何 堅，梁 杰，羅慶祿△，柳維林，林如輝，5

(1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福州 350122;2.福建省運動功能康復重點實驗室，福州 350003;3.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福州 350003;4.福州市第二醫(yī)院康復科，福州 350007;5.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福州 350122)

復方三七消痛軟膏超聲導入對兔膝骨性關節(jié)炎治療作用及機制研究?

何 堅1，2，3，梁 杰4，羅慶祿1，2，3△，柳維林1，2，林如輝4，5

(1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福州 350122;2.福建省運動功能康復重點實驗室，福州 350003;3.福建中醫(yī)藥大學附屬康復醫(yī)院，福州 350003;4.福州市第二醫(yī)院康復科，福州 350007;5.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院，福州 350122)

目的:探討復方三七消痛軟膏用超聲波(US)導入對兔KOA療效及其作用機制。方法:將4月齡新西蘭大白兔40只按隨機數(shù)字表法分為復方三七消痛軟膏超聲波導入組(A組)、普通US組(B組)、舒筋止痛水外擦組(C組)、假US組(D組)和正常對照組(E組)各8只，除E組外各組動物均行雙側前交叉韌帶離斷術造模。6周后A、B、C、D組分別給予復方三七消痛軟膏超聲波導入普通US、假US、舒筋止痛水外擦干預10 d，E組不給予任何干預。干預后軟骨切片HE染色光鏡觀察形態(tài)結構及Mankin評分;采用TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡陽性比率;采用TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡陽性率，Western－blot技術檢測軟骨細胞caspase－9、caspase－3蛋白水平表達。結果:A組關節(jié)軟骨病變明顯輕于B、C、D組但較E組嚴重;A組Mankin評分低于B、C、D組、高于E組，差異有統(tǒng)計學意義。干預后A組軟骨細胞凋亡陽性率以及caspase－9和caspase－3蛋白表達均低于B、C、D組，高于E組，差異有統(tǒng)計學意義。結論:復方三七消痛軟膏超聲波導入能更好地延緩KOA軟骨退變，其機制可能是通過抑制caspase－9和caspase－3表達從而抑制軟骨細胞凋亡實現(xiàn)。

骨性關節(jié)炎;超聲波;藥物導入;軟骨;caspase

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鞯某Ｒ姽顷P節(jié)疾病，雖然其治療方法頗多，但不少方法(如口服氨基糖甙類藥物、注射透明質酸鈉、針灸、推拿)均缺乏循證醫(yī)學證據。雖然非甾體類藥物治療OA的應用具有A級證據，但其無法改變或延緩其軟骨病理改變。國內外研究證實，口服或外用中藥和超聲波(Ultrasound，US)治療KOA均有較好療效且均無明顯副作用特點［1－2］。國內外有報道［3－4］，用US導入中藥或西藥較之單純US治療KOA更有效，且可避免口服藥物依從性差的問題。我院院內制劑舒筋止痛水外擦結合拍打或相同藥物制成的復方三七消痛軟膏外擦，在治療不同部位OA方面均有良好的臨床效果。筆者研究發(fā)現(xiàn)，舒筋活血止痛水外擦拍打能降低兔KOA軟骨組織MMP－1表達［5］，但其具體機制還不十分明確。現(xiàn)代研究表明，OA的發(fā)生發(fā)展與關節(jié)軟骨細胞凋亡密切相關，而caspase－9和caspase－3分別是細胞凋亡早期和后期的信號分子。因此，我們研究復方三七消痛軟膏US導入對兔KOA軟骨形態(tài)、軟骨細胞凋亡陽性表達和凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白含量測定的影響，明確復方三七消痛軟膏US導入治療KOA的更優(yōu)療效并探討其可能的分子細胞學機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康普通級4月齡新西蘭大白兔40只(雌雄各半)，體質量(2.5±0.5)kg，由福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心飼養(yǎng)(合格證號SCXK(上海)20120011)。

1.1.2 實驗主要試劑 蛋白裂解液(碧云天P0013B)、BCA試劑盒(Thermo，MK164229)、分離膠(碧云天 P0012A)、轉移緩沖液(碧云天PA196400)、TUNEL檢測試劑盒(美國羅氏公司TUN11684817)、10%脫脂奶粉(BBI life science，B805BA0003)、PBST(上海樊克生物生物科技有限公司FK－RS2426)、Caspase－9和Caspase－3單克隆抗體(一抗，上海容創(chuàng)生物技術有限公司RCL0245)各若干瓶、辣根酶系列二抗(上海容創(chuàng)生物技術有限公司RCL0248)、顯影液(碧云天P0018);復方三七消痛軟膏(批件號閩2012S0002，批準文號閩制藥Z20120002，由福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院提供);無水乙醇(西隴化工股份有限公司，15031402)，蘇木素、伊紅染液(索萊寶20150407);防脫載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司16020)，包埋機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司20080172)，萊卡切片機(德國徠卡儀器有限公司20130215)，烤片機 (上海躍進醫(yī)療器械廠20121953)，電子顯微鏡(德國徠卡儀器有限公司20130216)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 根據SPSS13.0統(tǒng)計軟件編程并按隨機數(shù)字表法將40只新西蘭大白兔分為復方三七消痛軟膏US導入組(A組)、普通US組(B 組)、舒筋止痛水外擦組(C組)、假US組(D組)和正常對照組(E組)5組各8只。

1.2.2 兔KOA模型建立 各組動物在同等條件下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)1周后除E組外均行右側ACTL切斷術。手術參照Batist等［6］報道手術方法。術后不固定，允許籠內自由活動。并按每天15 mg/kg的劑量肌注慶大霉素(80 mg/2 ml)預防感染，連用5 d。術后分籠飼養(yǎng)，基礎飼料為標準顆粒，由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，所有工作均在遵循中華人民共和國實驗動物道德委員會關于動物保護和相關法規(guī)的指導方針下進行。

1.2.3 干預方法 造模6周后，A、B、C、D 4組兔分別固定于兔手術臺，脫去雙側膝關節(jié)處毛。其中A、B、D 3組兔采用同一型號(日本伊藤公司生產的us－700型)、同一參數(shù)(強度300 mW/cm2、通斷比為20%、頻率為3 MHz;聲頭直徑1 cm;每次10 min，每天1次，連續(xù)5 d為1個療程，停2 d再行下1個療程，共2個療程)的US儀，經水囊接觸法，分別導入復方三七消痛軟膏、普通耦合劑和普通耦合劑假US(只移動聲頭，不開啟強度開關干預)。C組去除雙膝關節(jié)周圍毛發(fā)，均勻涂上舒筋活血止痛水外擦劑，在膝關節(jié)周圍用食指、中指和環(huán)指第二指節(jié)掌面輕微拍打涂有舒筋活血止痛水處，以使藥水充分吸收，但不使動物有驚恐感為度，治療參數(shù)同A、B、D組，E組按正常飼養(yǎng)，不給予任何干預。

1.3 干預后軟骨形態(tài)學、軟骨細胞凋亡及凋亡基因Caspase蛋白表達檢測

1.3.1 干預后軟骨形態(tài)光鏡觀察及HE染色Mankin評分 干預結束后空氣栓塞法處死，將雙側膝關節(jié)分離，用咬骨鉗離斷股骨髁，用40 g/L中性甲醛緩沖液固定1～2 d，脫鈣、修塊、系列乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋及修塊。切片、裱片、烤片后，對股骨內側髁進行縱切，切片厚度為5 μm，用于形態(tài)學觀察。蘇木精－伊紅染色(HE染色)，光學顯微鏡觀察，按改良Mankin［7］進行評分:正常關節(jié)軟骨標本(0分):表層光滑、平整，軟骨細胞分布均勻，無簇聚軟骨細胞，潮線完整，染色均勻，無失染現(xiàn)象;輕度骨關節(jié)炎標本(2～7分):表層略不平整，有小裂隙，中深層有少量簇聚的軟骨細胞和單個肥大軟骨細胞，某些標本潮線斷裂或出現(xiàn)雙重潮線，染色有失染現(xiàn)象;中度骨關節(jié)炎標本(8～12分):表層不平整，有裂隙深達中、深層，部分標本表層或中層有原纖維變，中、深層細胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細胞，潮線斷裂或出現(xiàn)雙重潮線，染色不均勻，表層和中、深層有失染現(xiàn)象;重度骨關節(jié)炎標本(13～14分)表層變薄有深至軟骨下骨的裂隙，細胞排列紊亂，有大量簇聚軟骨細胞，潮線消失，染色不均勻，全層有明顯失染。

1.3.2 干預后軟骨細胞凋亡陽性表達檢測同HE染色法制取軟骨標本切片，采用TUNEL免疫熒光法測定軟骨細胞凋亡細胞陽性表達。按說明書操作檢測軟骨細胞凋亡率，石蠟包埋切片干燥后脫蠟固定;室溫下無水乙醇洗滌，依次用梯度乙醇水化，85%NaCl洗滌，PBS洗滌1次;4%多聚甲醛固定，PBS洗滌2次，滴加100 μl新鮮配制的蛋白酶K溶液，孵育10 min;PBS液清洗，用4%多聚甲醛固定，用PBS洗滌1次;滴加100 μl平衡溶液平衡10 min，避光冰水上制備rTdT孵育緩沖液;滴加上述配制的rTdT孵育緩沖液并覆蓋組織塊;37℃孵育箱中孵育60 min，蒸餾水稀釋，將玻片浸泡于Coptin管中，15 min后終止反應，用PBS洗滌，滴加1 μg/ml 的PI，避光染色15 min;PBS洗滌，梯度酒精脫水，熒光顯微鏡觀察下結果。暗室內熒光顯微鏡在波長520 nm下觀察熒光素的綠色熒光，在波長620 nm條件下觀察PI的紅色熒光，迭加后紅色背景下的顯示黃色、淡黃色、黃綠色、綠色細胞即為凋亡的軟骨細胞。熒光顯微鏡觀察下結果，暗室內熒光顯微鏡在波長520 nm下觀察熒光素的綠色熒光，在波長620 nm條件下觀察PI的紅色熒光，迭加后紅色背景下的顯示黃色、淡黃色、黃綠色、綠色細胞即為凋亡的軟骨細胞。統(tǒng)計3個視野下細胞凋亡率(凋亡細胞數(shù)/軟骨細胞總數(shù))，即凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。

1.3.3 干預后軟骨細胞Caspase－9、Caspase－3蛋白表達檢測 手術刀切取雙側脛骨平臺全層軟骨，生理鹽水沖洗，置管于－70℃液氮罐中保存，用Western－blot方法測定Caspase蛋白表達。將組織放入碾缽中加入液氮進行碾磨，直至成為細小粉末為止，將粉末收集在一定量的蛋白裂解液中(裂解液以1∶5的體積比混合，冰上勻漿;加入300 μl的蛋白裂解液提取總蛋白，加變性緩沖液煮沸10 min變性。SDS－PAGE凝膠電泳，200 mA濕轉2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉膜2 h，分別用caspase－9和caspase－3一抗(1∶100)4℃孵育過夜，TBS漂洗，ECL光化學法顯色。內參GADPH蛋白測定顯示，除一抗為抗GADPH抗體外，余步驟同前，并使用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料Mankin評分、Caspase蛋白表達值以均數(shù)±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，多重比較用SNK－q檢驗，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 干預后各組軟骨形態(tài)學比較

圖1顯示，HE染色觀察比較，A組軟骨輕度變性，軟骨表層結構稍疏松，細胞外基質輕度降解;B組和C組軟骨中度變性，細胞外基質輕度降解，表面欠光滑;D組軟骨重度變性，軟骨細胞出現(xiàn)集簇現(xiàn)象，軟骨表面粗糙，細胞外基質重度降解，關節(jié)軟骨裂隙增大;E組形態(tài)學表層細胞數(shù)稍減少，但軟骨細胞排列基本整齊，無明顯軟骨基質降解。表1顯示，Mankin評分比較，A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于 B、C2組(P＜0.051)。

圖1 干預10 d后各組股骨髁軟骨切片HE染色觀察比較(×400倍)

表1 干預后股骨髁軟骨切片HE染色光鏡觀察Mankin評分比較(±s)

表1 干預后股骨髁軟骨切片HE染色光鏡觀察Mankin評分比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.01或 P＜0.05;與單純超聲組藥物拍打組比較:★P＜0.05

組別 Mankin 分值A組 3.88±1.25*#★1.37±0.52 B組 4.45±1.28*#C組 5.37±1.60*#D組 6.75±2.25*E組

2.2 干預后各組軟骨細胞凋亡陽性率表達結果比較

表2圖2顯示，軟骨細胞凋亡率A、B、C、D組均顯著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表達A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。

2.3 干預后Western－blot檢測各組軟骨細胞凋亡基因caspase－9、caspase－3蛋白表達結果比較

表2圖2顯示，Caspase－9蛋白表達A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05或P＜0.01)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)。Caspase－3蛋白表達A、B、C、D組均著高于E組(P＜0.05或P＜0.01)，A、B、C組均顯著低于D組(P＜0.05)，A組顯著低于B、C2組(P＜0.05)顯示。

圖2 各組軟度細胞凋亡陽性表達比較

圖3 各組軟度細胞caspase-9、caspase-3蛋白含量Western-blot印跡表達比較

表2 各組軟骨細胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達值比較(±s)

表2 各組軟骨細胞凋亡率及Caspase-9、Caspase-3蛋白表達值比較(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.01;與模型組比較:#P＜0.01或 P＜0.05;與單純超聲組藥物拍打組比較:★P＜0.05

3 討論

KOA的主要病理變化是關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨增生，骨贅形成，刺激周邊組織引起疼痛。隨著時間延長，關節(jié)間隙變窄、關節(jié)變形，導致關節(jié)僵硬、活動度降低影響日常生活。因此，其治療根本是促進軟骨合成和延緩軟骨退變。多數(shù)KOA患者就診是因為出現(xiàn)疼痛，雖然目前緩解疼痛的方法頗多，但均存在一定的缺陷。如口服非甾體類藥物可能有胃腸道刺激甚至出現(xiàn)消化道出血，且無法改變軟骨退變;口服氨基糖甙類藥物療程長、費用高;關節(jié)腔注射玻璃酸鈉存在可能損傷軟骨的風險;口服中藥也存在味苦、煎藥耗時、療程長等問題。因此，尋求一種簡單、方便、有效的KOA是當務之急。

隨著現(xiàn)代康復技術在我國大陸應用的快速發(fā)展，不少物理因子可緩解KOA疼痛，但由于作用機制不一，某些物理因子(如濕熱敷、紅外線)無法作用于關節(jié)深層組織，對關節(jié)軟骨的作用有限。而Korstjens［8］等也發(fā)現(xiàn)，低強度脈沖超聲波(low intensity pulse US，LIPUS)可促進體外干預軟骨細胞增殖以及細胞外基質的合成。高明霞等［9］用LIPUS可以減輕關節(jié)軟骨ECM的損傷程度，其作用與LIPUS治療后關節(jié)軟骨中p38、ERK1/2表達下調有關，并從軟骨的合成方面證實US治療KOA的效果和機制。然而KOA的發(fā)生除軟骨合成減少外，軟骨細胞過度凋亡也是KOA發(fā)生發(fā)展的重要原因。有研究證實，US較毫米波、超短波、低功率激光、脈沖電磁場能更好地抑制兔KOA模型軟骨細胞凋亡，從而延緩軟骨細胞退變［10－11］。表1、2、圖1、2顯示，本次的研究證實，單純US可以抑制軟骨細胞凋亡，延緩軟骨退變，臨床也證實US治療能改善KOA患者功能［12］。

表2圖3顯示，雖然單純US能較好地緩解KOA疼痛癥狀且能延緩軟骨退變，但一些研究發(fā)現(xiàn)，應用US機械振動原理導入一些藥物能更好地促進局部藥物吸收，起到US和藥物的雙重效果，且減少口服藥物對胃腸道刺激的副作用或單純局部外用藥物吸收率低的問題［3－4］。因此，我們用US導入我院院內制劑復方三七消痛軟膏(該方主要由川烏、草烏、紅花、當歸、川芎等組成，具有祛風除濕、活血化瘀、宣痹止痛、補腎強筋功效，符合KOA發(fā)病的中醫(yī)病因病機)治療KOA，并與該方的酊劑(舒筋止痛水)外擦和單純超聲波治療KOA療效作比較。同時研究其作用機制發(fā)現(xiàn)，US導入復方三七軟膏在抑制軟骨細胞凋亡、延緩軟骨退變效果均優(yōu)于單純US或其酊劑外擦拍打法。而軟骨細胞凋亡信號caspase－9和caspase－3蛋白含量發(fā)現(xiàn)，US導入復方三七消痛軟膏、單純US或舒筋止痛水外擦怕打，均能不同程度地降低 caspase－9和 caspase－3蛋白表達，抑制軟骨凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，復方三七軟膏方中的川芎成分川芎嗪能抑制OA軟骨細胞caspase－9蛋白表達，以治療軟骨破壞［13］;當歸注射液能通過調節(jié)與軟骨細胞凋亡有關的PI3K/AKT蛋白含量，延緩軟骨退變［14］。而本研究證實，由當歸、川芎、懷牛膝等組成的復方三七消痛軟膏同樣能抑制軟骨細胞caspase－9和caspase－3表達(表2，圖3)。

我們的研究結果顯示，US導入復方三七軟膏、復方三七軟膏外用和單純US治療KOA均有一定效果，其機制可能是通過抑制軟骨細胞凋亡相關因子caspase－3和caspase－9的蛋白表達來實現(xiàn)的。同時筆者認為，用US導入復方三七軟骨治療KOA具有以下優(yōu)點:一是能使中藥直達關節(jié)深部組織，解決口服中藥存在對胃腸道刺激且依從性差問題;二是與傳統(tǒng)針灸、推拿比較，能夠減少治療時間，US導入治療一般是5～10 min，后者一般要30～40 min;三是醫(yī)療費用低，US導入治療一般收費40元，而藥物、針刺、推拿、關節(jié)腔注射收費基本上百元。因此，筆者認為，臨床KOA的康復治療方法，應充分發(fā)揮中西醫(yī)各自的優(yōu)點或中西醫(yī)結合優(yōu)勢，我們提倡有條件的醫(yī)療單位可使用US治療KOA;如果能夠研制出針對KOA病因病機的中藥制劑，結合US導入，效果更明顯，值得今后進一步研究應用。

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Study of Therapeutic Effects and Mechanisms of Ultrasound Phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste for Treatment Knee Osteoarthritis in Rabbits

HE Jian2，3，LIANG Jie4，LUO Qing－lu1，2，3△，LIU Wei－lin1，2，LIN Ru－h(huán)ui4，5
(1．College of rehabilitation medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou Fujian，350122，China; 2．The key laboratory of Motor Function of Fujian，F(xiàn)uzhou Fujian 350003，China;3．Affiliated Rehabilitation Hospital Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou Fujian 350003，China;4．The second hospital of Fuzhou，F(xiàn)uzhou，350007，China;5．Fujian Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350122，China)

Objective:Observing the theraputic effects and studying the mechanisms of US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste in KOA rabbits.Methods:Four month old，40 white New Zealand rabbits，were randomly divided into US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste(A group)，normal US(B group)，ShuJinZhiTong water local external pat(C group)，sham normal US(D group)and nornal controls(E group)groups.All were subjected to double knee anterior cruciate ligament abscise(ACLA)except E group，each group included 8 rabbits.Six weeks after surgery，A，B，C，D group(surgical knee joint)were interrupted with US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste，normal US，ShuJinZhiTong water local external pat，sham normal US for 8 min per day for 10 days(5 days after exposure，stopping 2 days，continue，exposure 5 days)，respectively.After 10 days intervention，all rabbits were sacrificed by air injection.The cartilaginous tissue was stained with Hematoxylin and Eosin(H＆E)and observed chondrocyte morphology by light microscopy and Mankin’s score were counted.Chondrocytes apoptosis were detected by TUNEL.Incide tibial plate full－thickness cartilage for apotposis gene of caspase－9 and caspase－3，measurement the protein content by Western－Blot in chondrocyte.Results The Mankin scores in A groups was significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.The apoptosis of chondrocytes and the caspase－9，caspase－3 protien expression in A groups were significantly lower than B，C，D groups，and significantly higher than E group.Conclusions US phoresis Compound Sanqi Xiaotong Paste can regress cartilage apomorphosis for treatment OA，and superior to the general US interruption.It downregulated the expression of caspase－9 and caspase－3 protien in chondrocyte，which it may be the theraputic signal molecules.

Osteoarthritis;Ultrasound;Drug phoresis;Chondrocyte;Caspase

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0191－05

2016－08－07

國家自然科學基金資助項目(81273774)

何 堅(1970－)，男，副教授，醫(yī)學碩士，從事骨關節(jié)疾病的中醫(yī)推拿研究。

△通訊作者:羅慶祿(1973－)，男，副教授，醫(yī)學博士，從事骨關節(jié)疾病的現(xiàn)代康復研究，E－mail:luo_qinglu@126.com。