王偉偉,蘇 威,2,江和源,*,張建勇,施莉婷,2

(1.中國農業(yè)科學院茶葉研究所 農業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室,浙江省茶葉加工工程重點實驗室,浙江杭州 310008;2.中國農業(yè)科學院研究生院,北京 100081)

EGCG乙?；苌锴宄杂苫钚缘臉嬓Х治?/p>

王偉偉1,蘇 威1,2,江和源1,*,張建勇1,施莉婷1,2

(1.中國農業(yè)科學院茶葉研究所 農業(yè)部茶樹生物學與資源利用重點實驗室,浙江省茶葉加工工程重點實驗室,浙江杭州 310008;2.中國農業(yè)科學院研究生院,北京 100081)

以不同取代度乙?；頉]食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為對象,研究了在逐步取代過程中高效液相色譜圖出峰時間的變化,以及總抗氧化活性、清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基活性。結果表明:乙?；疎GCG出峰時間為14.6～30.6 min,隨著乙酸酐添加量的增多,取代羥基數(shù)逐漸增加,出峰時間逐漸向后推移。乙?；疎GCG的清除自由基活性表現(xiàn)出不同的規(guī)律,其中,總抗氧化活性、清除DPPH自由基活性和清除羥自由基活性隨著取代度增加逐漸減弱,其中乙酰化EGCG清除羥自由基活性轉變?yōu)楫a生羥自由基活性,清除超氧陰離子自由基活性隨著取代度的增加會先升高后降低。由此可見,隨著乙酰化程度的增加,EGCG的抗氧化活性有所下降,為乙?；疎GCG產品的研發(fā)提供理論依據。

EGCG,乙?；?總抗氧化能力,羥自由基,超氧陰離子

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶葉中的一種重要活性成分,約占茶葉中兒茶素總量的40%～60%[1],具有抗氧化、抗腫瘤、抑制肝癌、抗病毒、保護神經系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等功效[2-6]。由于EGCG突出的功能活性,自發(fā)現(xiàn)以來一直是科研人員研究的熱點之一,但是EGCG存在自身降解和異構化現(xiàn)象,穩(wěn)定性差、脂溶性和生物利用度低等問題[7-9],導致其應用受到了較大阻礙。

近年來國內外的學者開展了大量的EGCG分子修飾的研究,通過化學合成和生物的方法將EGCG分子上的基團進行取代,提高EGCG的脂溶性,目前EGCG的主要修飾方法有:甲基化、?；Ⅴセ?、糖苷化等[10-14]。其中?；疎GCG采用?；〈u基,合成的產物脂溶性增加,活性有所下降,有研究表明,EGCG經過乙?；揎椇蠓€(wěn)定性增強,且生物利用度有所提高,是抗癌藥物的一種潛在前提物質[15-16]。清除自由基的能力是評價?；瘍翰杷仡惢钚缘闹匾笜薣17],EGCG的羥基被乙?；鸩饺〈^程中的總抗氧化和清除自由基等活性變化研究尚未見報道,本研究以EGCG為底物,添加不同比例的乙酸酐進行乙?；?探究EGCG的羥基被乙?；鸩饺〈倪^程中活性的變化規(guī)律,為乙酰化EGCG的進一步研究和應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

純度大于98%的EGCG單體 無錫太陽綠寶科技有限公司;總抗氧化試劑盒、清除超氧陰離子自由基試劑盒、清除和產生羥自由基試劑盒 南京建成生物研究所;乙腈、乙酸乙酯、乙酸酐、吡啶、哇哈哈純凈水、DPPH、碳酸氫鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉、乙酸，乙腈為色譜純,其余試劑為分析純。

高效液相色譜儀 Waters 600,美國Waters公司;磁力攪拌器 MR3001,德國Heidolph公司。

1.2 不同乙?；潭菶GCG的合成

乙?；疎GCG的合成參照白艷[18]的研究方法,稱取4.877 g濃度98%的EGCG樣品,溶于500 mL乙酸乙酯溶液中,分別加入一定量的乙酸酐和2.5 mL吡啶,在磁力攪拌器作用下攪拌反應5 h,轉速為700 r/min,結束后加入50 mL水攪拌終止反應,在分液漏斗中靜置分層,放出水層,倒出乙酸乙酯層,然后分別用水、飽和碳酸氫鈉、飽和氯化鈉分別洗滌,收集有機層,作為不同取代度EGCG的溶液用于活性分析,各溶液過0.45 μm有機膜后液相檢測。其中乙酸酐的添加量分別設定為摩爾比(乙酸酐和EGCG的摩爾比)1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶48、1∶80,依次編號每個處理為處理A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K。

1.3 乙?；疎GCG的HPLC分析方法

乙?；疎GCG的檢測參照白艷[19]的研究方法,色譜柱:Hyper-sil ODS2(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流速為1.0 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長280 nm,進樣體積10 μL,運行時間50 min,延遲3 min。流動相A為乙腈∶水∶乙酸=5∶94.8∶0.2,流動相B為乙腈∶水∶乙酸=95∶4.8∶0.2,洗脫梯度為0～36 min,A相由100%降至0,36～37 min,A相由0升至100%,并保持至45 min。

1.4 取代羥基數(shù)估算

根據不同取代度EGCG的HPLC圖譜可以看出,EGCG和全乙?；疎GCG出峰時間之間明顯可分為7個時間段,猜測是取代1個羥基至取代7個羥基的EGCG,根據不同取代羥基EGCG的峰面積占總峰面積的比例,推算EGCG的取代羥基數(shù),公式如下:

EGCG取代羥基數(shù)=0×A0+1×A1+2×A2+3×A3+4×A4+5×A5+6×A6+7×A7+8×A8

其中A0為取代0個羥基的EGCG占總峰面積的比例,A1為取代1個羥基的EGCG占總峰面積的比例,以此類推。

1.5 活性分析方法

1.5.1 總抗氧化能力 按照試劑盒測定方法,依次加入試劑一1 mL、待測樣品0.1 mL、試劑二2 mL、試劑三應用液0.5 mL,充分混勻后37 ℃水浴30 min,再加入試劑四0.1 mL,在波長520 nm處測定吸光值,對照管中待測樣本添加順序改為加入試劑四后添加。

總抗氧化能力=(OD測定-OD對照)/(0.01×30)

式中:OD測定為測定管吸光值,OD對照為對照管吸光值。37 ℃時,每分鐘每0.1 mL樣品使反應體系的吸光度值每增加0.01為一個總抗氧化能力單位。

1.5.2 產生和抑制羥自由基能力 按照試劑盒測定方法,依次加入底物應用液0.2 mL、待測樣品0.2 mL、試劑三應用液0.4 mL、在37 ℃水浴中條件下精確反應1 min,立即加入顯色劑2 mL,室溫放置20 min后在波長550 nm處測定吸光值,空白管用雙蒸水代替底物應用液和待測樣品,標準管用雙蒸水和0.03% H2O2分別代替底物應用液和待測樣品,對照管用雙蒸水代替待測樣品。

抑制羥自由基能力=(OD對照-OD測定)/(OD標準-OD空白)×8.824×(1/0.2)

產生羥自由基能力=(OD測定-OD對照)/(OD標準-OD空白)×8.824×(1/0.2)

式中:OD測定為測定管吸光值,OD對照為對照管吸光值,OD標準為標準管吸光值,OD空白為空白管吸光值,8.824為標準品濃度8.824 mmol/L。

1.5.3 清除超氧陰離子自由基活性 按照試劑盒測定方法,依次加入試劑一1 mL,樣品0.05 mL、試劑二0.1 mL、試劑三0.1 mL、試劑四應用液0.1 mL,混勻后37 ℃水浴反應40 min,加入顯色劑2 mL,在波長550 nm處測定吸光值,對照管用雙蒸水代替樣品,標準管用VC標準品代替樣品。

抗超氧陰離子自由基活力=(OD對照-OD測定)/(OD對照-OD標準)×0.15×1000

式中:OD測定為測定管吸光值,OD對照為對照管吸光值,OD標準為標準管吸光值,0.15為標準品濃度0.15 mg/mL。

表1 各處理不同取代度乙?；疎GCG所占的比例和取代羥基數(shù)Table 1 Substituted hydroxyl number and proportion of acetylated EGCG with different substituting degrees of each treatment

1.5.4 清除DPPH自由基 清除DPPH自由基的方法參考李熙燦[20]的研究方法,取DPPH·溶液4 mL,逐步添加A溶液,并及時混勻,觀察溶液褪色情況,當溶液顏色基本褪去時記錄A的添加量,以該添加量的一半作為反應液添加量(設為x mL),加入(2-x) mL無水乙醇,再加入DPPH·溶液4 mL,靜置30 min后在519 nm下測量吸光值作為A,以DPPH·溶液4 mL加入2 mL無水乙醇測量吸光值作為A0。

DPPH自由基的清除率(%)=(A0-A)/A0×100

1.6 數(shù)據統(tǒng)計方法

采用SAS 9.2進行顯著性和相關性分析,檢測數(shù)據重復三次,采用Excel 2007整理實驗數(shù)據、作圖。

2 結果與分析

2.1 不同取代度乙?；疎GCG的合成結果

處理A到處理K乙酸酐的添加量從摩爾比1∶0增加至1∶80,不同處理的合成物經HPLC檢測,結果如圖1和表1所示,處理C的乙酸酐添加比例為1∶4,得到的產物以EGCG和取代1～5個乙?；腅GCG為主,EGCG的出峰時間為14.6 min;處理K的乙酸酐添加比例為1∶80,此時大于96%的EGCG中的8個羥基被全部取代,得到全乙?；疎GCG,出峰時間為30.6 min;中間產物為不同取代度EGCG的混合物,隨著乙酸酐添加量的增多,EGCG中的羥基被取代數(shù)逐漸增加,出峰時間逐漸向后推移,且取代羥基數(shù)越多,越難繼續(xù)取代,需要添加更多的乙酸酐才能得到更高的取代產物;EGCG共有8個羥基,從未被取代的EGCG和全取代的EGCG出峰情況可以明顯看出有7個出峰的時間段,因此,可以定義不同取代度EGCG的出峰時間,從取代1個羥基到取代8個羥基的出峰時間分別為:16.1～16.8、17.8～18.3、19.6～20.5、21.7～22.7、24.0～24.6、26.1～26.6、28.3～28.8、30.6 min,由于可能出現(xiàn)取代位置不同和同分異構體等因素,取代1～7個羥基之間的出峰時間為區(qū)間值。

圖1 處理C的高效液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of treatment C

2.2 不同取代度乙酰化EGCG的總抗氧化能力

總抗氧化能力是評價體系中分子和酶的綜合抗氧化能力,其能力強弱與機體的健康程度有密切的關系,總抗氧化能力測定的原理是將反應體系中的Fe3+還原成Fe2+,然后與菲啉類物質形成穩(wěn)定的絡合物。試劑盒法測定不同取代度乙?；疎GCG的總抗氧化能力變化規(guī)律,如圖2所示,隨著羥基取代數(shù)的增多,乙酰化EGCG的總抗氧化能力逐漸降低,且前期降幅較大,處理C的總抗氧化能力為對照A的51.6%,處理F的總抗氧化能力為對照A的12.2%,乙酸酐添加量超過1∶12時,合成的不同取代度乙?；疎GCG的總抗氧化能力下降幅度減緩,處理J的總抗氧化能力已不足對照A的3%。EGCG的酚羥基具有較強的還原性,酚羥基數(shù)是影響EGCG總抗氧化能力的主要因子,經統(tǒng)計分析得到,取代的酚羥基數(shù)與總抗氧化能力呈極顯著的正線性相關(p<0.01),線性方程如下:

Y=-0.298X+2.186R2=0.964

圖2 不同取代度乙酰化EGCG的總抗氧化能力Fig.2 Total antioxidant activity of acetylated EGCG with different substituting degrees注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖4、圖5同。

2.3 不同取代度乙酰化EGCG的抑制和產生羥自由基能力

羥自由基是氧化性最強的自由基,其化學反應能嚴重破壞蛋白質和核酸等,導致細胞衰老、死亡[21],試劑盒法檢測產生羥自由基采用Fenton反應,反應式為:Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH,加入顯色劑后呈色與羥自由基的多少成正比。不同取代度和濃度的EGCG對抑制和產生羥自由基能力有較大的影響,由圖3可見,測定不同取代度EGCG合成液(濃度約為9.6 mg/mL)的抑制和產生羥自由基能力,結果表明,隨著羥基取代數(shù)的增多,乙?；疎GCG抑制羥自由基能力逐漸減弱,當乙酸酐添加量為1∶6時,合成的化合物由抑制羥自由基轉為產生羥自由基能力,且隨著羥基取代數(shù)繼續(xù)增多,產生羥自由基能力逐漸增強,當乙酸酐添加量達到1∶12以后,合成的乙?；疎GCG產生羥自由基的能力基本穩(wěn)定。將合成液稀釋10倍(濃度約為0.96 mg/mL)后測定其抑制和產生羥自由基能力,結果如圖3所示,稀釋10倍后乙?；疎GCG隨著取代度的增加抑制或產生羥自由基能力的變化規(guī)律不變,仍然是抑制能力逐漸變弱,逐漸變?yōu)楫a生羥自由基能力,但是處理D和E由產生羥自由基轉變?yōu)橐种屏u自由基。

圖3 不同取代度乙?；疎GCG的抑制和產生羥自由基能力Fig.3 Inhibition and generation hydroxyl free radical activity of acetylated EGCG with different substituting degrees注:圖中a、b、c、d、e、f、g表示在p<0.05水平的存在顯著性差異;圖中正值表示抑制羥自由基能力,負值表示產生羥自由基能力。J、K兩個處理乙?；〈雀?，顯色反應出現(xiàn)沉淀，數(shù)據不作分析，圖4同。

由此可見,酚羥基數(shù)是乙酰化EGCG抑制和產生羥自由基的能力的重要影響因子,酚羥基數(shù)多時能抑制Fenton反應進行,生成較少的羥自由基,隨著酚羥基逐漸被取代,合成的乙?；疎GCG抑制能力逐漸減弱,乙酰化EGCG能與Fenton反應的產物OH-反應,將乙?；脫Q出來,因此,高取代度的乙?；疎GCG會加速Fenton反應,使之呈現(xiàn)產生羥自由基能力,并且濃度對乙酰化EGCG抑制和產生羥自由基的能力有較大影響,一定程度下,較高的取代度和濃度利于乙?；疎GCG產生羥自由基。

2.4 不同取代度乙?；疎GCG的清除超氧陰離子自由基能力

超氧陰離子自由基性質不活潑,但可以通過自身化學反應危害機體,還能衍生具有細胞毒性的自由基,是生物體中其他自由基的來源方式之一。試劑盒法通過模擬機體中黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶反應體系,產生超氧陰離子自由基,加入電子傳遞物質和染色劑進行顯色反應,分光光度檢測抗超氧陰離子自由基能力,反應式為:黃嘌呤+H2O+2O2→尿酸+2O2-+2 H+,EGCG具有清除超氧陰離子自由基能力,一是能直接提供H+,延緩黃嘌呤的氧化作用,二是自身的鄰苯二酚結構能絡合金屬離子,影響氧化反應進程[22]。不同取代度EGCG的清除超氧陰離子自由基能力結果如圖4所示,隨著EGCG取代度的提高,抗超氧陰離子自由基的能力先升高后降低,乙酸酐添加量為1∶4時,合成的乙?；疎GCG抗超氧陰離子自由基的能力最強,隨著取代度增加乙?；疎GCG的清除超氧陰離子自由基能力的下降幅度,比抗氧化能力和清除羥自由基小,當乙酸酐添加量為1∶24時,合成的乙酰化EGCG抗超氧陰離子自由基的能力仍占對照的65.8%。

圖4 不同取代度乙?；疎GCG的抗超氧陰離子自由基能力Fig.4 Superoxide anion free radical activity of acetylated EGCG with different substituting degrees

2.5 不同取代度乙酰化EGCG的清除DPPH自由基能力

DPPH自由基中存在-NO2和共軛苯環(huán),決定了氮自由基能穩(wěn)定存在,能清除DPPH自由基的物質一般也能清除穩(wěn)定性不如它的自由基,通過測定DPPH自由基的清除能力可以評價待測物的抗氧化能力。不同取代度的EGCG清除DPPH自由基的能力如圖5所示,整體來看,隨著乙酰化程度的提高,清除DPPH自由基的能力逐漸下降,但處理A到處理C清除率無顯著變化,處理D和E的清除率略微下降,處理E清除能力仍然占對照的94.4%,當乙酸酐添加量達到1∶12后,合成的乙?；疎GCG清除DPPH自由基能力顯著降低,處理J的DPPH清除率已不足3%,處理K基本無清除DPPH自由基能力。乙?；疎GCG清除DPPH自由基能力的變化規(guī)律與總抗氧化能力和清除羥自由基不同,清除DPPH自由基從處理A到處理E降低幅度較小,有研究表明,EGCG的B環(huán)和D環(huán)上的羥基決定了其抗氧化活性能力[23],王川丕等[24]的研究表明,EGCG的D環(huán)優(yōu)先發(fā)生接受電子的反應,A環(huán)、B環(huán)和C環(huán)優(yōu)先發(fā)生給出電子的反應。因此,導致乙?；疎GCG不同的抗氧化活性規(guī)律可能是乙?；〈奈稽c差異,取代的位點不同,乙?；疎GCG能表現(xiàn)出不同的清除自由基活性。

圖5 不同取代度乙?；疎GCG的清除DPPH自由基能力Fig.5 DPPH free radical scavenging activity of acetylated EGCG with different substituting degrees

3 結論

本實驗研究發(fā)現(xiàn),當乙酸酐添加量為1∶0～1∶80之間時,合成的乙?；疎GCG為不同取代度的混合物,并得到了取代不同羥基數(shù)乙酰化EGCG的出峰時間,通過高效液相色譜法可以計算出混合物中不同取代度EGCG的組成比例,為進一步研究不同取代度乙?；疎GCG提供了檢測基礎。

本實驗檢測了不同取代度乙?；疎GCG的抗氧化活性、清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基能力,較全面探索了其清除各類自由基的能力變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)不同取代度EGCG的總抗氧化能力和清除DPPH自由基能力的規(guī)律相似,均隨著取代度的增加能力下降,但變化規(guī)律仍有不同之處,總抗氧化能力為取代少量羥基即有較大幅度下降,清除DPPH自由基能力則為乙酸酐添加量為1∶8前降幅較小,之后降幅較大;清除羥自由基能力與濃度密切相關,濃度為0.96、9.6 mg/mL時,取代度高的EGCG具有產生羥自由基能力,濃度升高會使部分具有抑制羥自由基能力的EGCG轉為具有產生羥自由基能力的EGCG;清除超氧陰離子自由基的能力隨著EGCG取代度的提高先升高后降低,清除超氧陰離子自由基能力降幅低于其余三種。不同取代度乙?；疎GCG清除自由基活性存在上述規(guī)律的主要原因是羥自由基數(shù)的減少直接降低了體外活性,取代羥基的位點不同和絡合金屬離子的能力差異又導致了不同的清除規(guī)律。不同取代度乙?；疎GCG的四種抗氧化能力表現(xiàn)出的不同規(guī)律,可以為乙?；疎GCG將來應用于食品和日化用品提供理論基礎。

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Analysis on structure-activity of EGCG acetylated derivative to scavenge free radical

WANG Wei-wei1,SU Wei1,2,JIANG He-yuan1,*,ZHANG Jian-yong1,SHI Li-ting1,2

(1.Tea Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Tea Plants Biology and Resources Utilization of Agriculture Ministry,Key Laboratory of Tea Processing Engineering of Zhejiang Province,Hangzhou 310008,China; 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

Epigallocatechin gallate(EGCG)with different degrees of acetylating was used in this study,peak reserving time of HPLC and the activity of total antioxidant activity,hydroxyl free radical scavenging,superoxide anion free radical and DPPH free radical scavenging during gradually substituting processing were investigated. The results showed that the peak reserving time of acetylated EGCG was 14.6～30.6 min,the number of replacing hydroxyl increased and the peak reserving time was delayed with the increasing of acetic anhydride. Free radical scavenging activity of acetylated EGCG exhibited different laws,the total antioxidant activity and DPPH free radical scavenging activity gradually weakened with the increasing of substitution degree,Superoxide anion free radical scavenging activity increased first and then decreased with the increasing of substitution degree,hydroxyl free radical scavenging activity reduced with the increasing of substitution degree,and converted to generating hydroxyl free radicals activity. This suggested that the antioxidant activity of EGCG decreased as the degree of acetylation increased,thus provided the basis for development of acetylated EGCG products.

EGCG;acetylated;total antioxidant activity;hydroxyl free radical;superoxide anion free radical

2016-10-08

王偉偉(1986-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：茶葉深加工技術，E-mail：wangwei11211@tricaas.com。

*通訊作者:江和源(1974-)，男，博士，研究員，研究方向：茶葉化學與加工，E-mail：jianghy@tricaas.com。

國家自然科學基金(31670692)；公益性行業(yè)(農業(yè))科研專項(201503142-11)；中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2016-TRICAAS)。

TS202

A

1002-0306(2017)07-0059-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.003