劉 偉， 李 晟， 肖建新

PRKAA2基因多態(tài)性與恩必普對腦梗死患者療效的關(guān)系

劉 偉， 李 晟， 肖建新

目的 研究PRKAA2基因多態(tài)性與恩必普對腦梗死患者療效的關(guān)系。 方法 選取235例腦梗死患者為研究對象，全部服用恩必普膠囊30 d后予NIHSS評分觀察恢復(fù)情況。應(yīng)用直接基因測序方法，研究AMPKa2基因7個單倍型標記單核苷酸多態(tài)性(tag-SNPs)與腦梗死患者療效的關(guān)系。結(jié)果 (1)SNP rs1124900基因型分布頻率有顯著差異，失效組GG基因型患者分布頻率較高，但等位基因頻率比較無顯著差異，且顯效組GG基因型檢出率較低。rs17848595位點基因型分布頻率有顯著差異，失效組AA基因型分布頻率較顯效組高，但等位基因頻率比較無顯著差異。rs1418442基因型及等位基因分布頻率有顯著差異，顯效組C等位基因頻率顯著高于失效組，該位點多態(tài)性與恩必普治療的LAA患者預(yù)后有相關(guān)獲益趨勢。結(jié)論 AMPK 的活化可能是腦缺血缺氧后康復(fù)的重要因素。

PRKAA2基因； 基因多態(tài)性； 恩必普； 腦梗死

腦梗死是目前導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，缺血性腦梗死的發(fā)生是由于各種原因引起的腦部血液供應(yīng)障礙，使局部腦組織發(fā)生不可逆損害，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧性壞死。能量的耗竭是局灶性缺血再灌注引起的腦組織最初和最直接的損傷變化。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)作為全身能量平衡的調(diào)節(jié)因素，腦代謝與AMPK高度相關(guān)，AMPK的催化亞基AMPKα2功能缺陷或水平降低可以直接影響AMPK的作用。AMPKα2基因PRKAA2位于lp36-32，全長63102bp，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成，因此推測PRKAA2基因多態(tài)性與腦卒中的發(fā)生發(fā)展以及后續(xù)的神經(jīng)恢復(fù)相關(guān)。dl-3-正丁基苯酞(恩必普軟膠囊，Butylphthalide或Dinbente)是人工合成的消旋體，研究證明，其具有縮小局灶性腦缺血后的梗死灶，保護線粒體功能，改善全腦缺血后腦的能量代謝，減輕神經(jīng)功能損傷的程度等作用，推測其保護腦線粒體功能與AMPK活性可能具有相關(guān)性，但迄今國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本研究旨在觀察我國腦梗死患者PRKAA2基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是否與恩必普療效相關(guān)，以早期篩查患者中PRKAA2的高危人群，并有可能針對這些高危人群采取積極的、甚至個性化的初級預(yù)防措施。

1 資料與方法

1.1 一般資料

腦梗死組所選對象均來自本院2012年1月～2015年12月門診或住院患者共235例，男125例，女110例，年齡40～89歲，平均(61.42±13.04)歲，為浙江地區(qū)漢族人，符合1995年全國第四次腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的腦梗死標準，并經(jīng)頭部CT和(或)磁共振成像(MRI)確診，根據(jù)TOAST病因分型，選取LAA型腦梗死病例。

入組標準：全部患者發(fā)病年齡為40～75歲，發(fā)病時間在72 h以內(nèi)發(fā)作的腦梗死，均經(jīng)頭部CT和(或)MRI證實，并行經(jīng)顱多普勒(TCD)或頭部彩超、頭部MRA或CT血管造影(CTA)或DSA、心臟超聲等檢查明確腦血管和心臟病變情況。排除心源性栓塞，其他病因或不明原因型卒中，嚴重心臟疾病近期發(fā)生心肌梗死或心絞痛疾病，嚴重感染，嚴重肝、腎功能不全，血栓性疾病，腫瘤，長期服用華法林及其他抗凝劑、非甾體類抗炎藥物，凝血功能異常，有出血傾向，近期有外傷或手術(shù)史，血小板計數(shù)<100×109/L，調(diào)查不配合者，臨床資料不全患者?所有研究對象均為無血緣關(guān)系的散發(fā)人群，本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均充分了解研究方案并簽署知情同意書。

1.2 方 法

1.2.1 藥品及給藥方法

(1)試驗藥為d1-3-正丁基苯酞軟膠囊(石家莊制藥集團有限公司生產(chǎn)，批號：41261204)，每次口服200 mg(2粒)，3次/d，1個療程為30 d。(2)基礎(chǔ)用藥為依達拉奉注射液(國藥集團生產(chǎn)，批號：1411133)30 mg加于0.9%氯化鈉注射液100 ml內(nèi)，靜脈滴注，2次/d，共14 d。試驗方法由研究者記錄受試者試驗前基本資料和病史，對受試者進行體格檢查、既往病史評分、伴發(fā)病評分及用藥前神經(jīng)功能缺失評分和生活能力狀態(tài)分級。同時進行CT、心電圖、胸部X線片、血液常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)和血液生化學(xué)檢查。在治療后第14 d和第30 d對受試者進行隨訪，進行神經(jīng)功能缺失評分和生活能力狀態(tài)分級評分，跟蹤療效判定，分顯效組與失效組。療效判定按照1995年全國第四屆腦血管病變學(xué)術(shù)會議通過的《腦卒中患者神經(jīng)功能缺損程度評分標準》(NIHSS)進行評分和判定。(1)基本痊愈：NIHSS評分減少91%～100%；(2)顯著進步：NIHSS評分減少46%～90%；(3)進步：NIHSS 評分減少18%～45%；(4)無變化：NIHSS 評分減少0～17%；(5)惡化：NIHSS 評分較治療前增加。

1.2.2 基因檢測

1.2.2.1 標本采集 獲取患者知情同意。于入院次日清晨空腹留取5 ml靜脈血提取DNA。

1.2.2.2 SNPs分析 AMPKα2基因SNP的選擇基因多態(tài)性的檢測，從HapMap 數(shù)據(jù)庫漢族人群群體中選擇SNPs(http：//hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/；public datarelease 24/phase Ⅱ；Ⅱ)，基于Tagger 程序選擇標簽SNPs，定義參數(shù)為r2≥0.80和少見等位基因頻率(MAF)≥5%。最終選取代表性的SNPs位點共7個(rs1124900、rs2796516、rs2746342、rs2051040、rs2796498、rs17848595、rs1418442)。采用直接測序方法(見表1)，讀取個體的基因型，基因型檢測失敗則標記為00，實驗中rs1124900脫落5例，rs2796516脫落6例，rs2051040脫落11例，rs2796498脫落11例，rs1418442脫落5例，所有基因檢測脫落率均小于5%，不影響統(tǒng)計結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

基因型行哈迪溫伯格(Hard-Weinberg)平衡檢驗。SPSS17.0軟件計算兩組等位基因頻率和基因型頻率；確切概率法(fisher exact test，F(xiàn)ET)或Pearson’s卡方檢驗兩組間等位基因頻率和基因型頻率分布差異。block根據(jù)D’>0.9 以及r2>0.8進行定義。單倍型構(gòu)建應(yīng)用Haploview 4.0軟件進行構(gòu)建。頻率<3%單倍型被排除不再進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。Pearson’s 卡方檢驗兩組間單倍型頻率及群體間差異分布。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

總?cè)虢M患者共235例，痊愈43例，顯效102例，有效72例，無效18例，總有效率61.70%，入院前NIHSS評分(13.98±3.75)，治療11 d NIHSS評分(10.38±3.43)，治療21 d NIHSS評分(8.16±2.74)，自身比較11 d較入院前NIHSS評分明顯下降(t=11.805，P<0.01)；21 d較入院前NIHSS評分明顯下降(t=17.98，P<0.01)。

2.2 基因型分析

PRKAA2基因7個多態(tài)性位點的基因型分布均符合Hard-Weinberg 平衡定律。兩組基因型及等位基因頻率分布及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表2。兩組rs1124900基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)失效組GG基因型分布頻率較顯效組高，rs17848595位點基因型分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。失效組AA基因型分布頻率較顯效組高，rs1418442基因型及等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，失效組C等位基因頻率顯著低于顯效組(P=0.027，OR=0.481，95%CI=0.249～0.929)。

2.3 連鎖不平衡分析

失效組連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)單倍型(rs2796516- rs2746342- rs2051040-rs2796498)高度連鎖(D’>0.9)(見表3、表4、圖1、圖2)。

2.4 單倍體分析

兩組單倍型頻率分布及統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表5。排除單倍型頻率<0.03，連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)有rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498-rs17848595-rs1418442構(gòu)建的G-A-T- C-A- A-T 單倍型頻率顯著高于顯效組(χ2=9.642，P=0.002，OR=2.922，95%CI=1.450～5.889)。失效組未發(fā)現(xiàn)T-G-G-C-G-G-T單倍型。

表1 AMPKα2基因tag-SNPs位點分型所用引物及測序引物

表2 PRKAA2基因功能區(qū)7個SNPs位點基因型及等位基因頻率分布

表3 顯效組Linkage Disequilibrium分析

表4 失效組Linkage Disequilibrium 分析

表5 單倍體分析

3 討 論

本研究腦梗死患者AMPKα2基因分布發(fā)現(xiàn)，rs1124900基因型分布頻率有顯著差異，失效組GG基因型患者分布頻率較高，但等位基因頻率比較無顯著差異，且顯效組GG基因型檢出率較低，rs17848595位點基因型分布頻率有顯著差異。失效組AA基因型分布頻率較顯效組高，但等位基因頻率比較無顯著差異，rs1418442基因型及等位基因分布頻率有顯著差異，顯效組C等位基因頻率顯著高于失效組，該位點多態(tài)性與dl-3-正丁基苯酞治療的LAA患者預(yù)后有相關(guān)獲益趨勢。C等位基因攜帶者LAA患者預(yù)后較好(P=0.027，OR=0.481，95%CI=0.249～0.929)。深入研究該功能區(qū)7個多態(tài)性之間的相互關(guān)系。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)單倍型rs2796516- rs2746342- rs2051040 -rs2796498構(gòu)建的單倍型存在強連鎖不平衡。單倍型分析顯示，失效組rs1124900-rs2796516-rs2746342-rs2051040-rs2796498- rs17848595 -rs1418442 構(gòu)建的G-A-T-C-A-A-T單倍型頻率顯著高于顯效組，且失效組未發(fā)現(xiàn)T-G-G-C-G-G-T單倍型。α2 亞基由 PRKAA2 基因編碼，位于1p36-32上，曾報道過這與T2DM 有關(guān)[1]。迄今未發(fā)現(xiàn)有關(guān)AMPKα2基因多態(tài)性與腦梗死預(yù)后的相關(guān)報道。但有研究報道，在高加索女性人群中AMPKα2基因rsl418442與血脂水平顯著相關(guān)[2]。位于基因內(nèi)含子的基因多態(tài)性是如何影響AMPK活化的機制目前還不十分清楚。

AMPK是一個由α，β，γ三個亞基構(gòu)成的異三聚體蛋白。α亞基由αl，α2兩個亞單位組成，分子量為63 kD，起催化作用；α亞單位的N末端是起催化作用的核心部位，含有一個典型的絲、蘇氨酸蛋白激酶的催化區(qū)域，C末端則主要負責活性的調(diào)節(jié)以及聯(lián)系β和γ亞單位。α主要分布在腎臟、肝臟、肺、心臟、腦和胰島β細胞，β在肝臟、骨骼肌中高度表達。目前關(guān)于AMPK上下游作用機制的認識還很有限。目前發(fā)現(xiàn)的有LKBl(liver kinase B1)，鈣調(diào)素依賴蛋白激酶激酶(CaM-kinase kinase CaMKK)以及轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)激活激酶(TGF-β-activated kinase 1，TAK1)。CaMKK主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)，其對Thrl72的磷酸化不依賴于AMP濃度的升高，而是通過增高Ca2+濃度從而激活A(yù)MPK。

AMPK的激活很可能是通過開啟ATP產(chǎn)生通路，增加葡萄糖和脂肪酸的代謝率來維持ATP水平，從而減輕細胞損傷，保護線粒體功能，其具體機制可能為：(1)增加葡萄糖轉(zhuǎn)運體-4(glucose transporter type 4，GLUT4)轉(zhuǎn)運至細胞膜，從而增加葡萄糖的攝取和酵解。AMPK與TAK1蛋白的相互作用而引起的p38分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)的自動磷酸化和活化；(2)通過PKC使細胞GLUT4 mRNA表達增加，加速葡萄糖的攝取和利用；(3)抑制ACC的活性，降低丙二酰輔酶A的水平，減弱對CPT-1抑制，增加脂肪酸氧化及產(chǎn)熱供能。

在腦梗死缺血保護及線粒體活化過程中，AMPK的活化是腦梗死后的一個適應(yīng)性反應(yīng)，它能夠提供大腦缺血后所需要的ATP，從而在缺氧時保護大腦組織使其免受損害。首先，AMPK對神經(jīng)元的存活也可能有重要作用[3]。Kuramoto 等[4]發(fā)現(xiàn)大腦中動脈缺血90 min再灌注2 h后，激活了的AMPK通過提高γ氨基丁酸B型受體2的功能減少缺氧引起的興奮性毒性，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)，提高低能量(如葡萄糖耗竭、谷氨酸的興奮性毒性)或海馬區(qū)神經(jīng)元細胞應(yīng)激性增加情況下細胞的存活[5]。其次，新近研究[6]表明 AMPK 的活化可能是腦缺血缺氧后康復(fù)的重要因素。eNOS 是通過激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達促使腦卒中神經(jīng)再生的重要酶類，由于AMPK是 eNOS 的直接催化劑，因而 AMPK 也可能對腦卒中后的神經(jīng)元再生和修復(fù)有作用。AMPK的激活介導(dǎo)了KA誘導(dǎo)的BDNF表達和NF-КB 的轉(zhuǎn)錄激活，這兩者都可能參與了腦卒中后血管的再生與修復(fù)[7]。第三，AMPK對腦血管作用[8]：AMPK的活化提升了VEGF水平并且隨之增加了內(nèi)皮細胞的增殖和代謝。說明 AMPK 可能介導(dǎo)了腦卒中后的修復(fù)。

恩必普(dl-3-正丁基苯酞)為多靶點抗腦缺血藥物[9]，能改善線粒體功能，提高腦血管內(nèi)皮NO和PG12的水平，抑制谷氨酸釋放；改善局部腦微循環(huán)及腦缺血能量代謝耗竭。推測在腦梗死發(fā)生后恢復(fù)階段，dl-3-正丁基苯酞能夠通過增加eNOS的表達和磷酸化來增加AMPK的表達與活化。本研究中，腦梗死患者口服dl-3-正丁基苯酞時間多在6～72 h，口服吸收較慢，此時屬于遲發(fā)性神經(jīng)元損傷階段，腦梗死后恢復(fù)期AMPK的激活可以提高神經(jīng)再生、血管再生并改善腦的功能，并能夠以依賴于NO的方式來促使腦卒中神經(jīng)再生。

本研究推測，AMPK可能是dl-3-正丁基苯酞治療腦梗死的潛在藥理學(xué)靶點之一，PRKAA2 基因rs1124900，rs17848595及rs1418442三個位點SNP對dl-3-正丁基苯酞改善腦梗死患者預(yù)后具有一定的影響趨勢。本研究的結(jié)果只能說明rs1124900，rs17848595及rs1418442三個位點位點的 SNP 與dl-3-正丁基苯酞用藥個體差異有關(guān)，與其它多態(tài)性位點構(gòu)建單倍型是否與dl-3-正丁基苯酞用藥個體差異相關(guān)還有待進一步篩查，以便為腦卒中治療學(xué)和藥物基因組學(xué)研究提供更多的線索。

本研究也存在一定的局限性。首先，盡管研究對象入選標準嚴格，收集困難較大，但本研究的樣本量相對還是偏??；其次，本研究缺少對AMPK上下游激活因子的測定，如CaMKKβ，瘦素(1eptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)等，以進一步證實AMPK與腦梗死預(yù)后分子機制的相關(guān)性，故還需要擴大研究人群甚至對其他亞洲人群進行研究，以及進行前瞻性隨訪研究來進一步驗證。綜上所述，我國腦梗死患者AMPKα2基因SNP與dl-3-正丁基苯酞療效存在一定相關(guān)性。這對于腦梗死患者進行早期干預(yù)、制訂個體化的預(yù)防措施、判斷預(yù)后可能具有重要的臨床意義。

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Relationship of PRKAA2 gene polymorphism and butylphthalide with patioentns of cerebral infarction

LIUWei，LISheng，XIAOJianxin.

(118HospitalofPLA，Wenzhou325000，China)

Objective To investigate the relationship of PRKAA2 gene polymorphism and butylphthalide with pations patients of cerebral infarction. Methods Select 235 cases of cerebral infarction patients for the study，all taking butylphtha- lide capsule for 30 days to observe the NIHSS recovery. Application of direct gene sequencing，gene research AMPKa2 seven haplotype tag single nucleotide polymorphisms(tag-SNPs)and cerebral infarction patient outcomes. Results (1)SNP rs1124900 genotype frequencies were significantly different，the genotype distribution frequency in failure group GG genotype distribution frequency is was high，but there was no significant difference in allele frequencies and the detection rate in genotype GG group was markedly lower. detection rate. rs17848595 locus genotype frequencies were significantly different. The genotype frequencies in failure group AA was genotype frequencies markedly higher than the group，but there was no significant difference in allele frequencies. rs1418442 genotype and allele frequencies were significantly different，effective in group C allele frequency was significantly higher than the failure group，the polymorphism and LAA patient is was butylphthalide prognosis related eligible Yi trend. Conclusion AMPK activation after cerebral ischemia and hypoxia may be an important factor in rehabilitation.

PRKAA2 gene； Polymorphism； Butylphthalide； Cerebral infarction

圖1 顯效組Linkage Disequilibrium分析

圖2 失效組Linkage Disequilibrium分析

2017-01-15；

2017-03-13

南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題(No. 12MA024)

(解放軍第118醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

劉 偉，E-mail：siverl96356@163.com

1003-2754(2017)03-0196-04

R743

A