徐建平,蔡錦源,李林軒,王萌璇,張彩云,梁豪榮,韋坤華，*,李旻輝,,*

(1.包頭醫(yī)學院,內蒙古包頭 0140403;2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,廣西南寧 530023;3.廣西科技大學鹿山學院,廣西柳州 545616)

徐建平1,蔡錦源2,3,李林軒2,王萌璇3,張彩云3,梁豪榮3,韋坤華2，*,李旻輝1,2,*

(1.包頭醫(yī)學院,內蒙古包頭 0140403;2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,廣西南寧 530023;3.廣西科技大學鹿山學院,廣西柳州 545616)

總評歸一值,山豆根莖多糖,微波預處理-超聲波提取,抗氧化活性,清除亞硝酸鹽活性,穩(wěn)定性

微波預處理-超聲波提取法[1]可較好地結合微波內加熱破壁破膜和超聲波空化、機械攪拌等優(yōu)點,可快速高效地從植物中提取有效成分,已應用于香菇多糖[1]和山茱萸多糖[2]的提取。總評歸一值(Overall desirability,簡稱OD)法[3]可較全面地將多個指標綜合為一個指標,再結合正交設計或響應面法進行工藝優(yōu)化,為多指標的藥用植物有效成分提取工藝優(yōu)化提供了新的研究思路。

山豆根(SophoratonkinensisGapnep.),又名廣豆根[4-5],植物多糖含量約占干藥材重量的3%～8%。近年來,山豆根多糖因其具有調節(jié)免疫、清除肝炎病毒和抗腫瘤等生物活性[6-8],備受廣大學者關注。但目前對山豆根多糖的研究主要集中在根部[9],山豆根莖枝的產量遠大于根部,如能對其進行有效的綜合開發(fā)利用,將有助于推動山豆根藥材的綜合開發(fā)利用。前期實驗研究表明山豆根莖部也富含多糖類成分,但目前尚未有關山豆根莖部多糖的提取和生物活性等方面研究的文獻報道。本研究旨在以多糖得率和多糖純度的總評歸一值為指標,優(yōu)選山豆根莖多糖的微波預處理-超聲波提取工藝,并對粗多糖進行抗氧化活性、清除亞硝酸鹽活性和穩(wěn)定性三種生物活性進行研究,為篩選山豆根莖多糖的提取方法以及綜合開發(fā)利用山豆根莖多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山豆根莖枝 采自廣西藥用植物園實驗田；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、石油醚、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、亞硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸、氯化鋁、氯化鈉、氯化銅、氯化鐵、氯化鈣、VC、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺等 均為分析純。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;G70F20CN3L-C2(B0)格蘭仕Galanz微波爐 廣東格蘭仕微波電器制造有限公司;UV-5100紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;TDL-80-2B低速離心機 上海安亭科學儀器廠;CP225D型精密電子天平(1/10萬) 德國LaiLa。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝線路 山豆根莖→切碎→恒溫烘干(60 ℃)→粉碎過篩(60目)→石油醚回流脫脂→恒溫烘干(60 ℃)→稱量并按比例加入解吸劑(超純水)→微波預處理→按比例加入提取溶劑(超純水)并進行超聲波提取→抽濾→旋蒸濃縮→醇沉(75%乙醇)→離心→固液分離→干燥至恒重(60 ℃)→即得山豆根莖粗多糖。

1.2.2 山豆根莖多糖含量測定、得率和純度計算 采用苯酚-硫酸法[10]測定多糖含量,以吸光度為縱坐標,總糖濃度為橫坐標,回歸方程為:A=0.0531X+0.0083,r=0.9999,多糖濃度在2.5～17.5 μg/mL范圍內線性關系良好。按方法“1.2.1”制備粗多糖,稱重后用蒸餾水復溶并定容,采用苯酚-硫酸法測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算總糖濃度,多糖質量按式(1)計算,多糖得率按式(2)計算,多糖純度按式(3)計算:

W總糖=N×X/(1000M)

式(1)

y(%)=W總糖/M×100

式(2)

Y(%)=W總糖/m×100

式(3)

注:W總糖為多糖質量,g;X為總糖濃度,mg/mL;y為多糖得率,%;M為投料質量,g;m為粗多糖質量,g;Y為多糖純度,%。

1.2.3 總評歸一值計算 以多糖得率和多糖純度為指標,采用Hassan法進行歸一化處理,多糖得率和多糖純度取值越大越好,單指標評價值(d)按式(4)進行計算,總評歸一值[2]按式(5)進行換算。

d=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

式(4)

OD=(d1+d2)/2

式(5)

其中：d為單指標評價值,d1為多糖得率指標評價值,d2為多糖純度指標評價值,Yi為指標中第i個值,Ymin為指標中最小值,Ymax為指標中最大值。

1.2.4 正交實驗設計 在前期實驗的基礎上,固定微波功率700 W和提取溫度60 ℃的條件下,采用正交表L16(45)對解吸劑比、微波時間、料液比、超聲功率和提取時間進行實驗設計,因素與水平見表1。

表2 對比實驗Table 2 Contrast experiment

表1 正交設計實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

1.2.5 對比實驗設計 在正交設計優(yōu)選的最優(yōu)工藝條件的基礎上,將熱水浸提法(a)、超聲波提取法(b)與微波預處理-超聲波提取法(c)進行比較,對比實驗設計見表2。

1.2.6 粗多糖的穩(wěn)定性實驗 按表2的b法和c法分別提取山豆根莖粗多糖,從溫度、金屬離子、食品添加劑和氧化還原劑四方面考察粗多糖的穩(wěn)定性,實驗方案參考史娟[2]和許小向等[11]的方法并略做修改,具體如下:

光照對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液2組,每組各6份,1組在0、2、4、6、8、10 h下見光常溫保存,另一組則避光常溫保存,按方法“1.2.2”測定吸光度。

溫度對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液7份,分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃下避光保溫1 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

金屬離子對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液6份,分別加入2.0 mL超純水和濃度為0.05 mol/L的Na+、K+、Ga2+、Cu2+和Fe3+,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

食品添加劑對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液3份,分別加入2.0 mL超純水、0.05 mol/L的檸檬酸和0.05 mol/L抗壞血酸,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

氧化還原劑對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液14份,分別加入2.0 mL濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的雙氧水和亞硫酸鈉,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

1.2.8 粗多糖清除亞硝酸鹽活性 參考郭小鵬等[14]和李佩艷等[15]的方法并做修改,先配制成濃度為5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液,在錐形瓶中加入2 mL標準溶液和一定體積的粗多糖(或VC溶液),于超聲清洗儀中40 ℃放置10 min,加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液混勻,靜置5 min,加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺,混勻后靜置15 min,最后加蒸餾水定容至50 mL,在538 nm波長處測定吸光度值(A1),以蒸餾水代替標準溶液測定樣品空白對照的吸光度值(A2),以蒸餾水代替粗多糖(或VC溶液)測定標準液空白對照的吸光度值(A0)。亞硝酸鹽清除率按式(6)計算。按優(yōu)選的最優(yōu)工藝提取粗多糖,并稀釋成濃度為0.98 mg/mL,另精密稱取0.0040 g VC,溶解并定容為100 mL,分別取1、2、4、8、12、16、20 mL按上述方法進行測定。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel和Origin7.5等數(shù)據(jù)處理軟件對實驗結果進行處理。

2 結果與分析

2.1 正交實驗結果

按表1進行正交設計,結果見表3。由表3直觀分析可知影響山豆根莖多糖的微波預處理-超聲波提取工藝的順序大小為:提取時間(E)>微波時間(B)>超聲功率(D)>解析劑比(A)>料液比(C),最優(yōu)工藝組合為A2B1C3D2E2,即為解析劑比1∶5 (g/mL)、微波時間30 s、料液比1∶25 (g/mL)、超聲功率140 W和提取時間20 min。由表4可知,提取時間、微波時間和超聲功率對OD值有顯著影響,而解析劑比和料液比對OD值影響不顯著。按最優(yōu)工藝組合進行3次平行提取實驗,此時山豆根莖多糖平均得率為3.27%,平均純度為29.49%,總評OD值為1.04,優(yōu)于正交實驗表中的16個實驗組合,表明實驗方案設計穩(wěn)定、可行。

表4 正交實驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

注:*表述影響顯著。

表5 對比實驗結果Table 5 Results of contrast experiment

表3 正交實驗結果Table 3 Orthogonal experiment results

按方法1.2.5的表2進行實驗設計,結果見表5。三種方法中,微波預處理-超聲波提取法所提取的山豆根莖多糖得率和純度均為最高,超聲波提取法次之,熱水浸提法最低;b法與a法比較發(fā)現(xiàn),采用超聲波提取比熱水浸提法的多糖得率提高了17.30%,而純度也提高了31.04%;c法與b法對比發(fā)現(xiàn),在超聲波提取之前增加微波預處理,山豆根莖多糖得率可提高17.63%,多糖純度也提高了11.24%。綜上所述,表明采用微波預處理-超聲波提取法可大大提高山豆根莖多糖的提取效率。

2.2 山豆根莖粗多糖的穩(wěn)定性實驗結果

2.2.1 光照對粗多糖的影響 光照對粗多糖穩(wěn)定性實驗結果如圖1所示。由圖1可知,不論b法還是c法,所提取的粗多糖,與避光相比,光照對粗多糖的穩(wěn)定性有一定的影響,且放置2 h后,吸光度隨著光照時間的延長而逐漸下降,原因可能是粗多糖可能在光照條件下發(fā)生部分分解[2],故建議避光保存。

圖1 光照對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of polysaccharose

2.2.2 溫度對粗多糖的影響 溫度對粗多糖穩(wěn)定性實驗結果如圖2所示。由圖2可知,b法和c法提取的粗多糖隨溫度變化,具有相同的變化趨勢;在40～70 ℃時吸光度無明顯變化,表明穩(wěn)定性較好,但當溫度超過70 ℃以后,吸光度明顯增大,原因可能是過高的溫度導致粗多糖水解,增大了溶液顯色效果[11],故建議采用低于70 ℃的溫度進行粗多糖的提取或存放。

圖2 溫度對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of polysaccharose

2.2.3 金屬離子對粗多糖的影響 金屬離子對粗多糖的穩(wěn)定性實驗結果如圖3所示,由圖3可知,兩種方法所提取的粗多糖受金屬離子的影響趨勢相同;在含Ca2+的溶液中吸光度未發(fā)生明顯變化,即比較穩(wěn)定;在含F(xiàn)e3+和Cu2+的溶液中吸光度升高較明顯,在含Al3+和Na+溶液中的吸光度下降較多,原因可能是金屬離子本身具有一定的顏色或者與粗多糖發(fā)生了氧化反應、絡合反應等[11],導致粗多糖與金屬離子之間結構發(fā)生了變化,從而引起吸光度變化明顯,即對粗多糖的穩(wěn)定性影響較大。

圖3 金屬離子對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of metal ions on the stability of polysaccharose

2.2.4 食品添加劑對粗多糖的影響 食品添加劑對粗多糖的穩(wěn)定性實驗結果如圖4所示,由圖4可知,與空白對照對比,加入抗壞血酸(VC)后,莖多糖(b)和莖多糖(c)的吸光度均明顯增大,而添加檸檬酸對莖多糖(b)和莖多糖(c)的吸光度變化不明顯,表明檸檬酸對粗多糖的穩(wěn)定性無影響,但VC對粗多糖的穩(wěn)定性影響較大,原因可能是VC抗氧化活性較強,易競爭性發(fā)生氧化反應生成過氧化氫,過氧化氫易與粗多糖發(fā)生反應,生成深色產物,從而導致吸光度增大[11]。

圖4 食品添加劑對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of food additives on the stability of polysaccharose

2.2.5 氧化還原劑對粗多糖的影響 氧化劑和還原劑對粗多糖的穩(wěn)定性實驗結果如圖5所示,由圖5可知,莖多糖(b)和莖多糖(c)受氧化還原劑的影響變化趨勢一致;粗多糖溶液的吸光度隨著雙氧水濃度的增大而增大,原因可能是多糖與氧化劑發(fā)生了反應,生成深褐色產物[11],導致吸光度增大;山豆根粗莖多糖卻隨著亞硫酸鈉濃度的增大而減小,但下降趨勢不明顯,原因可能是部分多糖被還原劑還原,生成的糖苷數(shù)量減少,故吸光度減小。綜合表明粗多糖易被氧化,也會被還原,即粗多糖在氧化劑和還原劑的條件下不穩(wěn)定。

圖5 氧化還原劑對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of oxidant and reductant on the stability of polysaccharose

2.3 山豆根莖粗多糖的體外抗氧化實驗結果

按方法“1.2.7”測定粗多糖對·OH的清除率,結果如圖6所示。由圖6可知莖多糖(b)和莖多糖(c)均具有一定的抗氧化活性,且清除效果與多糖濃度呈量效關系,當多糖濃度為1.96 mg/mL時,莖多糖(b)和莖多糖(c)對·OH的清除率分別為68.57%和78.14%;相同濃度下,莖多糖(c)對·OH清除率高于莖多糖(b),但兩種方法提取的粗多糖抗氧化效果均不如陽性對照VC。

圖6 多糖對·OH自由基的清除能力Fig.6 ·OH scavenging ability of polysaccharose

圖7 多糖對自由基的清除能力

2.4 山豆根莖粗多糖對亞硝酸鹽的清除效果

按方法“1.2.8”分別測定粗多糖和VC對亞硝酸鹽的清除率,結果如圖8所示。由圖8可知粗多糖對亞硝酸鹽具有良好的清除作用,隨著提取液添加量的增大,清除作用也逐漸增大,表明粗多糖與亞硝酸鹽清除率存在量效關系;兩種方法所提取的粗多糖,在相同濃度下,清除亞硝酸鹽能力相當;在實驗范圍內,粗多糖對亞硝酸鹽的清除作用均低于同添加量的VC;當粗多糖(c)溶液添加量為20 mL(多糖重量為19.60 mg)時,亞硝酸鹽清除率達82.95%,與8 mL VC(0.32 mg)清除率(83.01%)相當。

圖8 多糖對亞硝酸鹽的清除作用Fig.8 Scavenging activity on nitrite of polysaccharose

3 結論

[1]蔡錦源,朱熾雄,孫松,等.香菇多糖的微波預處理-超聲波提取工藝及其抗氧化活性研究[J]. 河南工業(yè)大學學報自然科學版,2016,37(4):84-90.

[2]史娟. 微波預處理-超聲波提取山茱萸多糖及穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā),2014,35(1):1-5.

[3]張林,李元波,張愛軍.總評“歸一值”優(yōu)選銀馬口服液的澄清工藝[J].中國實驗方劑學雜志,2016,22(2):24-27.

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[5]Wei KH,Li LX,Huang YC,Wang,et al. Tissue culture of Sophora tonkinensis Gapnep. and its quality evaluation[J]. Pharmacognosy Magazine,2013,9:321-328.

[6]Zhang JP,Zhang M,Zhou JP,et al. Antifibrotic effects of matrine oninvivomodels of liver fibros is in rats[J]. Acta Pharmacol Sin,2001,22(2):183-185.

[7]帥學宏,胡庭俊,曾蕓,等. 山豆根多糖對免疫抑制模型小鼠免疫器官指數(shù)和自由基相關酶活性的影響[J].南京農業(yè)大學學報,2009,32(2):170-172.

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[9]蔡錦源,朱熾雄,李林軒,等. 山豆根多糖的微波預處理-熱水浸提工藝及其抗氧化活性研究[J].應用化工,2016,45(10):1860-1864.

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Optimization of ultrasonic extraction coupled with microwave treatment of polysaccharose fromSophoraTonkinensisGapnep. by overall desirability and its biological activity

XU Jian-ping1,CAI Jin-yuan2,3,LI Lin-xuan2,WANG Meng-xuan3,ZHANG Cai-yun3, LIANG Hao-rong3,WEI Kun-hua2，*,LI Min-hui1,2，*

(1.Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia 014040,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China; 3.Lushan College of Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545616,China)

overall desirability;S.tonkinensispolysaccharose;ultrasonic extraction coupled with microwave treatment;antioxidant activity;nitrite scavenging activity;stability

2016-10-24

徐建平 (1992-)，女，碩士，從事中藥資源學研究， E-mail:xu_jianping1992@163.com。

*通訊作者:韋坤華 (1983-)，女，博士，副研究員，從事藥用植物生物技術研究，E-mail:divinekh@163.com。 李旻輝 (1978-)，男，博士，教授，從事中藥資源學研究，E-mail:li_minhui@aliyun.com。

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(201507002)；國家自然科學基金項目(81460582, 81473309)；國家科技重大專項(2012ZX09304006)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFBA019086)；廣西大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201613639005)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0187-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.028