蘇 龍,梁廣波,呂鳳丹,馮 露,嚴素萍,王雪儒

(玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,廣西玉林 537000)

響應(yīng)面優(yōu)化酶法水解京尼平苷工藝

蘇 龍,梁廣波,呂鳳丹,馮 露,嚴素萍,王雪儒

(玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,廣西玉林 537000)

目的:優(yōu)化京尼平苷的酶解工藝。方法:以京尼平含量為響應(yīng)值,在單因素實驗基礎(chǔ)上,以酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH為實驗因素,采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型,篩選最佳酶解工藝條件。結(jié)果:通過二次回歸模型響應(yīng)面分析,影響京尼平苷酶解的因素按主次順序排列為:酶添加量>酶解溫度>pH>酶解時間;確定京尼平苷酶解最佳工藝條件為酶添加量6.6 mL(約140 U),酶解溫度56.5 ℃,酶解時間150 min,pH4.0,此條件下京尼平含量為4.66 mg/mL,模型方程理論預(yù)測值為4.80 mg/mL,兩者相對誤差小于3%。結(jié)論:采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了京尼平苷酶解的最佳工藝,該工藝方便可行。

京尼平苷,京尼平,β-葡萄糖苷酶,響應(yīng)面,優(yōu)化

京尼平(Genipin)是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物,是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑,可以與蛋白質(zhì)、膠原、明膠和殼聚糖等交聯(lián)制作生物材料,如人造骨骼、傷口包扎材料等,其毒性遠低于戊二醛和其他常用化學(xué)交聯(lián)劑[1]。也可用于治療肝臟疾病、降壓、通便;京尼平還可以緩解II型糖尿病的癥狀[2-5]。京尼平在自然界中的含量很少,直接提取十分困難。孫步祥等[6]發(fā)明了一種從桅子中提取京尼平苷及京尼平的制備方法,通過提取、濃縮、冷凍干燥等步驟制得京尼平,純度為90%以上。該法提取工藝復(fù)雜,且提取過程使用有機溶劑不利于產(chǎn)品的質(zhì)量。目前,京尼平的生產(chǎn)多使用酶解法,即直接利用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷轉(zhuǎn)化生產(chǎn)京尼平。楊丹等[7]從桅子中分離得到高純度(99.5%)的京尼平苷,然后經(jīng)過酶水解京尼平苷20h,京尼平苷的轉(zhuǎn)化率達90%。目前的研究大部分是使用商品化的純酶,價格昂貴,生產(chǎn)成本比較高。本實驗利用自行篩選到的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株羅爾夫青霉PenicilliumrolfsiiHXL發(fā)酵產(chǎn)生的粗酶液直接水解京尼平苷,并采用響應(yīng)面法探討粗酶水解京尼平苷獲得京尼平的最佳工藝條件,節(jié)省了酶的純化,為進一步利用該菌株與中草藥桅子粉共發(fā)酵來生產(chǎn)京尼平提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅爾夫青霉HXL(Penicilliumrolfsii) 本實驗室分離保藏；京尼平苷(純度99%)、京尼平苷(純度90%以上) 成都康邦生物科技有限公司;其它試劑 均為分析純，國藥集團化學(xué)制劑有限公司；粗酶 羅爾夫青霉HXL發(fā)酵獲得；產(chǎn)酶培養(yǎng)基 麩皮3%,酵母膏4 g/L,KH2PO40.2%水楊苷 0.05%,KH2PO40.2 g/L,醋酸鈉0.1 g/L,抗壞血酸0.1 g/L,MgSO40.1 g/L,pH自然,分裝121 ℃滅菌20 min。

Tu21800 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HH-s數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;FE20 Five Easy實驗室pH計、AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗條件

1.2.1 京尼平標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取京尼平標(biāo)準(zhǔn)品0.5 mg(精確至0.0001 g),用蒸餾水溶解于5 mL試管中,稀釋到刻度、搖勻,加入0.2 mol/L 5 mL精氨酸,定容至10 mL,然后100 ℃顯色反應(yīng)10 min,冷卻后分別吸取此液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL試管中,加蒸餾水稀釋到刻度、搖勻,所得濃度為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 μg/mL的溶液,以蒸餾水為參比,在λ=590 nm下進行檢測,在此波長下測定不同質(zhì)量濃度京尼平標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度[8-9]。

1.2.2 京尼平的測定 取酶解液,8000 r/min離心10 min,取其上清液(即含京尼平)2 mL,加入2 mL 0.2 mg/mL的精氨酸溶液,定容至10 mL,100 ℃顯色反應(yīng)10 min,590 nm測其吸光度值[8-9]。

1.2.3β-葡萄糖苷酶粗酶液制備 將保藏的羅爾夫青霉HXL接種至查氏培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d,在超凈工作臺內(nèi)用10 mL無菌水洗脫菌株孢子,制備菌懸液,用移液槍吸取5 mL菌液接入到產(chǎn)酶培養(yǎng)基(250 mL三角瓶裝75 mL培養(yǎng)液),30 ℃,搖床180 r/min,培養(yǎng)144 h。取出發(fā)酵液,8000 r/min離心10 min,得到上清液(即粗酶液)。

1.2.4 酶解單因素實驗 用pH4.0的緩沖液配制濃度為10 g/L的京尼平苷底物,加入粗酶液于一定條件下水浴保溫一定時間,然后測量京尼平的含量。

以京尼平含量為依據(jù),在底物濃度10 g/L及其它參數(shù)不變條件下,分別考察酶添加量(2、4、6、8、10 mL粗酶液,粗酶液酶活為21 U/mL),酶解溫度(45、50、55、60、65 ℃),pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)、酶解時間(60、90、120、150、180 min)對京尼平產(chǎn)量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 依據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇酶添加量、酶解溫度、酶解時間、pH為自變量,根據(jù)Box-Behnken設(shè)計,進行四因素三水平的響應(yīng)面分析實驗,以京尼平含量為響應(yīng)值,利用Design Expert8.06軟件對數(shù)據(jù)進行分析,因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計及水平Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本文作圖采用OriginPro 8.5軟件,響應(yīng)面分析設(shè)計采用Box-Behnken軟件,利用Design Expert 8.06軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 京尼平標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

根據(jù)所獲得的不同京尼平標(biāo)準(zhǔn)品濃度的吸光度,做出京尼平標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。

圖1 京尼平標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of genipin

京尼平標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=0.0197x-0.0015，R2=0.9954,說明該曲線具有一定的線性關(guān)系,檢測線性范圍為0.590～4.783 μg/mL,后續(xù)的實驗可以用該方程計算京尼平的含量。

2.2 酶的添加量對轉(zhuǎn)化京尼平苷的影響

由圖2可知,當(dāng)酶添加量增加到4 mL(約80 U)時,京尼平含量達到3.87 mg/mL,隨著酶添加量的進一步增加,京尼平含量沒有增加,說明在該底物濃度下,酶濃度已經(jīng)趨于飽和,繼續(xù)添加酶液,對京尼平含量沒有影響,故酶添加量為4 mL。

圖2 酶添加量對京尼平苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on the geniposide biotransformation

2.3 酶解溫度對京尼平產(chǎn)量的影響

結(jié)果如圖3所示,當(dāng)酶解溫度為55 ℃時,京尼平含量達到3.93 mg/mL;繼續(xù)提高酶解溫度,當(dāng)酶解溫度為60 ℃時,京尼平含量反而減小,這是因為溫度過高導(dǎo)致酶活力下降;而楊丹等[7]采用諾維信的β-葡萄糖苷酶酶解溫度為30 ℃,酶解時間大大延長,效率下降。故最佳酶解溫度選擇55 ℃。

圖3 酶解溫度對京尼平苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.3 Effect of enzymlysis temperature on the geniposide biotransformation

2.4 酶解時間對京尼平產(chǎn)量的影響

由圖4可知,當(dāng)酶解時間大于150 min后,京尼平含量達到最大值,因為酶解時間過長,酶的催化活性下降,進而對京尼平苷的轉(zhuǎn)化影響不大,故最佳酶解時間選擇150 min;而楊丹等[7]采用諾維信的β-葡萄糖苷酶酶解時間為20 h,酶解時間大大延長,效率下降。

圖4 酶解時間對京尼平苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of enzymlysis time on the geniposide biotransformation

2.5 pH對轉(zhuǎn)化京尼平苷的影響

由圖5可見,當(dāng)溶液為pH4.0時,京尼平含量達到3.97 mg/mL;pH大于或小于4.0,京尼平苷的轉(zhuǎn)化率都下降,故最佳酶解pH選擇4.0。

圖5 pH對京尼平苷轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of different pH on the geniposide biotransformation

2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.6.1 響應(yīng)面實驗結(jié)果 實驗方案及實驗結(jié)果見表2,回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

2. 6.2 結(jié)果分析及模型方程的建立 對表3中數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到自變量與京尼平含量(Y)的二次多項回歸方程為:

Y=4.61+0.67A+0.31B+0.055C+0.28D+0.078AB-0.05AC-0.033AD+0.1BC-0.01BD-0.14CD-1.01A2-0.55B2-0.25C2-0.69D2

對該模型進行方差分析,結(jié)果如表3所示,該回歸模型p<0.0001,方程模型達到極顯著,失擬項p=0.1126>0.05,不顯著;該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.9556,調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9112,變異系數(shù)CV=6.57,以上參數(shù)均說明該模型擬合程度好,實驗誤差小,故該回歸方程模型成立,可以用此模型對京尼平苷酶解條件進行分析及預(yù)測。

2.6.3 響應(yīng)面分析 實驗的各因素方差分析如表3所示。由表3可知,模型一次項A(酶添加量)、B(酶解溫度)、D(pH)極顯著,C(酶解時間)不顯著;二次項A2、B2、D2均處于極顯著水平,C2為處于顯著水平;交互項AB、AC、AD、BC、BD、CD均不顯著。在各影響因素中,A(酶添加量)對京尼平苷酶解的影響最大,其次是B(酶解溫度)、D(pH)和C(酶解時間)。在總的作用因素中,一次項和平方項的影響較大,而交互項的影響較小。經(jīng)Design-Expert 8.0.6優(yōu)化,通過對回歸模型求解方程并考慮實際操作的可行性,修正得出京尼平苷酶解最佳條件為:酶添加量6.6 mL,酶解溫度56.5 ℃,酶解時間150 min,pH4.0,在此條件下京尼平含量的預(yù)測值為4.80 mg/mL。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

注:*p<0.05,差異顯著;**p<0.001,差異極顯著。

2.6.4 驗證實驗 為檢驗響應(yīng)面法優(yōu)化后的工藝可靠性,在上述最佳酶解條件下,進行3組平行實驗,所得京尼平含量均值為4.66 mg/mL,與理論預(yù)測值的相對誤差為2.92%,說明運用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準(zhǔn)確可靠,能真實地反映各因素對京尼苷酶解的影響。

3 結(jié)論與討論

通過單因素實驗和響應(yīng)面實驗確定了酶法水解京尼平苷獲得京尼平的最佳工藝條件為:酶添加量6.6 mL,酶解溫度56.5 ℃,酶解時間150 min,pH4.0,此條件下京尼平含量為4.66 mg/mL,而回歸方程所得的京尼平含量理論預(yù)測值為4.80 mg/mL,兩者相對誤差為2.92%。此外,影響京尼平苷酶解的因素按主次順序依次為:酶添加量>酶解溫度>pH>酶解時間。

本文通過單因素和響應(yīng)面實驗法對酶解法水解京尼平苷轉(zhuǎn)化京尼平的條件進行了優(yōu)化,在最優(yōu)條件下,京尼平含量達到4.66 mg/mL,比付巖[10]等人利用泡盛曲霉發(fā)酵生產(chǎn)京尼平,產(chǎn)量8.5 g/L低,而且酶活也比較低,相信經(jīng)過對羅爾夫青霉菌進行改造,利用該菌株分泌的β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷產(chǎn)生京尼平還是具有很好的應(yīng)用前景,也可以利用該菌株與中草藥梔子粉共發(fā)酵生產(chǎn)京尼平。另外,由于本實驗中用到酵母膏,發(fā)酵獲得的粗酶液中還具有一定的氨基酸,酶解出來的京尼平與其中的氨基酸反應(yīng)形成了梔子藍素,使得京尼平的產(chǎn)量也受到一定的影響;為了解決這個問題,有研究者利用耐有機溶劑的β-葡萄糖苷酶進行兩相催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化京尼平苷產(chǎn)生京尼平[11-12],或者利用固定化細胞發(fā)酵生產(chǎn)京尼平[13],取得比較好的效果;這給本研究提供了很好的思路,可以通過菌株的選育,把羅爾夫青霉改造成耐有機溶劑的菌株,可以通過兩相發(fā)酵法來避免發(fā)酵產(chǎn)生的京尼平與培養(yǎng)基中的氨基酸或者蛋白質(zhì)起不可逆的反應(yīng),提高京尼平的產(chǎn)量。同時也可以對羅爾夫青霉產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶進一步改造其催化特性,尤其是對不溶性活性成分催化活性的改造,是對中草藥資源研究和中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項重要內(nèi)容,具有重大的現(xiàn)實意義。

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Optimization of enzymlysis conditions of geniposide using response surface methodology

SU Long,LIANG Guang-bo,LV Feng-dan,FENG Lu,YAN Su-ping,WANG Xue-ru

(College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University,Yulin 537000,China)

Objective:This study aimed to optimize the enzymlysis conditions of geniposide. Method:Genipin concentration as response value,the experimental factors including enzyme concentration,enzymlysis temperature,pH and enzymlysis time were investigated to optimize the enzymlysis conditions of geniposide,and the mathematical mode was established by response surface method(RSM). Result:The optimum conditions obtained by RSM were as follows,genipin yield was most significantly affected by enzyme concentration,followed by enzymlysis temperature,pH and enzymlysis time. The concentration ofβ-glycosidase was 6.6 mL(140 U),enzymlysis temperature was 56.5 ℃,pH was 4.0,enzymlysis time was 150 min. Under the optimal conditions,the predicted genipin concentration by mathematical model was 4.80 mg/mL,while the experimental concentration was 4.66 mg/mL,with a difference of less than 3%. Conclusion:The optimum enzymlysis conditions of geniposide by RSM was convenient and feasible.

geniposide;genipin;β-glucosidase;response surface;optimization

2016-10-28

蘇龍(1978-)，男，碩士，副教授，研究方向：工業(yè)微生物及發(fā)酵工程，中草藥微生物轉(zhuǎn)化，E-mail:gxsulong@163.com。

廣西自然科學(xué)基金項目(青年項目)(2013GXNSFBA019178)；廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項目(一般項目)(2013YB195)；廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目(201610606027)；廣西高等教育本科教學(xué)改革工程項目(2015JGB351)；玉林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(玉市科攻1621021)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)07-0226-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.036