符金華， 姜文娟*， 楊琳芬， 邢 磊， 尹騰桂，王琤，金海虹， 樊 晶

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330096；2.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013）

檢測(cè)分析

檢測(cè)飼料中維生素B含量的色譜條件優(yōu)化

符金華1， 姜文娟1*， 楊琳芬1， 邢 磊1， 尹騰桂1，王琤韋華2，金海虹1， 樊 晶1

（1.江西省獸藥飼料監(jiān)察所，江西南昌 330096；2.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330013）

本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)飼料維生素B1含量是采用高效液相色譜法，通過(guò)建立國(guó)標(biāo)法和優(yōu)化法兩種色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，其中優(yōu)化法色譜條件為：色譜柱：ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron；流動(dòng)相配比：流動(dòng)相水相：甲醇=85∶15；流動(dòng)相流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：8 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：249 nm。結(jié)果表明：優(yōu)化法保留時(shí)間為7.3 min，而國(guó)標(biāo)法保留時(shí)間為20 min，另根據(jù)所測(cè)線性關(guān)系得R值為0.999，重復(fù)性與精密度均符合要求。因此，優(yōu)化法條件下對(duì)于維生素B1的測(cè)定具有快速高效，重復(fù)性好，靈敏度高，實(shí)用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。

維生素B1；色譜條件優(yōu)化；高效液相色譜法

目前檢測(cè)維生素B1含量的方法有分光光度法、電化學(xué)法、薄層色譜法等，但是這些方法只適用于簡(jiǎn)單的如維生素片劑、谷物等樣品的檢測(cè)。若需檢測(cè)成分復(fù)雜的飼料樣品，上述方法均存在局限性。高效液相色譜法技術(shù)相對(duì)成熟，前處理步驟簡(jiǎn)單，對(duì)于操作技術(shù)要求并不是太高，并且可以一次性大批量檢測(cè)。因此本實(shí)驗(yàn)建立不同高效液相色譜條件，測(cè)定飼料中維生素B1含量，通過(guò)比較獲得更佳的檢測(cè)條件。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 硫胺素標(biāo)準(zhǔn)品—鹽酸硫胺素、庚烷磺酸鈉、甲醇、乙醇、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、冰乙酸、三乙胺等試劑均為優(yōu)級(jí)純，含量不低于99.7%。

實(shí)驗(yàn)中所有用水均為超純水，符合 GB/T 6682中1級(jí)用水規(guī)定。

1.1.2 儀器 不同規(guī)格棕色容量瓶若干；超聲波提取器：AUTOSCIENCE AS3120 Ultrasonic Cleaner廣州諾盾科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)：TGL—16G上海安亭科學(xué)儀器廠；濾膜：0.22/0.45 μm（水系有機(jī)PTFE）上海嘉措儀器設(shè)備有限公司；真空泵：鞏義市英峽予華儀器廠；電子天平：JA10003上海宏衡實(shí)業(yè)有限公司；高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1260 Infinity（含紫外檢測(cè)器，美國(guó)）。

1.1.3 樣品 5%青年蛋雞復(fù)合預(yù)混合飼料（A樣）、10%后備母豬復(fù)合預(yù)混合飼料（B樣）。

1.2 實(shí)驗(yàn)前處理

1.2.1 上機(jī)前處理 提取液：在1000 mL容量瓶中裝入約700 mL超純水，加入50 mg EDTA、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混勻后用超純水定容，即得提取液水相。按水相∶甲醇=86∶14或85∶15作為不同色譜條件下維生素B1提取液。

流動(dòng)相：在1000 mL容量瓶中裝入約700 mL超純水，加入50 mg EDTA、1.1 g庚烷磺酸鈉（精確至0.001 g）、25 mL乙酸、5 mL三乙胺，充分混勻后用超純水定容。調(diào)節(jié) pH至 3.40±0.02，過(guò)0.45 μm濾膜超聲脫氣，即得流動(dòng)相水相。

1.2.2 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液前處理 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備液：于100 mL棕色容量瓶中加入維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g與25%乙醇溶液，超聲15 min待全部溶解，用乙醇溶液定容。此溶液濃度為500 μg/mL，置冰箱中低溫保存。

維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液：于50 mL棕色容量瓶中加入5 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用流動(dòng)相定容。該標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為50 μg/mL，并以此梯度稀釋5個(gè)濃度：50、25、20、5、1 μg/mL。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取A樣4.70 g、B樣4.73 g（兩種飼料分別稱(chēng)取兩份平行樣），再分別加入到100 mL棕色容量瓶中，并做好標(biāo)記，加入適量提取液超聲20 min，待冷卻至室溫后用提取液定容至刻度，12000 r/min離心12 min，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待上機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件的選擇

1.3.1.1 國(guó)標(biāo)法 GB/T14701-2002標(biāo)注的色譜柱為NoVa-pak C18（3.9×150 nm，4-Microm）；實(shí)驗(yàn)用色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6×150 nm，5-Microm）；流動(dòng)相配比為流動(dòng)相水相∶甲醇=86∶14；流動(dòng)相流速為0.80 mL/min；柱溫為28℃；進(jìn)樣體積為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為246 nm。

1.3.1.2 優(yōu)化法 色譜柱為 ZORBAX SB-C184.6×150 mm 5-Micron；流動(dòng)相配比為流動(dòng)相水相∶甲醇=85∶15；流動(dòng)相流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為8 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為249 nm；選用20 μg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液分別在國(guó)標(biāo)法和優(yōu)化法的色譜條件下上機(jī)測(cè)定，比較相同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液在不同色譜條件下的測(cè)定結(jié)果，選出最適合的色譜條件。

1.3.2 線性測(cè)定 將1.2.2所得各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄結(jié)果。

1.3.3 重復(fù)性測(cè)定 分別取1.2.3中所得同一種飼料樣品的兩份平行樣溶液20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄其色譜圖及所得數(shù)據(jù)。

1.3.4 精密度測(cè)定 連續(xù)取6份1.2.3中所得同種飼料中同一份平行樣品溶液20 μL注入液相色譜儀中操作，記錄其色譜圖及所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確立 選用20 μg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液分別在國(guó)標(biāo)法和優(yōu)化法的色譜條件下上機(jī)測(cè)定，根據(jù)兩種條件下所得圖譜可知：在優(yōu)化法的色譜條件下峰成正態(tài)分布，峰形穩(wěn)定，吸收最強(qiáng)，且干擾較少，保留時(shí)間短 （結(jié)果見(jiàn)圖 1，為7.3 min）；而在國(guó)標(biāo)法的色譜條件下，機(jī)械平衡十分不穩(wěn)定，干擾非常大，峰形不明顯，且保留時(shí)間較長(zhǎng)（結(jié)果見(jiàn)圖2，為20 min）。故本實(shí)驗(yàn)選擇優(yōu)化法色譜條件來(lái)測(cè)定維生素B1的含量。

圖1 20 μg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖（優(yōu)化法）

圖2 20 μg/mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖（國(guó)標(biāo)法）

2.2 線性范圍 將1.2.2所得各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別取20 μL注入液相色譜儀中分析，記錄色譜圖，以溶液濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表1，線性回歸方程為y=20.20x+4.15，相關(guān)系數(shù)R=0.999。結(jié)果表明，維生素B1在1～50 μg/mL時(shí)，溶液濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3 樣品的測(cè)定 取樣品按照1.2.3中的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，按照1.3.1.2中的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算飼料中維生素B1的平均含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

分析數(shù)據(jù)可知，對(duì)同一樣品同時(shí)測(cè)定兩次，由于實(shí)驗(yàn)中所測(cè)兩種飼料樣品中維生素B1的含量均小于5.00×102mg/kg，其中B樣10%后備母豬復(fù)合預(yù)混合飼料兩次所測(cè)的實(shí)際相對(duì)偏差為0.13%（見(jiàn)表2），遠(yuǎn)小于理論上所得結(jié)果的相對(duì)偏差±10.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

表1 不同濃度維生素B1標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)應(yīng)峰面積及其線性關(guān)系表

表2 飼料樣品中維生素B1的測(cè)定結(jié)果

2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)該儀器進(jìn)行精密度分析，取其中一種樣品分析如B樣10%后備母豬復(fù)合預(yù)混合飼料，結(jié)果顯示其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為1.18%（n=6），表明儀器的精密度良好。

表3 飼料樣品中維生素B1的精密度測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)前處理

3.1.1 提取液的選擇 梁琳等（2016）研究表明，以水—甲醇—乙酸（RSD=0.33%）作為提取液比以流動(dòng)相（RSD=0.55%）或水相（RSD=1.19%）作為提取液時(shí)，實(shí)驗(yàn)儀器精密度更高，因此本實(shí)驗(yàn)在飼料中提取維生素B1時(shí)，選用水—甲醇—乙酸作為提取液。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 參考李勝祥等（2009）和黃榕珍（2005）研究，若在試驗(yàn)中選擇己烷磺酸鈉代替庚烷磺酸鈉作為流動(dòng)相組成成分，發(fā)現(xiàn)所得色譜峰拖尾嚴(yán)重，峰形不佳，結(jié)果表明，選用己烷磺酸鈉代替庚烷磺酸鈉效果并不理想；另外，結(jié)合國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)維生素B1片物質(zhì)檢查流動(dòng)相的選擇與梁琳等（2016）的研究，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相選擇添加甲醇、乙酸、三乙胺與庚烷磺酸鈉，并調(diào)節(jié)其pH為3.4左右時(shí)，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，用此流動(dòng)相色譜峰峰形良好，保留時(shí)間縮短，即在很大程度上提高效率。

3.1.3 維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的保存 由于硫胺的不穩(wěn)定性，遇熱、紫外線、氧氣都易分解或變質(zhì)，而其在酸性溶液中很穩(wěn)定（常溫下pH一般為3.5）。因此本實(shí)驗(yàn)選擇鹽酸硫胺素作為維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品。在配制過(guò)程中，必須使用棕色容量瓶且在避光環(huán)境下操作，否則會(huì)改變其性質(zhì)，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。另外介于硫胺素的不穩(wěn)定性，此次實(shí)驗(yàn)中所有標(biāo)準(zhǔn)液都必須現(xiàn)用現(xiàn)配，使用完畢后必須置于低溫避光環(huán)境中保存，以便重復(fù)利用，但是必須保證不得超過(guò)三個(gè)月期限。

3.1.4 樣品前處理 由于飼料中成分較為復(fù)雜，雜質(zhì)色譜峰易形成干擾，因此在上機(jī)前必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理，有利于分離目標(biāo)物質(zhì)，同時(shí)盡量減少對(duì)色譜柱的損害。另外在樣品的提取過(guò)程中，采用超聲波提取法而不是高溫水浴提取法，這是由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在超聲波提取器中超聲20 min，可以保證維生素B1充分溶解，說(shuō)明該方法能夠方便快捷的提取飼料中的維生素B1，提取效果好，并且可以減少人力物力，提高效率。

3.2 色譜條件選擇

3.2.1 色譜柱的選擇 一般對(duì)水溶性維生素進(jìn)行分析時(shí)，采用C18色譜柱，其保留性強(qiáng)，分離效果好，本實(shí)驗(yàn)所使用的色譜柱同樣為C18色譜柱，長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm，比國(guó)標(biāo)法標(biāo)注的色譜柱內(nèi)徑和粒度都略大，可以承受更大的壓力和流速，提高分析效率。實(shí)驗(yàn)證明，優(yōu)化法條件下的色譜峰正態(tài)分布較好，柱效較高。

3.2.2 流動(dòng)相配比的選擇 當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，保留時(shí)間長(zhǎng)。呂慧卿（2008）比較流動(dòng)相中水相與甲醇的配比，以保留時(shí)間和峰面積作為檢測(cè)指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，增加甲醇比例可以減少出峰時(shí)間，但是色譜峰分離度較差。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)中選用的甲醇體積分?jǐn)?shù)為15%左右。

3.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 張權(quán)等 （2012）和梁琳（2016）研究表明，維生素B1在246 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，但其受雜質(zhì)影響較大，而在250 nm處同樣有較大吸收波長(zhǎng)。因此本次實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化法綜合考慮選擇249 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于大批量測(cè)定不同飼料中維生素B1含量時(shí)，采用優(yōu)化法色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，所耗時(shí)間更少，所得峰形更穩(wěn)定，能準(zhǔn)確的測(cè)定飼料中維生素B1的含量。為我們?cè)谑褂貌煌吞?hào)的儀器設(shè)備時(shí)，優(yōu)化色譜條件提供一定的參考。

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This experiment established the high performance liquid chromatography（HPLC）method to detect the content of vitamin B1in feed.Two methods of national standard method and the optimization method are adopted.The optimization method of chromatographic conditions were：chromatographic column of ZORBAX SB-C184.6×150 nm 5-Micron，water phase flow of matched：mobile phase：pure methanol=85∶15，mobile phase flow rate of 1 mL/min，column temperature of 35℃，sample size of 8 μL，detection wavelength of 249 nm.The results showed that the retention time of optimization method for 7.3 min，and national standard method of retention time is about 21 min，the linear correlation coefficient R value is 0.999，repeatability and precision meet the requirements.It was concluded that the optimization method for the determination of vitamin B1was more practical，more fast and efficient，and had good repeatability，high sensitivity，etc.

vitamin B1；chromatographic conditions optimization；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2017）05-0031-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170507

*通訊作者