冷光朋， 劉開祥， 李 浩， 廖小明， 安 祥， 李 偲， 楊 陽

肢體缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響

冷光朋1， 劉開祥1， 李 浩1， 廖小明2， 安 祥1， 李 偲1， 楊 陽1

目的 探討肢體缺血預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的影響。方法 將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血預(yù)處理組(LIPC組)、3-甲基嘌呤組(3-MA組)，每組15只。制作腦缺血再灌注、肢體缺血預(yù)處理及3-MA干預(yù)大鼠模型，在腦缺血2 h再灌注24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分和腦梗死體積測(cè)定，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，Western Bloting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表達(dá)。 結(jié)果 與I/R組比較，LIPC組神經(jīng)功能缺陷評(píng)分降低(P<0.05)，腦梗體積明顯減小(P<0.05)，細(xì)胞損傷、壞死減輕(P<0.05)，Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)。結(jié)論 LIPC對(duì)缺血再灌注損傷大腦具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減弱自噬水平有關(guān)。

腦缺血； 肢體缺血預(yù)處理； 自噬； Beclin-1； Cathepsin B

缺血性腦卒中是一種復(fù)雜的多因素疾病，傳統(tǒng)的恢復(fù)缺血區(qū)域的血流灌注，會(huì)導(dǎo)致缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)，在這種情況下，需要對(duì)新的神經(jīng)保護(hù)措施進(jìn)行探索。肢體缺血預(yù)處理(limb ischemic preconditioning，LIPC)，是指預(yù)先給予肢體反復(fù)短暫的缺血再灌注，激發(fā)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，以提高組織耐受隨后持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間缺血的能力，減輕臟器損傷的現(xiàn)象[1]。研究發(fā)現(xiàn)，LIPC對(duì)缺血再灌注損傷大腦有保護(hù)作用，但它的可能作用機(jī)制卻有待深入研究。

自噬(autophagy)是一種溶酶體參與的物質(zhì)分解代謝過程，主要降解細(xì)胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)自噬體為標(biāo)志的細(xì)胞自我消化過程[2]。自噬作為一條重要的蛋白降解途徑，在I/R中參與的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察LIPC對(duì)損傷大腦自噬相關(guān)因子的影響，為進(jìn)一步研究LIPC的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性Wistar大鼠，清潔級(jí)，共60只，體重(250±30)g，桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。按隨機(jī)分組原則分成假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、肢體缺血預(yù)處理組(LIPC組)、3-甲基嘌呤組(3-MA組)，每組大鼠15只。

1.2 主要試劑與儀器 兔抗鼠Beclin-1多克隆抗體、兔抗鼠Cathepsin B多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，鼠β-actin一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG(中杉金橋生物有限公司)，BCA試劑盒(碧云天生物科技公司)，3-甲基嘌呤組(Selleck生物科技有限公司)，雙極電凝器(廣州醫(yī)用電子儀器廠)，Western Bloting電泳設(shè)備(美國通用電氣公司)。

1.3 腦缺血再灌注模型的建立 I/R組、LIPC組、3-MA組參照Longa等方法制作局灶性腦缺血再灌注模型。鼠稱重，10%水合氯醛按0.30 ml/100 g腹腔注射麻醉，取仰臥位固定頭部及四肢，頸部備皮，碘伏消毒，酒精脫碘，取頸部正中部位切開皮膚，鈍性分離筋膜及肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，蛙心夾夾閉CCA及ICA遠(yuǎn)心端，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端，近心端掛線備用，血管剪于ECA上取一小口，插入石蠟線栓，備用的掛線打結(jié)固定線栓，血管剪離斷ECA遠(yuǎn)心端。線栓從ECA逆行插向CCA分叉處，再將線栓轉(zhuǎn)至ICA，松開此處的蛙心夾，經(jīng)ICA入顱感到有阻力為止，此時(shí)插入深度約為18 mm～20 mm，線栓頭部位于大腦中動(dòng)脈起始部，松開CCA處的血管夾，縫合皮膚。缺血2 h時(shí)，抽提線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組僅分離暴露血管，不做線栓處理。

1.4 遠(yuǎn)隔缺血預(yù)處理模型的建立 腦缺血再灌注模型建立前30 min進(jìn)行，在雙側(cè)后肢股部備皮，碘伏消毒，酒精脫碘，沿血管走行縱向切開皮膚、筋膜，鈍性分離股動(dòng)脈，下方穿4-0手術(shù)絲線。通過上提絲線并用蛙心夾夾閉5 min，造成肢體缺血，松開蛙心夾，恢復(fù)血流灌注5 min，反復(fù)循環(huán)3次，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血再灌注損傷的肢體預(yù)處理操作。Sham組和I/R組僅分離暴露血管。

1.5 3-MA藥物干預(yù) 在缺血30 min前，3-MA組大鼠腹腔注射3-MA(15 mg/kg)，Sham組、I/R組、LIPC組注射與3-MA組相當(dāng)?shù)纳睇}水。

2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

2.1 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 按照Longa等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各組均在再灌注24 h后進(jìn)行評(píng)分。神經(jīng)功能缺陷評(píng)分在1～3分為模型成功，0分和4分為模型不成功，予以剔除，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中及時(shí)補(bǔ)充剔除出組的動(dòng)物，保證每組動(dòng)物數(shù)。

2.2 TTC染色 再灌注24 h后，各組隨機(jī)取5只大鼠迅速斷頭取腦。將腦組織置于-20 ℃冰箱冷凍20 min，冠狀位間隔2 mm連續(xù)切取5個(gè)腦片，置于2%的TTC溶液中，37 ℃水浴30 min，正常組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色。染色后將腦組織置入4%多聚甲醛中固定，數(shù)碼相機(jī)拍照，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，用Image-Pro Plus 5.1軟件進(jìn)行圖像分析，根據(jù)公式計(jì)算腦梗死體積。

2.3 HE染色 各組隨機(jī)取5只大鼠，處死2 min內(nèi)取腦組織，選取視交叉后1 mm至乳頭體之間的腦組織，冠狀位向后取2 mm厚度，4%多聚甲醛溶液固定腦組織，脫水，石蠟包埋，切片處理，HE染色，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察組織細(xì)胞病理改變。

2.4 Western Bloting檢測(cè)Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達(dá) 各組隨機(jī)取5只大鼠，斷頭取腦，迅速分離腦梗死皮質(zhì)部分，加入約5倍體積細(xì)胞裂解液，使用手持電動(dòng)勻漿器將組織塊制備成組織勻漿，勻漿后冰上放置30 min，4 ℃、12.000 r/min，離心30 min，小心取上清。BCA法測(cè)定腦組織提取物的蛋白濃度后，等體積配平。根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12% SDS-PAGE凝膠，上樣量20 μl/lane，80 V 60 min濃縮，160 V 80 min進(jìn)行電泳分離。PVDF膜在無水乙醇里浸泡10 s后將海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜一起放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡3 min，按照海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿依次順序裝好轉(zhuǎn)膜裝置(膜靠紅色電極一邊)120 V 150 mA轉(zhuǎn)膜60 min。敷一抗，4℃過夜。15 ml TBST洗膜4次，每次8 min。敷二抗，室溫輕搖2 h。15 ml TBST洗膜4次，每次8 min，化學(xué)發(fā)光顯色。

3 結(jié) 果

3.1 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分結(jié)果 Sham組反應(yīng)靈敏，無神經(jīng)功能障礙，與Sham組比較，I/R組，LIPC組，3-MA組均出現(xiàn)程度不同的神經(jīng)功能障礙(P<0.05)。與I/R組比較，LIPC組癥狀評(píng)分明顯降低(P<0.05)。LIPC組與3-MA組比較無顯著差異(P>0.05)(見表1)。

組別神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(分)n=15腦梗死體積(%)n=5Sham組I/R組LIPC組3?MA組02．40±0．737?1．80±0．862?#1．60±0．828#▽037．00±0．30?29．30±0．11?#16．67±0．50#▽

注：與Sham組比較*P<0.05，與I/R組比較#P<0.05，與LIPC組比較▽腦梗死體積P<0.05；神經(jīng)功能缺陷評(píng)分P>0.05

3.2 腦梗死體積測(cè)定結(jié)果 TTC染色后，肉眼觀正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)呈白色。與Sham組比較，I/R組，LIPC組，3-MA組均出現(xiàn)程度不同的腦梗死(P<0.05)，其中I/R組的梗死區(qū)面積最大。其中I/R組的梗死區(qū)面積最大。與I/R組比較，LIPC組腦梗體積顯著減小(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組腦梗體積減小(P<0.05)(見表1、圖1)。

3.3 病理形態(tài)學(xué)觀察 HE染色后，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察，Sham組細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜完整，核居中，胞質(zhì)可見尼氏小體，無病理學(xué)改變。與Sham組比較，I/R組細(xì)胞呈急性缺血性改變，胞質(zhì)為深紅染，細(xì)胞縮小變形，胞核固縮，胞質(zhì)內(nèi)尼氏小體消失(P<0.05)。與I/R組比較，LIPC組腦組織病理學(xué)改變明顯減輕(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組細(xì)胞損傷減輕(P<0.05)(見圖2)。

3.4 腦缺血再灌注后各組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Cathepsin B的表達(dá) 與Sham組比較，I/R組Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)；與I/R組比較，LIPC組Beclin-1、Cathepsin B的蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.05)；與LIPC組比較，3-MA組Beclin-1、Cathepsin B蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)(見表2、圖3、圖4)。

圖1 TTC染色(A：Sham組；B：I/R組；C：LIPC組)

圖2 HE染色(×400：A：Sham組；B：I/R組；C：LIPC組；D：3-MA組)

圖3 Cathepsin B表達(dá)

圖4 Beclin-1表達(dá)

組別Beclin?1(n=5)CathepsinB(n=5)Sham組I/R組LIPC組3?MA組0．400±0．0461．526±0．297?1．000±0．030?#0．711±0．035#▽0．148±0．0510．799±0．136?0．595±0．089?#0．348±0．064#▽

注：與Sham組比較*P<0.05；與I/R組比較#P<0.05；與LIPC組比較▽P<0.05

4 討 論

腦缺血再灌注損傷已成為人類健康和生命的一大威脅，如何減輕再灌注損傷成為眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，LIPC對(duì)再灌注損傷器官的保護(hù)作用可能與改善微循環(huán)、維持和改善能量代謝、抑制炎性細(xì)胞的激活、減輕自由基產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)的釋放等有關(guān)[3～5]。但是，LIPC對(duì)腦缺血再灌注損傷大腦自噬影響的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)通過反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，I/R組的大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分及腦梗體積增大，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，而LIPC對(duì)大腦有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，表現(xiàn)為神經(jīng)功能障礙評(píng)分降低，腦梗體積減小，細(xì)胞病理形態(tài)學(xué)改變減小，3-MA則能夠增強(qiáng)LIPC的腦保護(hù)作用。

生理狀態(tài)下，自噬在細(xì)胞內(nèi)的水平較低，在營養(yǎng)缺乏或能量需求增高時(shí)，自噬過程被激活，對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持起著重要作用[6]。但是，過度的激活自噬，細(xì)胞器和蛋白質(zhì)會(huì)被大量破壞而引起細(xì)胞死亡-Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，即非凋亡形式的程序性細(xì)胞死亡[7]，由此可見，自噬對(duì)組織細(xì)胞的作用具有兩面性。Cathepsin B是含量最豐富的溶酶體酶之一，其在自噬的降解過程中起重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Cathepsin B的研究結(jié)果顯示，LIPC組Cathepsin B的蛋白表達(dá)較I/R組降低(P<0.05)，而3-MA組的蛋白表達(dá)更低(P<0.05)。Beclin-1是酵母Atg6的同源體，是哺乳動(dòng)物一個(gè)特異性的自噬蛋白，可調(diào)控自噬體的生成，是細(xì)胞自噬啟動(dòng)的標(biāo)志基因，它的過度表達(dá)可以加速細(xì)胞自噬的發(fā)生，故其表達(dá)增強(qiáng)可作為自噬水平增強(qiáng)的重要指標(biāo)[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較之Sham組，I/R組Beclin-1的蛋白表達(dá)亦呈明顯的升高趨勢(shì)(P<0.05)，與I/R組相比，LIPC組的蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，與LIPC組相比，3-MA組的蛋白表達(dá)更低(P<0.05)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型發(fā)現(xiàn)，I/R能夠激活自噬，造成腦組織的損傷，而LIPC可能通過逆轉(zhuǎn)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Cathepsin B的過高表達(dá)，從而降低神經(jīng)功能障礙評(píng)分，減小腦梗死體積和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的病理損傷，自噬抑制劑3-MA能夠增強(qiáng)LIPC的腦保護(hù)作用。本研究通過觀察LIPC對(duì)腦缺血再灌注損傷后自噬的影響，并探討自噬在LIPC中對(duì)缺血腦組織的作用，為臨床上缺血性腦血管病的防治提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Influences of limb ischemic preconditioning on autophagy in rats with cerebral ischemia reperfusion injur.

LENGGuangpeng，LIUKaixiang，LIHao，etal.

(DepartementofNeurology，AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin541000，China)

Objective To study influences of limb ischemic preconditioning on autophagy in rats with cerebral ischemia reperfusion injure. Methods Sixty male Wistar rats were divided into sham operation group(Sham group)、cerebral ischemia reperfusion group(I/R group)、limb ischemic preconditioning group(LIPC group)、3-methlyadenine group(3-MA group)，15 rats in each group. Cerebral ischemia reperfusion，limb ischemic preconditioning and 3-MA intervention model were made，Neurological function deficit score and infarct volume determination were conducted after ischemia 2 h and reperfusion 24 h，HE staining was used to observe morphological changes of cell，the protein expression of Beclin-1、Cathepsin B were tested by Western blotting. Results Compared with I/R group，neurological function deficit score and infarct volume determination were reduced significantly(P<0.05)，the cell damage and necrosis were reduced(P<0.05)，the protein expression of Beclin-1、Cathepsin B decreased significantly(P<0.05). Conclusion LIPC has protective effects on ischemic reperfusion injury of the brain，probably through reduction of autophagy level.

Cerebral ischemia； Limb ischemic preconditioning； Autophagy； Beclin-1； Cathepsin B

2016-11-12；

2017-03-04

廣西省自然科學(xué)基金(No. 2012GXNSFAA053102)；廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃(No. YCSZ2014207)

(1.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541000；2.桂林醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541100)

劉開祥，E-mail：743192848@qq.com

1003-2754(2017)03-0234-04

R743.3

A