濮黎萍 陳富美 趙秀玲 王煥景 候振 徐壯壯 張鵬飛 張明

（廣西大學動物繁殖研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004）

牛卵母細胞及著床前胚胎發(fā)育的蛋白質(zhì)組學研究進展

濮黎萍 陳富美 趙秀玲 王煥景 候振 徐壯壯 張鵬飛 張明

（廣西大學動物繁殖研究所 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004）

蛋白質(zhì)組學作為一種能夠全景式展示特定生物學過程的蛋白質(zhì)表達譜的高通量研究手段，正被應用到越來越多的研究領(lǐng)域。牛的卵子發(fā)生以及著床前胚胎的生長發(fā)育都離不開蛋白質(zhì)的一系列變化，通過蛋白質(zhì)組學的研究手段可對牛卵母細胞成熟以及胚胎發(fā)育分子機制進行研究。前人通過構(gòu)建成熟前后的卵母細胞或不同時期的著床前胚胎等的蛋白質(zhì)組表達譜，來獲得與卵母細胞成熟相關(guān)的標志蛋白，并對這些標志物進行驗證和分析，將有利于理解牛卵母細胞成熟、體外受精及著床前胚胎發(fā)育的分子機制，為提高牛卵母細胞的成熟率以及胚胎的發(fā)育率及提高牛繁殖率等奠定基礎。主要從雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳、色譜技術(shù)以及質(zhì)譜技術(shù)等蛋白質(zhì)組學研究手段為切入點，對蛋白質(zhì)組學在牛卵母細胞和著床前胚胎發(fā)育過程中的研究進展進行綜述，為進一步研究牛卵母細胞及附植前胚胎提供參考。

蛋白質(zhì)組；卵母細胞；著床前胚胎

哺乳動物卵原細胞的增殖和卵母細胞的形成均是在胎兒娩出前或者娩出后不久完成的［1］。牛的卵原細胞增殖大多會在胎兒期的前半期完成。卵原細胞經(jīng)過最后一次有絲分裂得到一個初級卵母細胞（Primary oocyte），初級卵母細胞經(jīng)發(fā)育調(diào)控后進行成熟分裂，并在初情期到來之前一直停留在第一次減數(shù)分裂的雙線期（MetaphaseI，MI）［2］。一般通過激素作用卵母細胞才能恢復分裂，經(jīng)排卵與減數(shù)第一次分裂后靜止在減數(shù)第二次分裂中期減數(shù)分裂中期（MetaphaseII，MII），直到精子、化學或者物理的刺激才能完成減數(shù)第二次分裂，同時在卵母細胞生長過程中已完成了對卵母細胞成熟、受精以及啟動受精卵發(fā)育的相關(guān)RNA和蛋白質(zhì)的合成［3-7］。

研究人員往往從基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平以及某個特定的蛋白質(zhì)來對卵母細胞或者著床前胚胎進行研究。然而有研究證明，卵母細胞的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達水平呈現(xiàn)非線性關(guān)系，而且蛋白質(zhì)的豐度較低時表現(xiàn)的更為明顯［8］。蛋白質(zhì)擔任著生命活動主要承擔者以及體現(xiàn)者的角色，且具有種類多、功能與性質(zhì)各異等特點。因此在對卵母細胞以及著床前胚胎進行研究時，有必要運用蛋白質(zhì)組學對其進行蛋白質(zhì)表達水平的研究。這一定程度的推動了人們對卵子發(fā)生以及著床前胚胎發(fā)育機理的了解。

澳大利亞學者Wilkins等［9］于1994年首次定義了蛋白質(zhì)組（Proteome），它是指一個基因組、一個細胞或者組織表達的全部蛋白質(zhì)［9-10］。在21世紀這個蛋白質(zhì)組學時代，蛋白質(zhì)組學也成為了研究熱點。蛋白質(zhì)組學旨在大規(guī)模水平上對蛋白質(zhì)的特征進行研究，其包括蛋白之間的相互作用、翻譯后修飾以及蛋白表達水平等，從而從蛋白質(zhì)組水平上了解細胞的各種生命活動過程。本文簡單的綜述了一些常用的蛋白質(zhì)研究技術(shù)，以及目前牛卵母細胞和附植前胚胎蛋白質(zhì)組的研究進展，旨為后續(xù)進一步的研究提供參考［11-12］。

1 蛋白質(zhì)組學常用的研究技術(shù)

分析研究蛋白質(zhì)組必定會涉及到蛋白的分離、蛋白的純化、蛋白的定性和蛋白的定量等研究技術(shù)。蛋白質(zhì)組學研究的常用技術(shù)有如下幾個。

1.1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳

O’farrell和Klose在1975年建立了雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳（Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE）。2D-PAGE是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子大小來將蛋白質(zhì)進行分離的［13］。2D-PAGE的優(yōu)勢在于它可以一次性分離上千種蛋白質(zhì)，分辨率高，可更直觀的獲得蛋白質(zhì)等電點、表達豐度的相對量及相對分子量等這些結(jié)果，所以2D-PAGE也是蛋白組分析的主要手段之一［14］。但是2D-PAGE仍存在眾多的不足，包括上樣量要求較多，對極酸性的、極堿性的、低豐度蛋白以及高疏水性蛋白分離不理想等［15-17］。

1.2 色譜技術(shù)

色譜法是利用樣品中各組分溶于流動相后，再與固定相發(fā)生離子、親和吸附等相互作用，從而使各組分從固定相中出來的時間不同，最終達到分離的目的。從流動相的物理狀態(tài)分，色譜法主要包括液相色譜法（Liquid chromatography，LC）與氣相色譜法（Gas chromatography，GC）。LC又可分為液液、液固及超臨界流體色譜法，其中液液色譜法由于流動相及固定相的極性不同又將其區(qū)分為正相與反相液相色譜法。正相主要是將極性較強與中等的化合物分離，而反相主要是將極性較弱與非極性化合物分離。GC不能用于分析大部分熱穩(wěn)定性差與金屬鹽類的物質(zhì)，因此常常借助LC尤其是高效液相色譜法進行分析［18］。

高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）是在液相色譜法上輔以靈敏度高的檢測器、高效固定相、高壓泵及計算機技術(shù)的運用，具有高速、高效、高靈敏及高自動化的優(yōu)勢，可用于分離分析熱穩(wěn)定性差、沸點高以及分子量大的部分無機物與大多有機物，也正可以填補氣相色譜法的弊端。但是在檢測器的檢查范圍、靈敏度與分離效率等方面，特別是在對易揮發(fā)物質(zhì)的分析及氣體的分析方面，GC更加優(yōu)于HPLC［18-20］。

多維液相分離系統(tǒng)是將幾種分離原理特性不同的液相分離方法優(yōu)化并結(jié)合在一起，具有分辨率高、高通量、重復性好、快速及自動化高等優(yōu)勢［19］。多維液相分離系統(tǒng)常常與質(zhì)譜技術(shù)共同使用，達到更好的對蛋白質(zhì)組進行分離、分析及鑒定［18-21］。

1.3 質(zhì)譜

1906年的諾貝爾物理學獎得主Thomson打下了質(zhì)譜分析的基石［22-23］。質(zhì)譜是將離子化的蛋白分子經(jīng)過磁場或者電場后，依據(jù)其質(zhì)荷比不同來確定蛋白質(zhì)或者肽段的分子量［24］。質(zhì)譜的優(yōu)勢在于它自動化高、快速、重復性好及靈敏等。因此，質(zhì)譜成為了鑒定蛋白質(zhì)的主要技術(shù)［25］。

比較常用的質(zhì)譜技術(shù)主要有電噴霧電離質(zhì)譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）及電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）等，這兩種技術(shù)均可以在離子化時基本避免樣品分子的離子碎片產(chǎn)生，使其本身的化學結(jié)構(gòu)得以保持［26］。液態(tài)樣品進行分析時主要使用ESI-MS，且常將其與串聯(lián)質(zhì)譜一起使用［27］。串聯(lián)質(zhì)譜被用來測定氨基酸序列以及鑒定翻譯后蛋白質(zhì)的修飾位點［28］。MALDI-TOF MS主要可以同時分析成千上百的肽段質(zhì)量指紋圖譜，且自動化高，不用純化蛋白質(zhì)，所以在目前鑒定分析蛋白方面最常用［28］。

質(zhì)譜多反應檢測技術(shù)（Multiple reaction monitoring，MRM）是比較前沿的質(zhì)譜分析方法，是由單反應監(jiān)測技術(shù)演變過來的，MRM技術(shù)是在假定或者已知的反應離子信息的基礎上，將不符合規(guī)則的離子信號干擾去除并對符合規(guī)則的離子信號進行記錄，達到有目的性地選擇數(shù)據(jù)進行質(zhì)譜信號的采集，最后經(jīng)過對數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，進而得到質(zhì)譜的定量信息［29-30］。質(zhì)譜MRM技術(shù)具有高重復性、高靈敏度、高準確度以及高特異性等優(yōu)點，成為了目標蛋白進行定量分析的重要技術(shù)手段［31］。

2 牛卵母細胞蛋白質(zhì)組在發(fā)育過程中的研究進展

2004年，Coenen等［32］使用雙向凝膠電泳（Twodimensional electrophoresis，2-DE）技術(shù)研究牛卵母細胞體外成熟過程中的蛋白質(zhì)合成。實驗結(jié)果顯示，牛卵母細胞在體外成熟的過程中，蛋白質(zhì)合成有3種主要模式：0-4 h的成熟初期，4-16 h的生發(fā)泡破裂（Germinal vesicle breakdown，GVBD）向MI轉(zhuǎn)變期，16-28 h的MI期結(jié)束后。在卵母細胞的成熟第4-8 h蛋白質(zhì)合成效率較高，并一直持續(xù)至MI期（8-12 h），然后合成率下降，最后保持相對穩(wěn)定。卵母細胞成熟初期有一半的蛋白質(zhì)開始合成，有許多與GVBD和MII期的維持相關(guān)的新蛋白分別在4-8 h和16-12 h出現(xiàn)。有一些蛋白與受精也相關(guān)，而且15%“管家蛋白”家族的蛋白在0-28 h這整個成熟過程中一直在合成，它們的作用主要是保持卵母細胞的功能及其結(jié)構(gòu)。

2006年，Massicotte等［33］利用2-DE、MALDITOF和MS/MS技術(shù)對牛卵母細胞進行了相關(guān)的研究。實驗結(jié)果獲得蛋白點共550個，并發(fā)現(xiàn)卵母細胞在成熟過程中發(fā)生磷酸化修飾的蛋白有30%-50%，其中在培養(yǎng)過程中有4種蛋白表達變化顯著，包括細胞周期蛋白E2、硫氧還蛋白過氧化物酶、微管蛋白β鏈以及蛋白二硫化合物異構(gòu)酶，且細胞周期蛋白E2表達下調(diào)，硫氧還蛋白過氧化物酶在磷酸化修飾后失活。而胞內(nèi)過氧化物水平的變化可能是由于這些蛋白表達的改變而引起的，因此細胞周期蛋白E2與硫氧還蛋白過氧化物酶可當作卵母細胞減數(shù)分裂成熟的標志分子。

2007年，Memili等［34］利用LC-MS/MS技術(shù)研究了牛的顆粒細胞與未成熟卵母細胞的蛋白質(zhì)組。實驗結(jié)果顯示，顆粒細胞中鑒定得到4 395個蛋白，而未成熟卵母細胞中鑒定得到1 092個蛋白，而且有858個蛋白是顆粒細胞與未成熟卵母細胞所共有的，該研究使5 360個假設的蛋白質(zhì)得到了第一次驗證，并第一次全面的分析了牛的顆粒細胞與未成熟卵母細胞的蛋白組。

2010年，Peddinti等［35］利用差異洗滌分餾和多維色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對牛的顆粒細胞與未成熟卵母細胞進行了蛋白質(zhì)組研究。研究結(jié)果顯示，顆粒細胞共鑒定得到1 247種蛋白，而未成熟卵母細胞共鑒定得到811種蛋白，兩者表達差異顯著的蛋白一共371種。經(jīng)過分析可知，顆粒細胞中的蛋白主要參與代謝、信號傳導以及分子運輸?shù)冗^程。該實驗結(jié)果證明了顆粒細胞可為卵母細胞傳遞特異的信號用以維持卵母細胞的生長以及成熟。

2012年，劉振方等［36］利用2-DE研究了成熟前后的水牛卵母細胞差異蛋白質(zhì)組。實驗結(jié)果檢測出300種蛋白以及差異蛋白質(zhì)共27種，并有8種蛋白被鑒定，其中RREB1、NMP2、HSC71、α-IgG以及HSP60在MII期表達上調(diào)，MVP、GEMIN8以及GCNT2則在MII期表達下調(diào)，為水牛卵母細胞成熟發(fā)育提供了潛在的標記物。

2015年，陳富美等［37］利用LC-MS/MS研究了GV期和MII期的水牛卵母細胞蛋白表達譜。實驗結(jié)果共檢測出574個蛋白，其中有476個蛋白組成細胞成分，487個蛋白有明確的分子功能，有490個蛋白跟生物學進程有關(guān)，為此后研究水牛蛋白質(zhì)組學奠定了基礎。

2016年，陳凌聲等［38］利用2-DE與聚丙烯酰胺凝膠電泳聯(lián)合反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對水牛GV期與MII期的卵母細胞蛋白質(zhì)組進行了研究。實驗結(jié)果分別鑒定得到647個蛋白（GV期）與570個蛋白（MII期），其中兩時期共有蛋白為414個。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)共有蛋白主要集中在能量代謝通路上，可能是為保證完成減數(shù)分裂的原因，而需要在成熟過程中具有一個較高的能量代謝水平。GV期階段特異性蛋白主要存在蛋白酶體、氧化磷酸化和核糖體等KEGG通路上，在細胞成熟過程中蛋白酶體發(fā)揮著舉足輕重的作用，且在GV期的細胞蛋白合成水平和氧化磷酸化都較高。MII期階段特異性蛋白主要參與氨基糖代謝與DNA復制等KEGG通路，可能是為后續(xù)生長發(fā)育做準備。該實驗為研究水牛卵母細胞奠定了基礎。

同年，Chen等［39］利用iTRAQ（Isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)對GV期與MII期的水牛卵母細胞的蛋白質(zhì)譜進行了研究。實驗結(jié)果鑒定出3 763個蛋白，是目前得到的最大的水牛卵母細胞蛋白組。其中GV期卵母細胞與發(fā)育成熟的MII期的卵母細胞差異表達的蛋白有173個，發(fā)育成熟與沒能力成熟的卵母細胞差異表達的蛋白有146個。而且發(fā)育成熟的卵母細胞表達上調(diào)的蛋白同GV期和沒能力成熟的卵母細胞相比，主要參與染色體分配、蛋白運輸以及氧化磷酸化等。此實驗為后續(xù)了解水牛卵母細胞潛在的分子機理提供了有價值的數(shù)據(jù)，而且所得到的蛋白也可作為水牛卵母細胞體外成熟發(fā)展的潛在標志。

3 牛著床前胚胎蛋白質(zhì)組在發(fā)育過程中的研究進展

非常有限的牛著床前胚胎材料使得關(guān)于牛著床前胚胎蛋白組的研究結(jié)果屈指可數(shù)，但早在1989年就有人開始了牛著床前胚胎的研究。Frei等［40］利用1-DE技術(shù)與熒光顯影對牛的卵母細胞和著床前胚胎的蛋白質(zhì)合成進行了分析。實驗發(fā)現(xiàn)著床前胚胎在8-16細胞發(fā)育階段的蛋白質(zhì)合成模式變化顯著，且著床前胚胎的蛋白質(zhì)合成效率在卵母細胞到8-細胞期間平緩的下降，隨后再逐漸的上升至囊胚階段。研究人員后又利用放射性元素標記尿苷來研究RNA的合成效率，結(jié)果證明蛋白質(zhì)合成受母源mRNA的調(diào)控直至8-細胞階段，后面的8-16細胞階段轉(zhuǎn)由合子基因調(diào)控蛋白質(zhì)合成，因此，該試驗證實了8-16細胞階段合子基因轉(zhuǎn)錄被啟動。

2006年，Massicotte等［33］利用2-DE技術(shù)對牛著床前胚胎蛋白質(zhì)表達模式進行了研究。實驗鑒定得到2-細胞期蛋白質(zhì)有291種，其中階段特異性蛋白70種；4-細胞期蛋白質(zhì)有373種，其中階段特異性蛋白83種；8-細胞期蛋白質(zhì)有252種，其中階段特異性蛋白28種。三時期共有蛋白質(zhì)有123種，且這123種蛋白質(zhì)被看作候選的母源性蛋白。后面研究者利用ALDI-TOF-MS技術(shù)鑒定出10種蛋白，其中大多數(shù)在卵巢或者卵子中已被研究過，但是存在卵母細胞中的E-FABP蛋白是新的候選母源性蛋白，且該蛋白是第一次被研究。此研究為母源-胚胎轉(zhuǎn)變過程中蛋白表達模式研究提供了有價值的研究數(shù)據(jù)，同時進一步揭示了母源性蛋白質(zhì)的分子機理。

2012年，Demant［41］利用iTRAQ技術(shù)對不同發(fā)育階段牛胚胎的差異表達蛋白進行了研究。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2-細胞與桑椹胚差異表達的蛋白有28種，且其中的胰島素生長因子2（Insulin growth factor 2，IGF2）mRNA結(jié)合蛋白與Y-box結(jié)合蛋白（Y-box binding protein 2，YBX2）等在2-細胞與桑葚胚中表達存在豐度差異，在桑椹胚和囊胚中跟翻譯與生物合成過程有關(guān)的蛋白質(zhì)表達差異顯著。該研究為胚胎基因組激活的分子機制奠定了基礎。

4 結(jié)語

牛為單胎動物，繁殖周期長，自然繁殖力低。研究牛的繁殖性能以提高牛群的質(zhì)量及數(shù)量進而滿足市場的需求，就必定會研究其卵母細胞。雖然國內(nèi)外許多研究者從重要基因、基因組及轉(zhuǎn)錄組等多個層面對牛的卵母細胞及著床前胚胎進行了大量研究，但是對牛的卵母細胞與著床前胚胎的蛋白質(zhì)組進行研究較少。

目前在研究牛卵母細胞和著床前胚胎的蛋白質(zhì)組方面仍存在許多的問題。首先，牛卵母細胞及胚胎材料有限，且收集細胞較困難。其次，目前牛的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫尚不完善。第三，大量的低豐度蛋白質(zhì)不易被檢測到等。

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，已實現(xiàn)微量甚至單個細胞蛋白質(zhì)組的研究，為牛的微量甚至單個卵母細胞或胚胎蛋白組研究奠定了基礎［42］。此外，利用先進的技術(shù)研究成熟前后卵母細胞或不同時期著床前胚胎等的蛋白質(zhì)組，挑選跟卵母細胞成熟相關(guān)的標志蛋白，將有利于理解牛卵母細胞成熟、體外受精以及著床前胚胎發(fā)育，進而提高卵母細胞的成熟率以及胚胎的發(fā)育率等。

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Advances on the Proteomics of Bovine Oocyte and Preimplantation Embryo Development

PU Li-ping CHEN Fu-mei ZHAO Xiu-ling WANG Huan-jing HOU Zhen XU Zhuang-zhuang ZHANG Peng-fei ZHANG Ming
（State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-Bioresources，Animal Reproduction Institute，Guangxi University，Nanning 530004）

Proteomics，as a high-throughput method for displaying protein expression profiles of specific biological processes in a panoramic view，is being applied in more and more research fields. Bovine oogenesis and development of preimplantation embryo are inseparable from a series of changes in protein，thus the molecular mechanism of bovine oocyte maturation and embryo development can be investigated by proteomics. By establishing the proteomic expression profiles of oocytes before and after maturation as well as preimplantation embryos in different stages，we obtained marker proteins related to oocyte maturation and further validated and analyzed these markers，benefiting to understand the molecular mechanism of bovine oocyte maturation，in vitro fertilization and preimplantation embryo development. It lays a foundation for improving the mature rate of bovine oocyte，the rate of embryonic development and the rate of bovine reproduction. In this paper，the progress of proteomics in the bovine oocytes and development of preimplantation embryos was reviewed from the methods of studying proteomics，such as two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，chromatography and mass spectrometry. To provide reference for further study of bovine oocyte and preimplantation embrv.

proteome；oocyte；preimplantation embryo

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0404

2017-05-18

國家自然科學基金項目（31460603），廣西水牛遺傳繁殖重點實驗室開放課題（SNKF-2015-02）

濮黎萍，女，碩士研究生，研究方向：動物蛋白質(zhì)組學；E-mail：1171728501@qq.com

張明，女，博士，研究方向：胚胎技術(shù)，動物蛋白質(zhì)組學；E-mail：mingzhang@gxu.edu.cn

（責任編輯 李楠）