張冀，杜馳，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

鹽脅迫下鹽穗木DNA聚合酶λ基因的克隆和表達(dá)分析

張冀，杜馳，張富春

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

【目的】開展鹽脅迫下DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá)研究，有助于揭示DNA損傷修復(fù)與鹽生植物耐鹽的相關(guān)性。【方法】根據(jù)鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，利用RACE技術(shù)克隆獲得了鹽穗木DNA損傷修復(fù)基因HcDNA聚合酶λ(HcDNApolλ)基因，開放閱讀框1 335 bp，編碼444個氨基酸。【結(jié)果】保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，HcDNApolλ基因?qū)儆贒NA聚合酶X家族成員，系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示HcDNApolλ為獨立的分支，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，無信號肽且不含跨膜區(qū)域的親水蛋白。實時熒光定量PCR分析表明，隨著NaCl脅迫濃度的增加，同化枝的HcDNApolλ基因的表達(dá)逐漸上調(diào)，在300 mmol/L NaCl處理 7和14 d時，HcDNApolλ的表達(dá)分別增加3和5倍。最后在700 mmol/L NaCl處理14 d時，HcDNApolλ的表達(dá)增加20倍，達(dá)到峰值?！窘Y(jié)論】HcDNApolλ基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)。

鹽穗木；HcDNApolλ基因；鹽脅迫；基因表達(dá)

0 引 言

【研究意義】植物扎根土壤由于不能移動以及對陽光的依賴性，使得其在維護(hù)基因組的完整性方面面臨巨大的挑戰(zhàn)，因為植物連續(xù)暴露在各種生物和非生物的脅迫之下[1]，如細(xì)菌、病毒、紫外、電離輻射、高鹽、化學(xué)誘變劑、自由基和體內(nèi)的烷基化等作用, 各種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的DNA損傷可能會導(dǎo)致DNA理化性質(zhì)的改變，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒害和遺傳毒害作用[2]。因此植物只能依靠已經(jīng)進(jìn)化出高效廣泛的DNA損傷檢測和修復(fù)機(jī)制,來確保其基因組的穩(wěn)定性進(jìn)行物種延續(xù)。【前人研究進(jìn)展】DNA雙鏈斷裂(DSBs)是DNA損傷中最有毒性的形式之一，由異常的復(fù)制和修復(fù)引起，因為雙鏈的DNA都發(fā)生損傷，因此沒有未損傷的DNA鏈作為復(fù)制修復(fù)的模板[3]。自發(fā)或者環(huán)境誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、遺傳不穩(wěn)定和癌癥。研究表明，DNA聚合酶X家族主要參與DNA的修復(fù)和重組[4]，DNApol λ是DNA聚合酶X家族的成員，廣泛存在于真核生物中，哺乳動物的DNApol λ是一個核酸外切酶缺陷的單一多肽的DNA聚合酶，與哺乳動物的DNA聚合酶β具有高度的序列同源性[5]。大量的研究表明，這兩種聚合酶具有許多共同的生化活性，包括5’端的核糖核酸裂解酶的活性等，在DNA的堿基切除修復(fù)中起重要的作用。DNApol λ還有一個較強(qiáng)的作用在非同源的末端重組中連接雙鏈斷裂的DNA缺口。在動物細(xì)胞中的研究顯示DNApol λ可以保護(hù)氧化的DNA損傷[6]?；蚪M廣泛的序列分析顯示：DNApol λ是植物中聚合酶家族的唯一成員，并且可能參與堿基切除修復(fù)，并且在DNA雙鏈斷裂的修復(fù)中起重要作用[7]?！颈狙芯壳腥朦c】鹽穗木(Halostachyscaspica)為多年生的藜科灌木，是典型的耐鹽植物[8]。通過實驗室對鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組測序分析[9]，發(fā)現(xiàn)DNA損傷應(yīng)激相關(guān)基因是一類上調(diào)表達(dá)的基因類群，因此選取DNA pol λ基因進(jìn)行基因克隆和表達(dá)分析，期望闡明HcDNApolλ基因在DNA損傷修復(fù)中的功能及其與植物抗逆的相關(guān)性[10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆獲得HcDNApolλ基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,探討不同鹽脅迫下HcDNApolλ基因在不同時間的表達(dá)模式，為明確HcDNApolλ基因在鹽脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于新疆五家渠103團(tuán)野外鹽堿地(E87.31°N44.29°)采集獲得鹽穗木種子，在實驗室播種于花盆中，花土成分為：珍珠巖∶蛭石∶花土=1∶1∶3，并用雙子葉植物營養(yǎng)液拌濕。溫度控制在(24±2)℃，光照3 000 lx(350 μmol/(m2·s), 16 h/8 h：晝/夜)，相對濕度為40%～60%條件下培養(yǎng)120 d左右，并淋澆以1/4 MS(Murashige and Skoog )培養(yǎng)液。

1.2 方 法

1.2.1 鹽穗木的鹽脅迫處理

選取0、100、300、500 和700 mmol/L 的NaCl脅迫處理，處理前48～72 h在托盤中加入1/4 MS培養(yǎng)液。待托盤中培養(yǎng)液吸收干凈無多余水分，將脅迫所用不同濃度NaCl溶液分別淋澆在基質(zhì)上，直至溶液充滿基質(zhì)溢出于托盤中。將花盆置于處理前的培養(yǎng)環(huán)境中，分別用含0、100、300、500 和700 mmol/L NaCl的1/4 MS的培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中0 mmol/L NaCl處理作為對照，不同NaCl脅迫濃度處理下的鹽穗木同化枝分別在0 h、24 h、72 h、7 d和14 d進(jìn)行采集用于實時定量表達(dá)分析。

1.2.2 Total RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將不同濃度NaCl脅迫處理不同時間的鹽穗木根和同化枝分別稱量200 mg，用總RNA提取試劑盒(北京百泰克公司)提取總RNA，方法參照試劑盒說明書。用ND-2000和1.5%變性PAGE膠測定小RNA濃度和質(zhì)量，每份組織3個重復(fù)。按照1 μg總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(20 μL反應(yīng)體系)，以Takara Oligo(dT)作為引物用M-mLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。程序：30℃ 10 min；42℃ 60 min；70℃ 15 min。以此cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 鹽穗木DNA聚合酶λ(HcDNApolλ)ORF的擴(kuò)增

根據(jù)實驗室前期對鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，克隆獲得鹽穗木DNA損傷修復(fù)基因HcDNApolλ的開放閱讀框序列，設(shè)計上游引物5’GATTAGG AGCGAAGGTATCTGA 3’，下游引物5’ACGCACATCAAAGGTTTCTC3’，以cDNA為模板，進(jìn)行HcDNApolλ開放閱讀框的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火40 s；72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

按PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Omega) 說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏钠闻cpEASY-T5載體(北京全式金公司)連接，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金公司)，菌液PCR鑒定出陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用DNASTAR 軟件對已獲得的HcDNApolλ的核酸序列進(jìn)行分析并推導(dǎo)其氨基酸序列；利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列的理化性；利用 TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)；利用Protscale(http:// web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質(zhì)親疏水性；利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=1K7GNVX3015&mode=all)分析預(yù)測氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域；利用 PSORT II Prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)和WoLF PSORT(http://wolfpsort. org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用 TargetP(http://www. cbs.dtu. dk/services/TargetP/)分析蛋白潛在信號肽；利用NetPhos(http://www.cbs.dtu. dk/services/NetPhos/)分析蛋白質(zhì)磷酸化位點；利用MEGA6.0 和DNAman 軟件分析其同源性及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 鹽脅迫下HcDNApolλ基因表達(dá)檢測

根據(jù)HcDNApolλ的cDNA序列設(shè)計qRT-PCR上游引物(5'-ACTCCTCGGCAATCTTCA TCAAA-3')，下游引物(5'-GAACGGTTTGGGATGGATGCT-3')，以Hcβ-Actin基因作為內(nèi)參基因,設(shè)計上游引物(5'-CCAAAGGCCAACAGAGAGAAGA-3')，下游引物(5'- TGAGACACACC ATCACCAGA-3')。以0、100、300、500和700 mmol/L NaCl脅迫0 h、24 h、72 h、7 d和14 d的鹽穗木的根和同化枝的cDNA為模板，取1.0 μL 的cDNA，參照QIAGEN試劑盒說明書。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 15 s；94℃ 30 s；58℃ 30s；72℃ 30s；40 cycles；72℃ 2 min。經(jīng)ABI PRISM 7500實時定量PCR儀器檢測，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1HcDNApolλ基因的克隆及氨基酸同源性分析

利用RACE擴(kuò)增獲得HcDNApolλ基因的全長(圖1)，開放閱讀框為1 335 bp，共編碼444個氨基酸(圖2)，運用MEGA6.0軟件對HcDNApolλ氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，結(jié)果表明HcDNApolλ在進(jìn)化上獨樹一支，與芝麻的親緣關(guān)系最近。圖1～3

M:2000DNAmaker; 1-2 Amplification ofHcDNApolλORF

圖1HcDNApolλ基因ORF擴(kuò)增PCR產(chǎn)物
Fig.1 The produce of PCR amplification ofHcDNApolλgene

圖2 DNA pol λ的核酸序列以及氨基酸序列

Fig.2 DNApolλ nucleotide acid sequence and amino acid sequence

注：分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點的可信度

Note: The number on the branches represent the reliability percent of bootstraps values based on 1,000 replications

圖3 不同植物基于HcDNApolλ氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹
Fig.3 Phylogenetic tree of different plants based on amino acid ofHcDNApolλ

2.2HcDNApolλ的生物信息學(xué)

2.2.1HcDNApolλ氨基酸一級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測分析

通過ExPASy ProtParam預(yù)測HcDNApolλ基因編碼的氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)氨基酸殘基數(shù)444個,正電荷氨基酸數(shù)59個,負(fù)電荷氨基酸數(shù)66個，分子量49 566.7 Da, 等電點pI=6.1, 半衰期h≥10,蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為41.72。根據(jù)定義當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)分值小于40時，預(yù)測蛋白質(zhì)比較穩(wěn)定；當(dāng)不穩(wěn)定系數(shù)分值大于40時，則該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，因此HcDNApolλ為不穩(wěn)定的蛋白。表1

2.2.2HcDNApolλ蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(Conserved Domain Database，CDD)，分析HcDNApolλ的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白屬于DNA聚合酶X家族，有一個DNA聚合酶X超家族和一個DNA聚合酶β超家族，表明HcDNApolλ參與DNA損傷的修復(fù)，包括堿基切除修復(fù)、DNA雙鏈斷裂的修復(fù)和跨損傷的DNA合成等。

2.2.3HcDNApolλ亞細(xì)胞定位預(yù)測

應(yīng)用Posort和WOLF POSORT兩種工具預(yù)測了HcDNApolλ的亞細(xì)胞定位，預(yù)測結(jié)果分析顯示，HcDNApolλ可能定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體以及細(xì)胞骨架。表中顯示的兩種預(yù)測工具的結(jié)果一致，推測HcDNApolλ蛋白定位于細(xì)胞核的概率最高，同時細(xì)胞質(zhì)和線粒體以及葉綠體中可能也有分布。表1

表1HcDNApolλ亞細(xì)胞定位預(yù)測
Table 1 Subcellular location of prochymosin ofHcDNApolλ

Posort亞細(xì)胞定位Posortsubcellularlocation概率Probability(%)WOLFPOSORT亞細(xì)胞定位WOLFPOSORTsubcellularlocation概率Probability(%)細(xì)胞核Nuclear43．5細(xì)胞核Nuclear5細(xì)胞質(zhì)Cytoolasmic304細(xì)胞質(zhì)Cytoolasmic3線粒體Mitochondria43線粒體Mitochondria2過氧化物酶體Microbody43葉綠體Chloroplast1高爾基體Golgi87過氧化物酶體Microbody1細(xì)胞骨架Cytoskeletal43

2.2.4HcDNApolλ信號肽的預(yù)測

通過SignalP4.1Server預(yù)測HcDNApolλ的信號肽，研究表明HcDNApolλ蛋白的N端1～70個氨基酸序列之間的信號肽分值D=0.100

注：C-score:原始剪切位點分值；S-score:信號肽分值；Y-score:綜合剪切位點分值

圖4HcDNApolλ信號肽預(yù)測
Fig.4 Signal P prediction ofHcDNApolλ

2.2.5HcDNApolλ跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜內(nèi)在蛋白與膜脂相結(jié)合的主要部位，它固著于細(xì)胞膜上起錨定作用，一般由20個左右的疏水氨基酸組成。通過Expasy軟件中的TMHMM Server v.2.0工具預(yù)測HcDNApolλ編碼氨基酸的跨膜螺旋區(qū)。預(yù)測結(jié)果顯示，HcDNApolλ基因編碼的氨基酸序列中不存在跨膜螺旋區(qū)，444個氨基酸殘基全部在膜外，為非跨膜蛋白。圖5

圖5HcDNApolλ跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測
Fig.5 Predicted transmembrane domain ofHcDNApolλ

2.2.6HcDNApolλ的磷酸化位點和活性位點

磷酸化是生物體內(nèi)一種普遍的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白調(diào)控過程中起著重要的作用。磷酸化位點分析表明，HcDNApolλ有33個絲氨酸、9個蘇氨酸、2個酪氨酸磷酸化位點。利用NPS(Network Protein Sequence Analysis)的Prosite Scan 對HcDNApolλ進(jìn)行活性位點分析。結(jié)果顯示，HcDNApolλ共有9個活性位點分別是N-糖基化位點、cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、酪蛋白激酶2磷酸化位點、酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點、N-豆蔻?；稽c、ATP/GTP結(jié)合位點基序A、DNA聚合酶X信號，這些活性位點顯示HcDNApolλ可能在多個通路過程中發(fā)揮作用。表2

表2HcDNApolλ在NPS中的活性位點預(yù)測
Table 2 Scanning ofHcDNApolλfor site/signatures against proscan database in NPS

活性位點Activesite序列號Number基序類型Motiftype氨基酸序列Aminoacidsequence概率值ProbabilityN-糖基化位點N-glycosylationsitePS00001N-{P}-[ST]-{P}1114NVSR120-123NITE380-383NDTL5138e-03cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點PhosphorylationsitesofcAMPandcGMPdependentproteinkinasePS00004[RK](2)-x-[ST]107-110KRVS413-416KRGS1572e-03蛋白激酶C磷酸化位點PhosphorylationsitesofproteinkinaseCPS00005[ST]-x-[RK]25-27SEK51-53STR81-83TSK173-175SLR184-186TGK284-286SYR306-308SHK412-414SKR426-428TEK1423e-02酪蛋白激酶2磷酸化位點Phosphorylationsiteofcaseinkinase2PS00006[ST]-x(2)-[DE]16-19SSGE29-32SFSE62-65SSAE71-74TSDE84-87SFDE173-176SLRD188-191SKLE226-229TLED291-294SCGD300-303THPD334-337SEED340-343SGID378-381TGND426-429TEKE1482e-02酪氨酸蛋白激酶磷酸化位點Phosphorylationsiteoftyrosineproteinki?nasePS00007[RK]-x(2，3)-[DE]-x(2，3)-Y397-404RLDETGLYmin=4074e-04max=4083e-04N-豆蔻?；稽cN-myristoylationsitePS00008G-{EDRKHPFYW}-x(2)-[STAGCN]-{P}9-14GGNVSR68-73GTATSD169-174GIGKSL210-215GVGPAT402-407GLYLAT411-416GSKRGS415-420GSRGTA1397e-02ATP/GTP結(jié)合位點基序AMotifAofATP/GTPbindingsitePS00017[AG]-x(4)-G-K-[ST]283-290GSYR?RGKS7781e-05DNA聚合酶X信號XsignalofDNApolymerasePS00522G-[SG]-[LFY]-x-R-[GE]-x(3)-[SGCL]-x-D-[LIVM]-D-[LIVMFY](3)-x(2)-[SAP]283-302GSYR?RGKSSCGDMD?FVITHP1082e-11

2.3 qRT-PCR分析鹽脅迫下HcDNApolλ基因在同化枝中的表達(dá)

采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，以β-actin作為內(nèi)參，分別檢測不同鹽濃度脅迫不同時間下鹽穗木同化枝HcDNApolλmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，100 mmol/L NaCl脅迫處理后，HcDNApolλ在同化枝中的表達(dá)量和對照組相比沒有明顯的變化，而在300 mmol/L NaCl脅迫處理后，HcDNApolλ在同化枝中的表達(dá)明顯上調(diào)，在處理7和14 d后表達(dá)量上調(diào)了約3和5倍。在300、500和700 mmol/L NaCl脅迫下，HcDNApolλ在同化枝中的表達(dá)量均在脅迫14 d 后達(dá)到最高，約是對照的5、15和20倍。圖6

圖6 鹽穗木同化枝中HcDNApolλ響應(yīng)鹽脅迫的相對表達(dá)
Fig.6 Relative expression ofHcDNApolλresponse to salt-stress

3 討 論

DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組對于活的有機(jī)體的遺傳信息的復(fù)制、傳遞以及維護(hù)基因組的穩(wěn)定性上起著十分重要的作用[11-12]。DNA依賴的DNA聚合酶在這些過程中起著至關(guān)重要的作用[13]。數(shù)據(jù)表明在人類的基因組中至少有13種類型的DNA聚合酶，根據(jù)其氨基酸序列的同源性，DNA聚合酶 可以被分為4個不同的家族(A、B、X和Y)[14]。大量的研究表明，DNA聚合酶X家族主要參與DNA的修復(fù)和重組途徑[15-17]，哺乳動物的DNA聚合酶X家族還包括其他的3個非復(fù)制型的聚合酶(聚合酶β，μ和TdT)，聚合酶λ的結(jié)構(gòu)主要包括3個功能域：a在N端的BRCT結(jié)構(gòu)域，b在中心區(qū)域的DNA結(jié)合域，c在C端的DNA聚合酶域。生物化學(xué)的研究表明，人類的DNA聚合酶λ有3種酶的活性，DNA聚合酶活性、TdT酶活性以及5’脫氧核糖磷酸酶的活性[18]。盡管DNA聚合酶λ具有DNA聚合酶的活性，但是和復(fù)制型的聚合酶相比，它的持續(xù)合成的能力較低。這種酶的活性表明，它可能參與兩種DNA損傷修復(fù)途徑：堿基切除修復(fù)(BER)和非同源的末端連接途徑(NHEJ)[19]。DNA聚合酶和dRT裂解酶的活性在短補(bǔ)丁的BER修復(fù)中合成小片段的DNA是必須的，而DNApol λ和XRCC4、lig4以及Ku70/Ku80復(fù)合體的相互作用也表明DNApol λ也參與NHEJ。DNApol λ 參與堿基切除修復(fù)(BER)通路，在DNA氧化損傷修復(fù)中具有重要作用[20]。同時在非同源末端鏈接(NHEJ)途徑填補(bǔ)DNA末端的部分互補(bǔ)雙鏈，起到修復(fù)DNA雙鏈斷裂中節(jié)點作用[21]。

植物基因組測序表明，DNA聚合酶λ是植物聚合酶X家族的唯一成員，可能參與BER途徑和NHEJ途徑[22]。擬南芥Atpolλ在DNA損傷修復(fù)中的功能已經(jīng)有報道[23]，紫外輻射可以誘導(dǎo)Atpolλ的表達(dá)，并且擬南芥DNApol λ的突變體表現(xiàn)出對紫外-B和MMC的敏感性，而且突變體還展現(xiàn)出對高鹽和MMC處理的敏感性的增加。Atpolλ通過它的N端BRCT結(jié)構(gòu)域可以和Atlig4以及AtXRCC4相互作用[24]，表明植物的DNA pol λ在DNA損傷修復(fù)中起作用，并且可能通過NHEJ途徑參與DSBs的修復(fù)。已有的研究表明高鹽脅迫或者M(jìn)MC處理可以誘導(dǎo)擬南芥的基因組的DNA 發(fā)生雙鏈斷裂，3種擬南芥polλ的突變體(atpol λ-1、atpol λ-2和atpol λ-3)表現(xiàn)出對高鹽脅迫和MMC處理的高敏感性，而過表達(dá)Atpolλ則會增加突變體對于DNA雙鏈斷裂的修復(fù)效率[14]。

實驗利用RACE技術(shù)從鹽穗木中克隆獲得HcDNApolλ基因，通過核苷酸序列比對顯示該基因?qū)儆贒NA聚合酶X家族的成員；氨基酸序列比對也表明該基因編碼的蛋白質(zhì)具有DAN聚合酶X家族的保守結(jié)構(gòu)域，推測其可能在DNA損傷修復(fù)中起作用。HcDNApolλ的跨膜區(qū)分析，該蛋白不含跨膜區(qū)域且沒有信號肽，屬于胞內(nèi)蛋白，亞細(xì)胞定位分析定位于細(xì)胞核。蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價修飾方式之一，是真核生物細(xì)胞中一種普遍的調(diào)控手段?；钚晕稽c分析表明，HcDNApolλ編碼的蛋白質(zhì)具有多類磷酸化位點，這暗示著HcDNApolλ可能通過磷酸化和去磷酸化來實現(xiàn)活性的調(diào)節(jié)，實現(xiàn)對DNA雙鏈斷裂末端的識別以及缺口的填補(bǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)在鹽穗木中HcDNApolλ受到鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，特別是在700 mM NaCl 脅迫下，同化枝中的表達(dá)量與對照相比顯著升高。表明鹽穗木可能通過表達(dá)HcDNApolλ基因來識別并且修復(fù)基因組的DSB損傷，從而維護(hù)基因組的完整性來抵御外界的高鹽堿以及干旱的脅迫，在基因組的水平上調(diào)節(jié)生長發(fā)育來提高對環(huán)境的適應(yīng)性。

通過對鹽穗木中獲得的HcDNApolλ基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并探討了鹽脅迫下HcDNApolλ基因的表達(dá)規(guī)律，表明HcDNApolλ基因參與鹽脅迫的應(yīng)答。然而HcDNApolλ在鹽穗木中鹽脅迫下如何參與并修復(fù)DSB，這個過程是否與植物細(xì)胞周期檢驗點相關(guān)等一系列的問題還有待深入研究。鹽穗木HcDNApolλ基因的克隆以及鹽脅迫下的組織特異性表達(dá)分析，將為進(jìn)一步研究鹽穗木在鹽脅迫下植物的抗逆生理機(jī)制與DNA損傷修復(fù)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

通過RACE技術(shù)克隆獲得了鹽穗木DNA損傷修復(fù)基因HcDNA聚合酶λ(HcDNApolλ)基因的開放閱讀框為1 335 bp，編碼444個氨基酸。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，HcDNApolλ基因?qū)儆贒NA聚合酶X家族成員，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，無信號肽且不含跨膜區(qū)域的親水蛋白。實時熒光定量PCR分析表明，隨著脅迫濃度的增加，HcDNApolλ的表達(dá)逐漸上調(diào)，在300 mmol/L NaCl脅迫處理7和14 d后表達(dá)量上調(diào)3和5倍，300、500和700 mmol/L NaCl脅迫下同化枝的表達(dá)量均在脅迫14 d 后達(dá)到最高，分別是對照的5、15和20倍均在14 d時并達(dá)到峰值。HcDNApolλ基因的表達(dá)受鹽脅迫的誘導(dǎo)并影響DNA的損傷修復(fù)。

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Supported by:Special funds of Xinjiang Key Laboratory "The salt-stress responsive transcriptome of the halophyte Halostachys caspica and the functional identification of the major salt related genes"(2014KL001) and the National 973 Pre-Research Project "Physiological and molecular mechanisms of salt tolerance of desert halophytes in Xinjiang"(2012CB722204)

Cloning and Expression Analysis ofHcDNApolλGene from Halostachys caspica under Salt Stress

ZHANG Ji, DU Chi, ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

【Objective】 The expression of DNA damage repair gene under salt stress is helpful to reveal the relationship between DNA damage repair and salt tolerance of halophyte.【Method】According to the transcriptome ofHalostachyscaspicaunder salt stress, a DNA damage repair gene DNA polymerase lambda (HcDNApolλ) was cloned fromHalostachyscaspicaby RACE. 【Result】Sequence analysis indicated thatHcDNApolλcontained an open reading frame of 1,335 bp, which encodes 444 amino acids. Conserved domain analysis showed thatHcDNApolλwas the number of DNA polymerase X family, and phylogenetic tree analysis indicated thatHcDNApolλwas an independent branch, which was an stable hydrophilic proteins sub-celled nuclear. Real time fluorescent quantitative PCR analysis showed that the expression ofHcDNApolλof assimilating branches gradually up-regulated with the increase of NaCl concentration. At 300 mmol/L NaCl treatments, the expression levels ofHcDNApolλwere increased 3 fold and 5 fold for 7 days and for 14 days, respectively. Finally, at 700 mmol/L NaCl treatment for 14 days, the expression levels ofHcDNApolλincreased 20 fold and reached the peak.【Conclusion】The expression ofHcDNApolλgene could be induced by salt stress.

Halostachyscaspica;HcDNApolλgene; salt stress; expression analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.020

2016-11-18

新疆重點實驗室專項資金“鹽穗木鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組研究及重要基因的功能鑒定”(2014KL001)；國家“973”計劃前期研究專項“新疆荒漠鹽生植物耐鹽的生理及分子機(jī)制”(2012CB722204)

張冀(1991-)，男，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學(xué)，(E-mail)153315267@qq.com

張富春(1962-)，男，教授，博士，研究方向為分子生物學(xué)與基因工程，(E-mail)zfcxju@xju.edu.cn

S188

A

1001-4330(2017)02-0361-10