)生磷酸化修飾的蘇氨酸突變?yōu)楸彼岷?，其磷酸化修飾受到影響，但是突變后的蟲株仍然可以在小鼠和采采蠅中正常發(fā)育。因此，eIF2α亞基第169位的蘇氨酸磷酸化位點對蟲體的生長發(fā)育不是必須的。

Leykauf K等[8]發(fā)現惡性瘧原蟲的頂端膜抗原1(AMA1)是否被磷酸化在蟲體的入侵過程中具有重要作用。研究顯示該蛋白第610位絲氨酸的磷酸化受環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)調節(jié)的蛋白激酶A(PKA)控制，如果將該位點的絲氨酸突變?yōu)楸彼岫鹪撐稽c無法進行磷酸化修飾，結果會嚴重影響蟲體的入侵過程，提示PKA對瘧原蟲裂殖子的入侵過程具有重要作用。

Mandal G等[9]發(fā)現利什曼原蟲LmjAQP1蛋白的活性受有絲分裂原活化蛋白激酶2(MAPK2)調節(jié)。這兩種蛋白同時表達時與只有LmjAQP1單獨表達時相比，蟲體在低滲的條件下能較快的恢復形態(tài)。試驗還發(fā)現LmjAQP1蛋白197位的蘇氨酸是該蛋白的磷酸化位點，將該位點的氨基酸突變之后，蟲體恢復形態(tài)的速度要明顯變慢。LmjAQP1蛋白的磷酸化修飾能夠使其代謝速度降低進而延長該蛋白活性的發(fā)揮。

Tang Q等[10]發(fā)現剛地弓形蟲蟲體外緣的肌球蛋白A是一類非傳統的單體肌球蛋白，控制著蟲體運動以及侵入和逸出宿主細胞。小分子化合物130038能夠增強蟲體的運動及入侵，使蟲體內鈣離子的水平增加，進一步引起鈣依賴性的肌球蛋白A磷酸化修飾增強。如果將該蛋白中的主要磷酸化位點進行突變后，蟲體在小分子化合物130038作用后的運動能力受到抑制，突變蟲株即使在較高的鈣離子水平下，逸出宿主細胞的速度會明顯減慢。顯示剛地弓形蟲鈣離子依賴的肌球蛋白A磷酸化修飾在蟲體的運動以及侵入和逸出宿主細胞過程中發(fā)揮著重要作。Bonilla-Moreno R等[11]發(fā)現，溶組織內阿米巴原蟲的肌球蛋白輕鏈(EhMLCI)能夠結合重鏈形成有收縮性的肌動球蛋白，進而使阿米巴原蟲具有運動活性。EhMLCI羧基端酪氨酸殘基的磷酸化能夠負調控肌球蛋白的活性。如果將該酪氨酸用苯丙氨酸進行替換，那么蟲體的運動能力會受到影響，因此EhMLCI羧基端酪氨酸的磷酸化/去磷酸化能夠直接影響肌球蛋白的功能。

在血吸蟲中，蛋白的磷酸化修飾對蟲體的生長、發(fā)育、繁殖等生命活動同樣具有重要作用。Davies S J等[12]認為蟲體表面存在有蛋白激酶，這些激酶的活性與信號傳導的受體有重要聯系。他們對曼氏血吸蟲表膜蛋白中蛋白激酶的活性進行了分析，結果發(fā)現雖然在蟲體被提取物中存在許多酪氨酸磷酸化的蛋白，但蟲體表膜蛋白只具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的活性，而沒有明顯的酪氨酸激酶的活性。

酪氨酸蛋白激酶(TK)在信號傳導通路中發(fā)揮著重要作用，它能引起許多生物進程的發(fā)生，如細胞的代謝、增殖、分化以及免疫調節(jié)等，在人類癌癥治療的研究中，也將其作為一種有潛力的藥物靶點進行研究。早期研究發(fā)現，TK與血吸蟲配對后蟲體的分化有關，如雌蟲卵黃腺和卵巢的發(fā)育。阻斷該蛋白的作用可以減緩蟲體的發(fā)育，降低蟲體的產卵能力，進而緩解病理損傷[13-14]。因此該蛋白也被作為潛在的藥物或疫苗靶標。曼氏血吸蟲TK3和TK5都屬于Src家族成員，它們都具有Src特異性激酶的活性而且在蟲體繁殖過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。TK3在雌雄蟲的性腺中都有表達，通過藥物對其抑制可以降低有絲分裂的活性以及雌蟲的產卵能力[17]。TK4屬于Syk激酶家族成員，它主要存在于睪丸和卵巢等生殖器官中。TK4所在的信號通路能夠調節(jié)血吸蟲性腺細胞的增殖和分化。TK6是一個新發(fā)現的Src家族激酶，它能與TK4相互作用并且是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活蛋白[13]。

Yan Y等[18]對曼氏血吸蟲Ste-20樣激酶進行了相關研究，發(fā)現該蛋白可以激活人胚胎腎細胞和爪蟾卵母細胞的Jun N末端激酶(JNK)通路和MAPK級聯反應，它是生發(fā)中心激酶家族的新成員。免疫組化分析結果顯示，該蛋白在成蟲體中含量豐富，在宿主與寄生蟲的相互作用中，其能夠參與宿主MAPK級聯反應的活化。

Walker A J等[19]將曼氏血吸蟲的毛蚴分別暴露于對蟲體具有抗性和適宜性的中間宿主光滑雙臍螺的血淋巴中，然后對毛蚴中酪氨酸的磷酸化情況進行相關研究。結果發(fā)現暴露在適宜性的光滑雙臍螺血淋巴中的毛蚴中，一個56 ku的酪氨酸磷酸化蛋白顯著地增加了5倍，而暴露在抗性的光滑雙臍螺血淋巴中的毛蚴中，該蛋白基本沒有變化。使用酪氨酸激酶的抑制劑染料木黃酮處理毛蚴后發(fā)現，蟲體的發(fā)育情況受到明顯的影響，表明該酪氨酸磷酸化的抑制可以影響毛蚴的發(fā)育。共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現，該蛋白的磷酸化主要發(fā)生在體被。

Ludtmann M H等[20]發(fā)現曼氏血吸蟲蛋白激酶C(PKC)在毛蚴向母胞蚴轉變的前24 h內被磷酸化，在經過31 h和48 h的發(fā)育后，該蛋白的磷酸化分別降低了72%和86%。將PKC去磷酸化后，可以加速毛蚴向胞蚴階段的轉化。提示PKC的磷酸化能夠抑制毛蚴向母胞蚴的轉化。磷酸化的PKC主要分布在神經塊、分泌囊泡、體被、纖毛板以及胚細胞中。

Long T等[21]對曼氏血吸蟲的一種有絲分裂激酶-Polo樣激酶(SmPlk1)的功能進行了相關研究，該蛋白在有絲分裂過程中具有保守功能，在爪蟾的卵母細胞模型中，其182位的蘇氨酸被磷酸化后可以引起有絲分裂的發(fā)生。該基因在原胚細胞中的表達量較高，原位雜交的結果顯示，該基因存在于雌蟲的卵母和卵黃細胞中以及雄蟲的精原細胞中。體外使用Plk的抑制劑BI2536作用于蟲體后，蟲體的性腺發(fā)生了改變，并且影響到卵細胞和精子的生成。

Swierczewski B E等[22]發(fā)現曼氏血吸蟲cAMP依賴的蛋白激酶催化亞基(SmPKA-C)對蟲體的生存活力具有重要影響。試驗發(fā)現該基因在尾蚴和雌性的成蟲中高表達，在體外用PKA的抑制劑H-89或PKI 14-22酰胺酶對尾蚴進行處理后，可以導致尾蚴的活力降低，而對成蟲進行處理后，能夠抑制蟲體的產卵能力并且該過程具有劑量依賴性。在小鼠模型中，曼氏血吸蟲產卵量的減少也與蟲體內該基因的表達下降以及PKA酶活力的降低有關，并且在該基因的表達恢復正常和PKA酶活力恢復正常后，蟲體的產卵量也恢復正常。

Ressurreicao M等[23]對曼氏血吸蟲p38 MAPK在毛蚴向母胞蚴轉化過程中所起的作用進行了相關研究。他們發(fā)現在體外發(fā)育的前4 h，該蛋白的磷酸化水平比較低，當培養(yǎng)了19 h和28 h后，該蛋白的磷酸化水平顯著增加了2.7倍和3.7倍。免疫組化顯示該蛋白主要分布在蟲體體被、神經塊和胚細胞中。用抑制劑SB203580抑制該蛋白的活性后，能夠顯著增加毛蚴向母胞蚴轉化的比例。反之，如果用茴香霉素增加該蛋白的活性，則會出現相反的結果。

2 寄生蟲磷酸化蛋白質組學

由于生物體中磷酸化蛋白所涉及到的生物進程通常都是錯綜復雜的，例如細胞信號傳導通路網絡等，傳統地針對單條信號傳導通路以及單個磷酸化蛋白分子的研究策略存在一定的局限性，因此利用蛋白質組學的理念和分析方法研究蛋白質的磷酸化修飾，可以從整體上觀察細胞或組織中蛋白磷酸化修飾的狀態(tài)及其變化，進而分析特定磷酸化修飾對生命過程的調控作用及分子機制，由此派生出磷酸化蛋白質組學(phosphoproteomics)的概念。其研究內容主要包括：①磷酸化蛋白質和肽段的檢測；②磷酸化位點的鑒定；③磷酸化蛋白質的定量。通過該研究，可以揭示蛋白激酶和磷酸酶分別對蛋白磷酸化和去磷酸化的作用。

細胞內磷酸化蛋白的豐度較低，因此在規(guī)?；淖R別和鑒定生物體內磷酸化蛋白質的表達及其變化之前，首先需要對磷酸化蛋白及其酶解肽段進行富集。目前常用的方法為固相金屬親和層析法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)、金屬氧化親和層析法(metal oxide affinity chromatography,MOAC)、強陽離子交換色譜(strong cation exchange chromatography,SCX)、免疫沉淀法(immunoprecipitation,IP)、氨基磷酸酯化學衍生法(phosphoramindate chemistry,PAC)等。近年來，在寄生蟲研究領域，已經有不少學者利用上述的純化方法對不同蟲體的磷酸化蛋白質組進行了相關研究。

Nakayasu E S等[24]利用SCX的富集法對克氏錐蟲的短膜期蟲體進行了磷酸化蛋白組學的研究，一共鑒定到了237個磷酸化肽段，隸屬于119種不同的蟲體蛋白。其中明確匹配上的220個磷酸化位點中有148個是絲氨酸，57個是蘇氨酸，8個是酪氨酸。免疫沉淀法和免疫印跡法確認了至少7個磷酸化的酪氨酸蛋白。這些鑒定到的磷酸化蛋白主要與細胞結構、運動性、物質轉運、致病機制、DNA/RNA/蛋白代謝和信號通路等相關。

Hem S等[25]對杜氏利什曼原蟲無鞭毛體的磷酸化蛋白組進行了分析，通過IMAC法對磷酸化蛋白進行富集和質譜分析，共鑒定到445個磷酸化蛋白，這些蛋白主要參與蛋白的代謝、應激反應和信號轉導通路。又利用二氧化鈦(MOAC法)對磷酸化肽段進行富集和質譜鑒定，在157個特異的磷酸化肽段中發(fā)現了181個特異的磷酸化位點，這些肽段來源于126個不同的蛋白中。在對錐蟲以及高等真核生物的磷酸化位點的保守區(qū)進行多序列比對和聚類分析后發(fā)現，杜氏利什曼原蟲特異的磷酸化蛋白殘基與人的同系物具有較高的相似性，但是特異的磷酸化位點有明顯的不同，這對設計新的抗寄生蟲干預措施具有重要意義。

Treeck M等[26]通過IMAC法對惡性瘧原蟲的裂殖體和剛地弓形蟲的速殖子的磷酸化蛋白組進行了相關研究，分別鑒定到5 000個和10 000個未知的磷酸化蛋白位點，提示蛋白的磷酸化修飾是這兩種寄生蟲中廣泛存在的一種調節(jié)機制，并且發(fā)現該修飾在蟲體的體內和體外蛋白中都存在，這可能與蟲體的排泄分泌活動有關。兩種蟲體中都發(fā)現了磷酸化的酪蛋白，惡性瘧原蟲具有不一樣的磷酸化基序，它主要是由基因組中的高A/T形成的。

Panichaku T等[27]利用IMAC方法對感染及未感染間日瘧原蟲的生長狀態(tài)的紅細胞磷酸化蛋白質組進行了比較分析，發(fā)現埃茲蛋白、輔肌動蛋白1和Rho激酶這3個磷酸化蛋白發(fā)生了顯著得變化。其中生長紅細胞的埃茲蛋白在與感染紅細胞裂解無接觸48 h～72 h后，磷酸化修飾減弱甚至消失。結果表明，間日瘧原蟲可通過下調埃茲蛋白的磷酸化水平來抑制紅細胞的生長，進而導致瘧疾引起的貧血癥狀。

Solyakov L等[28]結合磷酸化蛋白組和激酶組學的信息，通過反向遺傳學的方法驗證了惡性瘧原蟲無性繁殖期蛋白磷酸化的重要作用。他們將IMAC法和二氧化鈦富集相結合，最終發(fā)現了存在于650個蟲體蛋白上的1 177個磷酸化位點，這些蛋白主要參與DNA合成、轉錄、代謝、免疫逃避以及細胞吸附等生物進程。許多蟲體蛋白激酶能在自身的調節(jié)殘基上磷酸化，例如糖原合成激酶3和CDK-樣激酶3。其中CDK-樣激酶3第526位氨基酸的磷酸化對于該酶整體活性的發(fā)揮具有重要影響。該試驗同時發(fā)現36個寄生蟲蛋白激酶對于惡性瘧原蟲的無性繁殖階段具有重要作用。

Lasonder E等[29]利用二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對惡性瘧原蟲胞外的裂殖子進行了磷酸化蛋白質組分析，試驗共鑒定到1 765個磷酸化位點，其中有785個磷酸化位點在裂殖體中檢測不到。生物信息學分析顯示，這些差異的磷酸化蛋白主要與入侵過程有關。裂殖子磷酸化蛋白的相互作用網絡分析顯示，119個蛋白具有與細胞的運動及入侵相關的潛在作用，這些蛋白受到PKA、CDPK、PI3K及elF2激酶參與的翻譯過程的調節(jié)。這些磷酸化蛋白的差異可能是由于惡性瘧原蟲在從胞內的裂殖體向胞外的裂殖子轉變過程中，蟲體不能通過降解血紅蛋白來獲得氨基酸而處于“饑餓”狀態(tài)造成的。

Tsigankov P等[30]利用二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對杜氏利什曼原蟲無鞭毛體和前鞭毛體的磷酸化蛋白質組進行了分析鑒定，共鑒定到627種發(fā)生磷酸化修飾蛋白中的1 614個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化模體“SF”在無鞭毛體中顯著富集，鑒定到的一些酪氨酸磷酸化蛋白主要參與信號轉導的通路中。在鑒定到的磷酸化蛋白中，超過半數的蛋白具有期別特異性或者在無鞭毛體和前鞭毛體中是呈現顯著性差異的。

在日本血吸蟲磷酸化蛋白質組的研究中，Luo R等[31]通過IMAC法對14 d童蟲和35 d的日本血吸蟲蟲體蛋白中的磷酸化位點和磷酸化蛋白進行了相關研究，結果發(fā)現蟲體中的92種蛋白含有127個不同的磷酸化位點。將14 d童蟲和35 d的日本血吸蟲蟲體蛋白中的磷酸化肽段進行比較分析后，在兩個階段蟲體中找到30種共有的磷酸化蛋白。這些蛋白包括一些信號分子和酶類，例如14-3-3蛋白、熱休克蛋白90、肽基脯氨酰異構酶G、磷酸果糖激酶、胸苷酸激酶等。另外，試驗還發(fā)現這些蛋白磷酸化位點的基序在生物進化上是比較保守的。

Cheng G等[32]通過二氧化鈦富集磷酸化蛋白的方法對日本血吸蟲14 d和35 d的雌雄蟲體內的磷酸化蛋白質組進行了分析，一共鑒定到180個磷酸化肽段，代表了148個蛋白，進一步的分析顯示，熱休克蛋白90在這兩個階段的蟲體和雌雄蟲體中都能檢測到，因此推測該蛋白能夠直接或間接的與其他檢測出的信號分子相互作用，并在調節(jié)蟲體的發(fā)育過程中具有重要作用。同時，對一些檢測到的性別特異性的磷酸化蛋白通過免疫組化或實時定量PCR進行了驗證。

通過之前的磷酸化蛋白質組學研究發(fā)現，寄生蟲體內同樣存在大量參與其生命活動的磷酸化蛋白、肽段以及磷酸化位點，這些信息為我們深入研究蛋白的磷酸化修飾和寄生蟲生長發(fā)育中的作用及調控機制提供了重要基礎。

3 展望

蛋白質的磷酸化和去磷酸化過程在生命活動過程中發(fā)揮著重要的作用，使蛋白質磷酸化的相關研究成為蛋白質翻譯后修飾研究的熱點。大量試驗表明，一些關鍵蛋白或者重要氨基酸位點的磷酸化修飾或去磷酸化，或者蛋白激酶/磷酸酶的活性受到抑制/過表達時，蛋白質的磷酸化過程會發(fā)生紊亂并嚴重影響寄生蟲正常的生理狀態(tài)，如寄生蟲的入侵與逸出、自身信號通路的異常等。因此，對蛋白質的磷酸化修飾進行深入的研究對了解寄生蟲磷酸化修飾蛋白在蟲體寄生和生長發(fā)育過程中的作用具有重要意義，也可為篩選抗寄生蟲病的候選疫苗分子和新藥靶提供試驗依據。

隨著蛋白質組學研究技術的不斷發(fā)展，磷酸化蛋白質組學已成為一門新的交叉學科和研究熱點，它可以為我們提供大量可供深入分析研究的磷酸化、去磷酸化相關蛋白的數據。但前期研究在技術上還存在一定的局限性，例如蛋白質的磷酸化是一個不穩(wěn)定的動態(tài)過程，磷酸化蛋白的豐度較低，其磷酸基團容易在分離過程中丟失等。因此，對磷酸化蛋白特異、高效的分離、富集技術及無損、高靈敏度的檢測鑒定技術的開發(fā)會推動磷酸化蛋白質組學研究進一步發(fā)展。

近年來，隨著生物質譜技術的迅速發(fā)展，磷酸化蛋白質組學研究已經進入定量磷酸化蛋白質組和比較磷酸化蛋白質組分析階段。其不僅能檢測磷酸化蛋白及其位點，還能對磷酸化蛋白的差異進行定量分析，進而可以找到可能是生物體處于不同狀態(tài)的關鍵磷酸化蛋白分子或磷酸化位點，經定量分析后得到的差異磷酸化蛋白或磷酸化位點可能是造成生物體處于不同狀態(tài)的重要分子，目前已經有學者開始采用該技術方法開展相關研究。

目前定量的磷酸化蛋白組分析策略可以依賴穩(wěn)定同位素標記技術，在細胞培養(yǎng)過程中對氨基酸的穩(wěn)定同位素進行標記(stable isotope labeling by amino acid in cell culture,SILAC)。該技術將含有輕、重同位素型的氨基酸培養(yǎng)液分別對細胞進行培養(yǎng)，使細胞內的蛋白被同位素穩(wěn)定標記，提取細胞蛋白并將其等量混合，酶切后結合磷酸化肽段的富集技術和串聯質譜技術進行鑒定，通過分析不同同位素標記的磷酸化肽段的相對量而確定磷酸化蛋白的相對量。此外，美國ABI公司開發(fā)了一種多肽體外標記技術——同位素標記相對和絕對定量技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)。該技術采用4種或8種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，然后進行串聯質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量。iTRAQ試劑由報告基團、質量平衡基團和肽反應標記試劑基團組成，形成4種或8種相對分子質量均為145的等量異位標簽，與氨基酸N端及賴氨酸側鏈連接的胺標記。在串聯質譜中，報告基團、質量平衡基團和多肽反應基團之間的鍵斷裂，質量平衡基團丟失，帶不同同位素標簽的同一多肽產生質量不同的報告離子，根據報告離子的豐度進行不同樣品間相同肽段的定量。

隨著定量磷酸化蛋白質組的出現，許多科學家開始嘗試利用上述方法來尋找影響生物體的關鍵磷酸化蛋白。

Kruger M等[33]利用SILAC的方法對胰島素信號通路中所有酪氨酸磷酸化級聯反應的變化情況進行了分析，發(fā)現了40個胰島素誘導的效應因子及胰島素信號通路中的7個新蛋白，揭示了胰島素信號網絡中蛋白質磷酸化等翻譯后修飾和下游靶蛋白的改變與細胞生長、分化之間的關系3。Rinschen M M等[34]通過SILAC對腎集合管細胞中的磷酸化蛋白組的差異進行了比較分析，試驗發(fā)現加壓素能夠降低JNK1/2和細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化作用，而這兩種蛋白的磷酸化又都可以進一步調控水通道蛋白-2第261位氨基酸的磷酸化，因此證明加壓素是通過降低該位點的磷酸化作用而發(fā)揮作用的。Chen C等[35]通過SILAC法對不同細菌毒力因子誘導的巨噬細胞磷酸化蛋白質組的差異進行了相關研究。生物信息學分析的結果顯示，兩者的差異主要體現在與免疫相關的信號通路中，包括Erk1/2信號通路、，Jak/Stat信號通路、Jnk信號通路等。Batista M等[36]在研究中發(fā)現，布氏錐蟲有絲分裂原活化蛋白激酶樣激酶(MAPKLK1)對蟲體的增殖具有重要作用，如果利用RNA干擾技術對該基因的轉錄水平進行敲除，蟲體的生長會明顯減慢。鑒于該蛋白可能在蟲體蛋白的磷酸化過程中發(fā)揮著重要作用，作者利用二氧化鈦富集磷酸化肽段的方法并結合SILAC對干擾前后蟲體磷酸化蛋白質進行了分析，結果顯示，一共鑒定到1 756個磷酸化位點，其中384個之前沒有報道。雖然該蛋白對蟲體具有重要作用，但是在磷酸化蛋白及位點上并沒有發(fā)現太大差異。

迄今為止，寄生蟲磷酸化蛋白組學上的研究大都還是從整體上分析蟲體中磷酸化蛋白、肽段及其磷酸化位點，而通過比較磷酸化蛋白組的方法尋找影響蟲體的關鍵磷酸化蛋白研究國內外報道較少，相信在不久的將來這一方法會在寄生蟲學研究領域得到廣泛應用。

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ProgressonProteinPhosphorylationandPhosphoproteomicsofParasites

ZHAO Bin1, TANG Ya-lan2, LU Ke2, CAO Xiao-dan2, HAN Qian2, Lü Chao2, WANG Tao2, FU Zhi-qiang2, LIN Jiao-jiao2,3, HONG Yang2

(1.JiangsuVocationalCollegeofAgricultureandForestry,Jurong,Jiangsu,212400,China;2.ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Shanghai,200241,China;3.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,Yangzhou,Jiangsu,225009,China)

Protein phosphorylation is one of the most important and widespread post-translational modifications in many cellular processes.Some key regulatory functions such as phospho-signalling cascades are regulated via protein phosphorylation/dephosphorylation in a complex and dynamic manner.The research progresses of protein phosphorylation and its applications in parasitology were reviewed,and the prospect of this study was also discussed in this paper.

phosphorylation;parasite;phosphoproteomics

2017-03-07

國家自然科學基金青年基金項目(31402192)

趙 彬(1982-)，男，黑龍江人，講師，碩士，主要從事預防獸醫(yī)學研究。*

S852.7;S852.33

A

1007-5038(2017)10-0092-06