袁 寧， 許宏偉， 劉學軍

巨噬細胞移動抑制因子-173G/C基因多態(tài)性分布及其與腦梗死關系的研究

袁 寧1，2， 許宏偉1， 劉學軍2

目的 探討巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)-173G/C基因多態(tài)性及其與腦梗死關系。 方法 篩選298例腦梗死患者及203例健康人群為研究對象，用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析法檢測MIF基因-173G/C多態(tài)性在腦梗死組和正常對照組的基因頻率。結果 腦梗死組和對照組存在MIF基因-173G/C多態(tài)性，但MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。結論 MIF -173G/C多態(tài)性可能與腦梗死發(fā)生無關，G/C等位基因可能不是腦梗死發(fā)病的獨立危險因素。

腦梗死； 巨噬細胞移動抑制因子； 基因； 多態(tài)性

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)于1966 年分別由Bloom和David兩組科學家在用豚鼠進行遲發(fā)性超敏反應研究中發(fā)現，是機體內一種重要的細胞因子。其能促進巨噬細胞在炎癥局部的聚集、增生、活化，增強其粘附、吞噬作用，促進分泌一些細胞因子，如IL-1、TNF-a、NO等，從而間接增強巨噬細胞的功能，并能抵消皮質類固醇激素對其它炎癥細胞因子產生的免疫抑制作用，在機體的全身和局部炎癥及免疫反應中起著重要的作用[1]。而炎癥反應在動脈粥樣硬化從起始發(fā)病到出現臨床事件都發(fā)揮重要作用的認識已獲得廣泛認同，研究表明：血管發(fā)生動脈粥樣硬化部位的MIF表達水平明顯上調，且隨著斑塊的發(fā)展逐漸上升；相反，阻斷MIF的表達則可以顯著延緩動脈粥樣硬化的發(fā)展并穩(wěn)定斑塊。盡管發(fā)現MIF在多種炎性疾病和動脈粥樣硬化患者組織和血液中表達變化，但對于其基因多態(tài)性與健康人及患者中MIF表達的關系認識卻很少。本文就MIF -173G/CSNPS與動脈粥樣硬化性腦梗死的關系展開研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集腦梗死患者298例，平均年齡(64.48±11.48)歲，經臨床及 CT和(或)磁共振成像(MRI)確診(依照第四屆全國腦血管病學術會議診斷標準)，排除心律失常、動脈炎、外傷、血液病、藥物、腫瘤、腦血管畸形或動脈瘤等引起的腦出血；排除肝、腎疾病、自身免疫性疾病、妊娠者、半年內曾有降脂治療者。對照組為健康體檢者共203例，平均年齡(61.27±7.80)歲，無血緣關系。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物 MIF -173G/C的PCR引物參照文獻[2]，序列為PCR1：上游引物：5’-ACT-AAG-AAA-GAC-CCGAGGC-3；下游引物：5’-GGG-GCA-CGTTGG-TGT-TTA-C-3’；上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2.2 DNA的制備及PCR擴增，基因型分析 (1)基因組 DNA的制備：采外周靜脈血 2～3 ml用明膠沉淀紅細胞，提取白細胞后用酚/氯仿抽提基因組DNA。(2)目的基因的 PCR擴增：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min。最后置于4 ℃終止反應。(3)PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，凝膠電泳成像分析系統(tǒng)內觀察(4)酶切產物識別：MIF-173G/C多態(tài)性由內切酶Alu I識別，37 ℃消化10 h。然后均用瓊脂糖凝膠(含溴化乙啶)電泳分離，紫外燈下照相后閱讀。

1.3 統(tǒng)計學分析 全部資料均用SPSS 13.0 for windows軟件包進行數據處理。

研究對象與Hardy-Weinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因的組間比較采用χ2檢驗，并以比值比(OR)和95%可信區(qū)間(CI)表示相對風險度。計量資料指標均進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者組間比較用t檢驗，3組及3組以上比較用方差分析；不符合正態(tài)分布數據采用非參數檢驗。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，以P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦梗死組與對照組的臨床數據比較 將腦梗死組患者與對照組進行一般數據的比較，兩組在年齡、性別、吸煙史、飲酒史方面均無顯著性差異(P>0.05)(見表1)。

表1 腦梗死組與對照組的一般數據比較

注：*代表與對照組相比P<0.05

2.2 MIF-173G/C 多態(tài)位點PCR產物酶切圖譜分析 MIF-173G/C多態(tài)位點可被限制性內切酶Alu I識別。酶切后產生三種基因型：純合子 GG、CC，雜合子 GC(見圖1、圖2)。

2.3 MIF-173G/C基因多態(tài)分布 CI組和對照組都有GG、GC、CC三種基因型，在研究總人群中(CI組+對照組)中的頻率分別為：62.28%，32.73%，4.99%；等位基因G、C的頻率分別為78.64、21.36。按Hardy-Weinberg平衡定律對研究人群進行了平衡檢驗(P>0.05)，證明我們選擇的總研究人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。

因CC基因型與GC基因型數量較少，將之合并為C等位基因攜帶者組，組間比較結果顯示：MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)。兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)(見表2)。

M：100 bp Maker，1-5泳道是PCR擴增產物

1、2雜合子GC型；3純合子CC型；4、5、6、7純合子GG型

3 討 論

巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是巨噬細胞自分泌的一種重要的前炎癥因子。巨噬細胞不僅是產生MIF的主要細胞，也是MIF作用的靶細胞。MIF可能廣泛參與了機體多種生理及病理生理學反應，包括炎癥反應、免疫調節(jié)、脂肪發(fā)生、腎臟病變、腫瘤生成和皮膚創(chuàng)傷修復等。國內李敬[3]、劉運涌[4]發(fā)現MIF水平與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性有關，李歸宿[5]發(fā)現腦梗死患者MIF水平減低，且MIF水平高低與 動脈粥樣硬化患者病情輕重、梗死灶體積大小密切相關。另有作者[6～8]發(fā)現在阿爾茨海默病、血管性癡呆、腔隙性腦梗死患者基線期、隨訪期患者中MIF水平均高于正常對照，認為其可以作為老年癡呆早期診斷和認知損傷程度判斷的敏感指標。

表2 CI組與對照組MIF-173G/C基因型頻率和等位基因頻率比較

注：CI=腦梗死組，括號內表示各亞組例數在總人數中的比例。與對照組相比，P>0.05

多種研究證實MIF基因-173G/C多態(tài)性與阻塞性呼吸睡眠暫停[9]、膀胱癌[10]、風濕性關節(jié)炎[11]等多種疾病相關。本研究發(fā)現MIF基因-173G/C基因型頻率分布在兩組間無顯著性差異(χ2=1.795，P=0.180)，兩種等位基因頻率兩組相比亦無顯著性差異(χ2=0.362，P=0.548)。下一步我們將對MIF-173G/C多態(tài)性與血糖、血脂代謝展開深入研究。目前對MIF-173G/C多態(tài)性研究結果不盡一致。Tereshchenko等[12]對捷克和俄羅斯的 459位心肌梗死患者，311位健康對照組進行了基因分型，發(fā)現該位點在病例組和對照組分布沒有顯著差別，但女性心肌梗死患者的GG基因型明顯高于女性對照組，與冠心病存在相關性(P=0.027)。Herde[13]一項對德國人長達18 y的病例對照研究發(fā)現MIF-173G/C多態(tài)性和血清MIF 蛋白水平及2型糖尿病的發(fā)生無顯著相關性。我們認為不同研究結果的差異可能與試驗人群的差異包括飲食、環(huán)境和方法學的因素有關，當然與抽樣誤差、樣本量大小等也有關聯。

本研究首次報道MIF-173G/C基因多態(tài)性分布及其與腦梗死的關系，通過研究我們未見MIF-173G/C基因多態(tài)性與腦梗死有關，G/C等位基因不是腦梗死發(fā)病的獨立危險因素。

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Relationship between MIF-173G/C single nucleotide polymorphism and atherosclerotic cerebral infarction.

YUANNing，XUHongwei，LIUXuejun.

(XiangyaHospital，CentralSouthUniversity，Changsha410008，China)

Objective To study the relationship between MIF -173G/C single nucleotide polymorphism(SNPS) and atherosclerotic cerebral infarction(CI). Methods The genotypes for the tested MIF SNPs were detected by polymerase chain reaction-restrictive fragment length polymorphism(PCR-RFLP)and DNA sequence. Results There existed -173G/C polymorphism of MIF in CI patients and controls，however，no significant differences were observed in genotypes and allele frequencies between CI patients and controls for MIF-173G/C polymorphism(P>0.05). Conclusion MIF-173G/C polymorphism has no significant correlation with CI patients and allele G/C isn’t an independent risk factor for CI.

Cerebral infarction； Macrophage migration inhibitory factor； Gene； Polymorphism

2016-11-20；

2017-02-13

(1.中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008；2.湖南省腦科醫(yī)院，湖南 長沙 410007)

劉學軍，E-mail：707151907@qq.com

1003-2754(2017)03-0247-03

R743

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