林 祎,丁 甜,2，劉東紅,2,*，王文駿

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 2.浙江大學馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

聲熱復合對沙門氏菌的殺菌效果研究

林 祎1,丁 甜1,2，劉東紅1,2,*，王文駿1

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 2.浙江大學馥莉食品研究院,浙江杭州 310058)

高效低營養(yǎng)組分影響的新型殺菌技術研究一直被廣為關注。本文以復原全脂乳為介質,接種沙門氏菌后,分析了溫度、時間及功率對聲熱復合殺菌效果的影響,并對殺菌前后樣品的理化性質進行了比較。結果表明:影響殺菌效果的因素大小順序為:溫度、超聲時間和超聲功率;滅菌對數值為5.0(即殺死99.999%的沙門氏菌)的優(yōu)化殺菌條件為超聲時間8.8 min,超聲功率307 W,超聲溫度50 ℃,在此條件下處理不但對樣品理化品質影響小,而且能夠顯著降低樣品脂肪球直徑(p<0.01),脂肪球直徑降為處理前的17.86%。說明聲熱復合殺菌技術可作為一種潛在的殺菌技術應用于液態(tài)乳殺菌。

沙門氏菌,聲熱復合技術,殺菌,響應面法

牛乳含有豐富營養(yǎng)成分,如蛋白、脂肪、氨基酸、乳糖、礦物質等,被認為是一種營養(yǎng)價值非常高的食品,同時也是微生物生長繁殖理想的培養(yǎng)基[1]。因此,在牛乳加工過程中,殺菌成為必不可少的一個重要環(huán)節(jié)[2]。目前,牛乳生產中常采用熱力殺菌,主要有巴氏殺菌、高溫短時殺菌、高溫長時殺菌和超高溫瞬時殺菌[3-4]。但是牛乳熱殺菌不僅在加熱過程中引起營養(yǎng)成分破壞或損失,而且在殺菌結束或經長時間貯藏后會發(fā)生“褐變”,降低牛乳感官品質[5]。而非熱加工技術處理條件相對溫和,對食品固有營養(yǎng)成分、風味、質構、色澤破壞小,不僅能達到殺菌效果,還能最大程度地保留食品固有的營養(yǎng)價值,因此非熱加工已成為食品加工技術領域的研究熱點[6-7]。

超聲波在食品工業(yè)中被認為是一種環(huán)境友好型的殺菌手段[8],有研究發(fā)現通過超聲處理,能夠有效降低食品中細菌總數、大腸菌群和糞大腸菌群,并且其滅活率隨超聲處理時間的延長而增加[9-10]。盡管單獨應用超聲處理具有較好的殺菌效果,然而要實現殺菌率接近100%,會增加超聲功率和處理時間以及增加殺菌成本,從而限制了超聲殺菌技術的實際生產應用。雖然有研究表明超聲波協(xié)同其他技術,能夠增強殺菌效果,如在牛奶、蒸餾水、甘油介質中,聲熱聯用技術可以縮短枯草芽孢桿菌及其孢子的殺滅時間,并且能夠降低枯草芽孢桿菌孢子的熱抗性[11-12],施紅英等[13]發(fā)現在52 ℃下,聲熱聯用對鼠傷寒沙門氏菌的致死具有協(xié)同作用。目前,聲熱復合對接種到食品中的沙門氏菌殺菌效果的研究還較為少見。因此,本文通過響應面法來研究和預測聲熱復合對沙門氏菌的殺菌效果,并且優(yōu)化其滅菌條件,最后比較聲熱復合殺菌處理前后樣品的理化性質,以期為聲熱復合殺菌技術在食品工業(yè)中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

全脂奶粉 新西蘭米勒根斯食品集團有限公司;營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(Nutrient Broth,NB)、SS瓊脂培養(yǎng)基(Salmonella-Shigella Agar)、平板計數培養(yǎng)基(Plate Count Agar,PCA)、鼠傷寒沙門氏菌SalmonellaTyphimurium(ATCC14028-3) 青島海博生物技術有限公司;酚酞、淀粉酶、偏磷酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鈉、硼酸、鄰苯二胺、維生素C、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉等 均為分析純,國藥基團化學試劑有限公司。

TS-2102C 搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司;LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;TGL20M離心機 湖南凱達科學儀器有限公司;JY92-IIDN 超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司;KONICA MINOLTA CM-700d分光測色計 柯尼卡美能達辦公系統(tǒng)(中國)有限公司;UB200i系列生物顯微鏡 重慶澳浦光電技術有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將凍干管中的沙門氏菌菌種接種到NB培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng),培養(yǎng)液與50%的甘油1∶1混合于甘油管中-80 ℃保存?zhèn)溆?。從甘油管中挑取一環(huán)菌液于SS瓊脂培養(yǎng)基平板劃線獲得沙門氏菌單菌落(24 h)。取單菌落到NB培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)18 h,然后在4 ℃下,5000 r/min離心10 min,棄上清液,所得菌體用0.85%生理鹽水洗滌2 次,制成濃度為 109～1010CFU/mL的菌懸液,4 ℃冷藏備用[14-15]。

1.2.2 聲熱復合殺菌

1.2.2.1 樣品準備 準確稱取一定量全脂乳粉,按照1∶8的比例添加純凈水,攪拌混勻后,在121 ℃下,滅菌15 min,冷卻后制成無菌復原全脂乳,按照體積比100∶1的比例接種1.2.1的菌懸液,即實驗樣品。

1.2.2.2 單因素實驗 固定超聲波細胞粉碎機的頻率為20 kHz,振幅為110 μm,并將其鈦合金變幅桿用75%酒精浸泡30 min后用無菌去離子水沖洗3遍。取30 mL 1.2.2.1的菌液轉入無菌超聲玻璃管(28 mm OD×100 mm H)中并將其置于恒溫水浴鍋中使菌液預熱到設定溫度,隨后在不同超聲時間(3～15 min)、超聲功率(100～500 W)和溫度(35～55 ℃)條件下進行超聲處理。固定超聲功率400 W,恒溫水浴溫度50 ℃研究不同處理時間(3、6、9、12、15 min)對沙門氏菌的殺滅效果;固定時間9 min,溫度50 ℃研究不同功率(100、200、300、400、500 W)對沙門氏菌的殺滅效果;固定時間9 min,功率400 W研究不同溫度(35,40、45、50、55 ℃)對沙門氏菌的殺滅效果,處理完成的樣品迅速于4 ℃下冷卻并采用平板計數法(GB4789-2010)測定其菌落總數,每個處理重復三次。

1.2.2.3 響應面實驗 根據Central Composite實驗設計原理,以滅菌對數值NK(R)和殺菌率(%)為指標,在單因素實驗的基礎上,選取超聲溫度、超聲時間、超聲功率三個因素為自變量,設計了3因素5水平的響應面實驗。實驗因素水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 The response surface experiment factor level table

1.2.3 滅菌對數值Nk和殺菌率計算

Nk=lg(N0/N)

殺菌率(%)=(N0-N)/N0×100

式中:N-經滅菌處理后平板上可見的菌落總數,CFU/mL;N0-滅菌處理前的菌落總數,CFU/mL。

1.2.4 理化性質測定

1.2.4.1 實驗設計 為了分析聲熱復合處理對樣品理化品質的影響,取15支超聲玻璃管,每支管中注入30 mL復原全脂乳,以響應面法得出的最優(yōu)條件進行殺菌后,樣品分別用于維生素C、pH、滴定酸度、色度、脂肪球直徑等指標測定,然后與未經處理的樣品進行比較。

1.2.4.2 各指標的實驗方法 維生素C:GB 14754-2010食品安全國家標準食品添加劑維生素C(抗壞血酸);pH:pH計法;滴定酸度:GB 5413.34-2010 乳與乳制品酸度的測定;色度:利用色差儀對表征牛乳樣品色澤的L*、a*、b*值進行測定,每個樣品平行測定3次;脂肪球直徑:加一滴液態(tài)乳樣品于載玻片上,再滴2～3滴蘇丹Ⅲ染液染色3 min,蓋上蓋玻片,用吸水紙吸取周圍多余樣品,顯微鏡目鏡10倍,物鏡100倍下用油鏡觀察并拍片記錄,測量視野內任意4 cm2所有脂肪球的直徑大小,計算其平均值與直徑范圍。

1.2.5 數據處理 數據結果采用x±s表示,方差分析采用SPSS 20.0分析,多重檢驗采用Tukey檢驗法,顯著水平取0.05。

2 結果與討論

2.1 殺菌時間對沙門氏菌的殺菌效果

由圖1可見,隨著超聲殺菌時間的延長,沙門氏菌的滅菌對數值Nk也不斷增加。當處理時間3～6 min內時,滅菌對數值增加速度最快,增加到5.17,而6 min到15 min這段時間的滅菌對數值增長趨于平緩,滅菌對數值只增加了1.54。這與傳統(tǒng)熱殺菌處理中殺菌時間對微生物的致死趨勢相似,時間越長殺菌效果越好;而兩者對微生物致死趨勢的不同點在于聲熱復合殺菌前期滅菌對數值增長很快,到達一定值后增長逐漸變緩,而傳統(tǒng)熱殺菌處理前期滅菌對數值增長較慢,經過一定時間后滅菌對數值才會以較快且較為平穩(wěn)的速度增長[16]。

圖1 時間對殺菌效果的影響Fig.1 Influence of time on the sterilization effect注:標注不同字母的表示有顯著性差異, p<0.05，圖2，圖3同。

2.2 超聲功率對沙門氏菌的殺菌效果

如圖2所示,隨著超聲功率的增加,沙門氏菌的滅菌對數值也不斷提高。當超聲功率從100 W增加到400 W,從3.92提升到5.45,各處理的滅菌對數值差異顯著(p<0.05),而400 W(5.45)和500 W(5.50)兩個處理間差異不顯著(p>0.05)。一般認為,超聲波對液體中微生物殺滅作用的機理主要是空化效應,液體中的微小液泡表現為振蕩、生長、收縮及崩潰等一系列動力學過程,在液泡破裂會產生局部瞬間高溫和高壓,使細菌的細胞壁或細胞膜受到急劇的破壞,導致細菌死亡[17]。雖然500 W與400 W殺菌效果一樣好,但是500 W處理能耗相對高,選擇超聲功率400 W較為適宜。

圖2 超聲功率對殺菌效果的影響Fig.2 Influence of ultrasonic power on the sterilization effect

2.3 超聲溫度對沙門氏菌的殺菌效果

由圖3可見,隨著超聲溫度升高,對沙門氏菌的滅菌對數值也不斷提高。35 ℃和40 ℃處理的殺滅效果差異不顯著(p>0.05),并且對沙門氏菌的殺滅都相對較低,說明在低溫條件下,即使聯合超聲處理,殺滅效果也并不理想。但當處理溫度超過45 ℃后,滅菌對數值顯著提升(p<0.05),可以從原來的1.70(35 ℃)提升至6.08(55 ℃)。與傳統(tǒng)熱殺菌處理中溫度對微生物的殺滅規(guī)律相似,溫度越高,滅菌對數值越大[17],不過在超聲復合的作用下,能夠在相對較低的溫度環(huán)境下,就獲得較好的殺菌效果,而根據施紅英等[13]的研究發(fā)現,傳統(tǒng)熱殺菌在52 ℃下處理40 min能降低的水中鼠傷寒沙門氏菌滅菌對數值為1.2,在全脂乳介質中這個值會更低。從單因素結果來看,55 ℃處理的殺滅效果最好。

圖3 超聲溫度對殺菌效果的影響Fig.3 Influence of temperature on the sterilization effect

2.4 聲熱復合殺菌條件優(yōu)化

該研究選用Central Composite Design中心組合實驗設計,共有20組實驗,其中包括14組析因實驗和6組重復實驗。采用Design-Expert8.06分析軟件輔助設計響應面實驗,實驗設計及結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Designs and results for extraction of response surface experiments

對表2數據進行響應面多元回歸分析,獲得了3個因素與沙門氏菌滅菌對數值之間的模擬回歸方程為:

Nk=3.72+0.80A+0.48B+1.84C-0.44A2+0.049B2-0.031C2+0.17AB+0.14AC+0.017BC

為了了解該回歸模型擬合度,對模型進行了顯著性檢驗及方差分析,結果見表2。

表3 方差分析Table 3 The variance analysis

注:p<0.01,極顯著“**”;p<0.05,顯著“*”。 表2中方差分析結果顯示,對回歸模型的F檢驗,該模型達到極顯著(p=0.0001<0.01),失擬項p=0.4220>0.05,表明模型的失擬度不顯著,該回歸模型預測值與實測值能較好的吻合。進一步分析,由F值判斷各因素對沙門氏菌滅菌對數值影響的強弱,F值越大,影響作用越強。因此,各因素對沙門氏菌滅菌對數值影響程度大小依次為超聲溫度C>超聲時間A>超聲功率B。

由Design Expert8.06軟件分析獲得了各因素交互作用的響應面圖見圖4,各因素交互作用對滅菌對數值的影響,隨著溫度和時間增加,響應值一直呈上升趨勢;而隨著超聲功率增加,響應值先增加后趨于穩(wěn)定。由于等高線形狀與因素間交互作用的顯著性有關,圓形等高線表明因素間交互作用不顯著,橢圓等高線表明因素間交互作用顯著[18],由圖4可知,功率、時間和溫度相互間的等高線圖都呈非橢圓形,表明3因素間交互作用不顯著,并且方差分析也證明該模型中因素之間交互作用不顯著(p>0.05)。

圖4 各因素及其交互作用對NK值的響應曲面圖Fig.4 Response surface of factors and their interaction on NK

因為美國FDA推薦致病菌的滅菌對數值為5.0,因此以沙門氏菌滅菌對數值5.0(殺菌率99.999%)為目標,由Design-Expert8.06運算獲得沙門氏菌殺滅效果的最優(yōu)條件:超聲時間8.77 min,超聲功率307 W,溫度49.84 ℃,在該條件下,模型預測的滅菌對數值為4.9999(殺菌率99.999%)。同時做了3次平行驗證實驗,為了便于參數設置,具體實施條件為,超聲時間8.8 min,超聲功率307 W,溫度50 ℃,獲得滅菌對數值為5.17±0.21(殺菌率>99.999%)。對驗證值與預測值進行t檢驗,t=0.941

2.5 理化性質分析

由表3可以看出,與未經處理的樣品比較,聲熱復合處理后,樣品的pH、滴定酸度、L*、a*均未發(fā)生顯著變化(p>0.05),聲熱復合處理后pH和滴定酸度均略有上升,說明樣品中氫離子濃度略有下降,但由于蛋白質和脂肪水解、乳糖降解等原因,樣品中的酸性物質總量還是呈上升趨勢[19];雖然VC損失率(%)達到10.6%±2.29%,但與傳統(tǒng)殺菌中VC損失率達40%～60%相比[20],聲熱復合處理對牛乳中VC的損失相對較小;殺菌后的樣品b*顯著高于處理前(p<0.05),說明殺菌后樣品色澤有一定的加深,同樣于傳統(tǒng)殺菌報道的色澤變化比較[21],聲熱復合對樣品的L*和a*影響相對較小(p>0.05);此外,殺菌處理后,牛乳的脂肪球直徑顯著降低(p<0.01),僅為處理前的17.86%。有文獻報道[22]超聲處理具有均質的作用,說明聲熱復合殺菌處理后,更有利于牛乳中脂肪球穩(wěn)定?？偟膩砜?聲熱復合處理能夠殺滅沙門氏菌的同時,對牛乳中的理化性質影響不顯著或相對較小。

表3 聲熱復合殺菌處理前后的樣品理化品質Table 3 The physic-chemical parameters of pre-and post-treatment samples

注:按照100 mL液態(tài)乳添加15 mg的比例添加VC標準品,然后進行聲熱復合殺菌處理，同一個指標，不同字母表示有顯著差異(p<0.05)。

此外,與傳統(tǒng)液態(tài)乳殺菌方法(低溫長時巴氏殺菌法:LTLT,63 ℃,30 min;高溫短時巴氏殺菌:HTST,72 ℃,15 s)[23]比較,聲熱復合處理能夠明顯降低殺菌溫度,而殺菌時間介于兩種巴氏殺菌之間,說明聲熱復合殺菌技術有較大的應用前景。下一步工作應該開展聲熱復合技術對其他常見病原菌的殺菌效果,以及在原料乳殺菌中實際應用方面的研究。

3 結論

在復原乳中,聲熱復合技術能夠有效殺滅沙門氏菌,滅菌對數值為5.0(即沙門氏菌的殺菌率達到99.999%)的優(yōu)化殺菌條件為超聲時間8.8 min,超聲功率300 W;超聲溫度50 ℃,在該條件下,聲熱復合殺菌處理后不但對理化性質影響較小,而且還能有效降低原料中乳脂肪球直徑,有利于殺菌乳的穩(wěn)定。

[1]Cregenzán-Alberti O,Halpin R M,Whyte P,et al. Suitability of ccRSM as a tool to predict inactivation and its kinetics forEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandPseudomonasfluorescensinhomogenized milk treated by manothermosonication(MTS)[J].Food Control,2014(39):41-48.

[2]Carrasco E,Morales-Ruela A,Garcia-Gimeno R M. Cross-contamination and recontamination bySalmonellainfoods:A review[J]. Food Research International,2012(45):545-556.

[3]肖楊,張鵬,王輝,等. 超高壓處理對生牛乳殺菌效果的研究[J]. 食品科技,2013(05):59-61.

[4]楊潔,豆智華,李冠. 新疆雙峰駝乳殺菌條件的選擇及其熱穩(wěn)定性[J]. 食品科學,2013(21):36-41.

[5]Surowsky B,Schlüter O,Knorr D. Interactions of Non-Thermal Atmospheric Pressure Plasma with Solid and Liquid Food Systems:A Review[J]. Food Engineering Reviews,2015,7(2):82-108.

[6]Halpin R M,Duffy L,Cregenzán-Alberti O. The effect of non-thermal processing technologies on microbial inactivation:An investigation into sub-lethal injury ofEscherichiacoliandPseudomonasfluorescens[J]. Food Control,2014,41:106-115.

[7]Buckow R,Chandry P S,Ng S Y. Opportunities and challenges in pulsed electric field processing of dairy products[J]. International Dairy Journal,2014,34(2):199-212.

[8]Aschoff J K,Knoblauch K,Hüttner C. Non-Thermal Pasteurization of Orange(Citrussinensis(L.)Osbeck)Juices Using Continuous Pressure Change Technology(PCT):a Proof-of-Concept[J]. Food and Bioprocess Technology,2016,9(10):1681-1691.

[9]Giorgio M,Luca F,Novelli E. Ultrasonic inactivation of microorganisms:A compromise between lethal capacity and sensory quality of milk[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2015(29):215-221.

[10]Shengpu G,Yacine H,Gillian D. Inactivation ofEnterobacteraerogenesin reconstituted skim milk by high-and low-frequency ultrasound[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2014(21):2099-2106.

[11]Garcia M L.Effect of heat and ultrasonic waves on the survival of two strains ofBacillussubtilis[J]. Journal of Applied Bacteriology,1989,67:619-628.

[12]E. Evelyn,Filipa V. Thermosonication versus thermal processing of skim milk and beef slurry:Modeling the inactivation kinetics ofpsychrotrophicBacilluscereusspores[J]. Food Research International,2015(67):67-74.

[13]施紅英,張靜巖,吳衛(wèi)東,等. 熱-超聲波聯合對鼠傷寒沙門氏菌的殺菌效果研究[J].食品工業(yè)科技,2015,36(4):89-91,96.

[14]韓晗,李雪敏,韋曉婷,等. 即食牛乳中沙門氏菌生長模型的建立[J].食品科技,2016,41(5):316-322.

[15]宣曉婷,劉東紅,丁甜.弱酸性電位水對單增李斯特菌致死機制的研究[J].食品安全質量檢測學報,2015,6(1):245-251.

[16]Som N,Sanjeev A,Kasiviswanathan M.Inactivation of thermoduric aerobic sporeformers in milk by ultrasonication[J]. Food Control,2014(37):232-239.

[17]Suguna M,Rajeev B,Wan-N.Influence of temperature variations on growth,injury survival and inactivation of Listeria monocytogenes in goat milk samples at laboratory scale[J]. International Journal of Dairy Technology,2014,67(3):437-445.

[18]唐夢茹,陳濤濤,汪少蕓,等. 響應面優(yōu)化酶解法制備韭菜籽蛋白抗氧化肽工藝[J].中國食品學報,2016,16(4):159-165.

[19]孫琦.牛乳熱加工特性及其鹽類平衡的研究[D]. 北京:中國農業(yè)科學院,2012:49.

[20]趙振峰,張仲欣,張玉先.不同殺菌方法對牛奶中VC損失量的影響研究[J].中國乳業(yè),2006,(2):49-51.

[21]姜雪,于鵬.超高壓處理對牛乳理化性質及脂肪酸成分的影響[J].食品工業(yè),2016,37(7):175-177.

[22]閆坤，呂加平，謝躍杰，等. 超聲波技術在乳品加工中的應用[J]. 中國乳品工業(yè)，2009，37(11)：29-32.

[23]Martínez-Monteagudo S I,G?nzleM G,Saldaa M D A. High-pressure and temperature effects on the inactivation of Bacillus amyloliquefaciens,alkaline phosphatase and storage stability of conjugated linoleic acid in milk[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies,2014(26):59-66.

Sterilization effects of thermo-sonication treatment onSalmonella

LIN Yi1,DING Tian1,2,LIU Dong-hong1,2，*,WANG Wen-Jun1

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China；2.Fuli Institute of Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The new sterilization technologies of high efficiency and low effect on nutritional components have been widely concerned. The reconstituted milk,was inoculated withSalmonella,and sterilization effects of thermos-sonication treatment were studied. The physicochemical parameters of pre-and post-treatment were also analyzed in this study. The results showed that the significance order of factors affecting the killing logarithm value was:ultrasonic temperature,ultrasonic time,and ultrasonic power. Taking 5.0 killing logarithm value(the percentage of killing rate was 99.999% forSalmonella)as reference,the optimal sterilization conditions were:ultrasonic time of 8.8 min,ultrasonic power of 307 W,and ultrasonic temperature of 50 ℃. Under these conditions,the physicochemical parameters did not change obviously,and the diameter of fat globules was reduced remarkably(p<0.05),only 17.86% of pre-treatment sample. Therefore,it indicates that the thermo-sonication technique has huge potential for application as a sterilization method in liquid milk industry.

Salmonella;thermo-sonication;sterilization;response surface method

2016-10-19

林祎(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail:21313042@zju.edu.cn。

*通訊作者:劉東紅(1968-)，女，博士，教授，研究方向：食品加工技術新裝備和工程化設計, E-mail:dhliu@zju.edu.cn。

國家重點研發(fā)計劃項目課題(2016YFD0400301)；國家自然科學基金(31371872)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0121-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.015