王文軍 曾凱芳,2 鄧麗莉,2 姚世響,2

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

抗菌肽及其在果蔬病害控制中的應(yīng)用

王文軍1曾凱芳1,2鄧麗莉1,2姚世響1,2

(1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715)

抗菌肽廣泛存在于生物體內(nèi)，是由基因編碼、核糖體合成的具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等多種生物學(xué)功能多肽，是生物體非特異性免疫功能的重要組成部分。隨著人們對(duì)抗菌肽研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有望成為抗生素、殺菌劑等的優(yōu)良替代品。文章介紹了抗菌肽的來(lái)源分類、作用機(jī)制及其在果蔬病害控制中的應(yīng)用，并展望了當(dāng)前抗菌肽研究應(yīng)用存在的問題。

抗菌肽；作用機(jī)制；果蔬；病害控制

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是由基因編碼、核糖體合成的多肽，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物體內(nèi)，是生物體非特異性免疫功能的重要組成部分，具有抗細(xì)菌、真菌、病毒等多種生物學(xué)功能，通常有以下幾種共同的特征：小肽，分子量大約4 000道爾頓，強(qiáng)陽(yáng)離子(pI 8.9～10.7)，熱穩(wěn)定(100 ℃，15 min)，無(wú)抗藥性，對(duì)真核細(xì)胞無(wú)影響。果蔬在人們?nèi)粘Ｉ钪姓紦?jù)重要地位，但由于病原菌導(dǎo)致果蔬品質(zhì)下降和腐爛，嚴(yán)重影響果蔬品質(zhì)和商品價(jià)值。傳統(tǒng)抗生素、化學(xué)殺菌劑的大量使用不僅存在安全問題，使病原菌產(chǎn)生耐藥性，且易造成環(huán)境污染[1]。近年來(lái)，抗菌肽的應(yīng)用研究得到越來(lái)越多的關(guān)注，人們期待能找到可替代抗生素和化學(xué)殺菌劑的新型藥物或防治方法。本研究擬就抗菌肽來(lái)源、分類、作用機(jī)理、在果蔬病害控制的應(yīng)用以及存在問題進(jìn)行綜述。

1 抗菌肽的來(lái)源

目前為止已經(jīng)報(bào)道了超過2 700多種不同來(lái)源的AMPs，種類繁多，分類尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[2]。根據(jù)抗菌肽的來(lái)源可分為昆蟲抗菌肽、動(dòng)物抗菌肽(兩棲類抗菌肽、水生動(dòng)物類抗菌肽、哺乳動(dòng)物類抗菌肽)、微生物抗菌肽、化學(xué)合成抗菌肽、基因工程來(lái)源抗菌肽[3]。

1.1 昆蟲抗菌肽

自1980年Hultmark等[4]從誘導(dǎo)的惜古比天蠶(Hyalophoracecropia)蛹淋巴液中分離到第一種抗菌肽——天蠶素(cecropins)后，眾多的抗菌肽相繼被發(fā)現(xiàn)報(bào)道。目前，昆蟲抗菌肽的數(shù)量及研究應(yīng)用相對(duì)較多[5]。根據(jù)氨基酸序列和抗菌活性的不同，一般分為：天蠶素、防御素、富含脯氨酸的抗菌肽、富含甘氨酸的抗菌肽和溶菌酶[6]。

1.1.1 天蠶素 天蠶素廣泛存在于動(dòng)物界，其最早在惜古比天蠶(H.cecropia)中被發(fā)現(xiàn)[7]。天蠶素分子質(zhì)量小，一般不含半胱氨酸(Cys)，分子內(nèi)無(wú)二硫鍵，N端強(qiáng)堿性，C端有很強(qiáng)的疏水性，C端酰胺化，呈α-螺旋結(jié)構(gòu)，能夠攻擊細(xì)菌的細(xì)胞膜，主要作用于革蘭氏陰性菌[8]。目前，天蠶素是在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物、抗菌肽重組表達(dá)及分子設(shè)計(jì)與改良、肽抗生素藥物開發(fā)研究中使用頻率最多的抗菌肽。

1.1.2 防御素 防御素作為天然免疫的效應(yīng)分子，可對(duì)傳染病原體進(jìn)行有效的防御。防御素是獨(dú)特的富含半胱氨酸的陽(yáng)離子抗菌肽，呈β-折疊結(jié)構(gòu)，一般有3或4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。昆蟲防御素主要作用于革蘭氏陰性菌，對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌、絲狀真菌、酵母和原生動(dòng)物也有抑制作用[9-10]。

1.1.3 富含脯氨酸的抗菌肽 先從昆蟲、而后在哺乳動(dòng)物中分離得到富含脯氨酸的抗菌肽，主要對(duì)革蘭氏陰性菌有抑制作用，包括植物病害相關(guān)的細(xì)菌和一些人類病原體。富含脯氨酸的抗菌肽可以滲透到敏感的細(xì)胞內(nèi)，然后作用于胞內(nèi)物質(zhì)[11]，其殺菌作用方式不涉及細(xì)菌膜的溶解。

1.1.4 富含甘氨酸的抗菌肽 目前，可從不同的昆蟲中分離鑒定到多種富含甘氨酸殘基(14%～22%)的抗菌肽。其可通過破壞細(xì)胞膜從而殺死真菌、革蘭氏陰性細(xì)菌以及一些癌細(xì)胞。蜂毒素是主要的富含甘氨酸殘基的抗菌肽[12]12，可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)[13]，對(duì)指狀青霉的生長(zhǎng)也有明顯抑制效果[14]。

1.2 動(dòng)物抗菌肽

隨著研究的深入，哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、魚類體內(nèi)都相繼發(fā)現(xiàn)各種抗菌肽。這些肽一般都有不同的序列與結(jié)構(gòu)，并且有特異性目標(biāo)。在脊椎動(dòng)物的皮膚上皮層的分泌物[15]、腸道[16]、唾液[17]中都存在多種活性肽。

1.3 微生物抗菌肽

微生物來(lái)源的抗菌肽主要由細(xì)菌產(chǎn)生。乳鏈菌肽Nisin是其中研究最為清楚的抗菌肽，它由乳酸鏈球菌(Streptococcuslactis) 和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis) 合成、分泌，目前已實(shí)現(xiàn)Nisin的產(chǎn)業(yè)化，在世界各國(guó)作為一種天然防腐劑用于食品防腐保鮮。另外，放線菌作為一種生產(chǎn)抗生素的主要藥源微生物，其能產(chǎn)生如萬(wàn)古霉素等多肽類抗生素[18]。有關(guān)酵母菌和霉菌產(chǎn)生抗菌肽的報(bào)道較少，一些由真菌產(chǎn)生的抗菌肽，主要由木霉屬產(chǎn)生，有研究人員[19]從哈茨木霉中分離得到了peptaibol類抗菌肽。

1.4 化學(xué)合成抗菌肽和基因工程菌抗菌肽

生物體內(nèi)抗菌肽含量很低，提取分離工藝繁瑣復(fù)雜，故抗菌肽的生產(chǎn)一般借助體外化學(xué)合成和轉(zhuǎn)基因工程菌生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法主要為多肽固相合成法，可合成人工設(shè)計(jì)的活性肽，產(chǎn)物易被分離，但其較高的成本是限制其商業(yè)化應(yīng)用的主要原因，故目前主要在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，如PAF26[20]、Cecropins A和B[21]等。

目前，利用重組方法異源表達(dá)抗菌肽是非常經(jīng)濟(jì)和具有研究?jī)r(jià)值的[22]。大腸桿菌因其良好的表達(dá)系統(tǒng)和高效快速的增長(zhǎng)率作為最普遍有效的重組生物反應(yīng)器，但對(duì)其有毒害作用的肽類的表達(dá)生產(chǎn)是很困難的。同時(shí)，人們已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，是不同于蛋白質(zhì)、肽類大量生產(chǎn)的優(yōu)良系統(tǒng)[23]。國(guó)內(nèi)外已有大量抗菌肽成功經(jīng)畢赤酵母重組表達(dá)，并應(yīng)用在研究中，如：CM4[24-25]、Cecropins A[26]、CecropinsD[27]等。

2 抗菌肽作用機(jī)制

最初，影響細(xì)胞膜的通透性被認(rèn)為是抗菌肽的主要作用機(jī)制，但隨后發(fā)現(xiàn)抗菌肽還可以在進(jìn)入細(xì)胞，通過與細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的特異性結(jié)合干擾細(xì)胞代謝，達(dá)到抑制和殺滅細(xì)菌的目的。目前還沒用普遍適用的抗菌肽作用機(jī)理的假設(shè)模式，但抗菌肽的活性普遍依賴于與靶細(xì)胞細(xì)胞膜的相互作用[28]。

先前的研究已經(jīng)確定非洲豬瘟病毒不同分離株的最小或中立感染劑量在102和105之間，具體數(shù)量取決于毒株毒力、暴露頻率和入侵方式。目前還沒有中國(guó)流行的非洲豬瘟Georgia分離株在飼料中的感染劑量的報(bào)道。飼料或原科中經(jīng)典豬瘟病毒感染劑量的報(bào)道數(shù)據(jù)也很少。

2.1 抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用

抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用的研究較多，其是決定抗菌肽活性的關(guān)鍵因素[29]。圖1所示為已經(jīng)提出的幾種常用的作用模型：聚合體模型(Aggregate channel model)，環(huán)孔模型(Toroidal pore model)，桶板模型(Barrel-stave model)和地毯模型(Carpet model)[30]。

A. 聚合體模型 B. 環(huán)孔模型 C. 桶板模型 D. 地毯模型

圖1 抗菌肽與細(xì)胞膜的相互作用[25]

Figure 1 The interaction of antimicrobial peptides and cell membrane

2.1.1 聚合體模型(Aggregate channel model) 由圖1A可知，聚合體模型中，抗菌肽與細(xì)胞膜上的磷脂分子可形成聚合體，聚合體中的抗菌肽沒有特定形態(tài)，此聚合體提供了通過該膜的離子泄漏通道，如澳大利亞樹蛙的抗菌肽Maculatin1.1(M1.1)[31]的殺菌機(jī)制為此模型。

2.1.2 環(huán)孔模型(Toroidal pore model) 由圖1B可知，環(huán)孔模型指出，細(xì)胞膜上不斷聚集的肽可以垂直插入磷脂雙分子層，其疏水區(qū)的位移可以使細(xì)胞膜疏水中心形成裂口，誘導(dǎo)磷脂單分子層不斷向內(nèi)彎曲，形成一個(gè)環(huán)孔。最近的研究[32]證明肽促進(jìn)磷脂分子層的彎曲，脂質(zhì)同時(shí)可以調(diào)節(jié)肽的構(gòu)象，利于孔的形成。也有研究[33]提出了抗革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)菌素導(dǎo)致的環(huán)形孔可以使膜脂質(zhì)體和細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)發(fā)生泄漏。環(huán)孔模型不僅在線性肽中發(fā)現(xiàn)，環(huán)形肽也可在磷脂雙分子膜上打個(gè)直徑1～2 nm的孔[34-35]。

2.1.3 桶板模型(Barrel-stave model) 由圖1C可知，許多α-螺旋肽的作用方式是桶板模型，α-螺旋的兩親性肽聚集在細(xì)胞膜表面形成低聚物束，方向固定排列，以使其疏水端與膜脂質(zhì)端相互作用，干擾了細(xì)胞膜正常功能形成了跨膜離子通道，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)可相互滲透，也可激活水解酶導(dǎo)致細(xì)胞壁分解，例如抗菌肽Ctx-Ha[36]和Hf-1[37]。

2.1.4 地毯模型(Carpet model) 由圖1D可知，地毯模型中，抗菌肽平行排布于細(xì)胞膜表面，膜局部形成“地毯式”的肽覆蓋層，當(dāng)達(dá)到閾值濃度時(shí)，以類似洗滌劑方式作用，造成細(xì)胞膜局部缺失，形成孔洞，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[38]。諸多有雙親特性的陽(yáng)離子抗菌肽在高濃度下就是以此模型作用，它也是大多數(shù)抗菌肽殺死革蘭氏陰性菌和寄生蟲的共有模型，如抗菌肽Pln149a[39]。

2.2 抗菌肽作用于胞內(nèi)物質(zhì)

3 抗菌肽在果蔬病害控制上的應(yīng)用

3.1 抗菌肽在果蔬采前病害控制的應(yīng)用

抗菌肽應(yīng)用于果蔬采前病害控制的研究，主要依托于基因重組技術(shù)，將抗菌肽基因轉(zhuǎn)入植株，抗菌肽的成功表達(dá)將增強(qiáng)植物抗病性，以此培養(yǎng)出抗病性優(yōu)良的植株。在國(guó)內(nèi)外諸多研究中,抗菌肽轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。

鄒修平等[43]人工合成了兩個(gè)含有信號(hào)肽的Cecropin B抗菌肽基因PR1aCB和AATCB，進(jìn)一步構(gòu)建了CaMV35S調(diào)控PR1aCB和AATCB基因的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入血橙成功獲得轉(zhuǎn)基因植株，其抗病性顯著強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因植株。He等[44]將抗菌肽基因ShivaA和CecropinB成功導(dǎo)入甜橙得到轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)柑橘潰瘍病耐性提高。Osusky等分別將MsrA1[45](雜合肽，修飾N端的cecropin-melittin)、MsrA2[46](dermaseptin B1的類似物)、MsrA3[47](temporin A的N-末端修飾的類似物)，成功表達(dá)于馬鈴薯內(nèi)提高了馬鈴薯對(duì)晚疫病和粉紅腐爛等病害的抗性。此外，番茄成功表達(dá)外源基因MJ-AMP1[48]、pep11[49]可分別增強(qiáng)植株對(duì)早、晚疫病的抗性。Chakrabart等[50]研究表明，轉(zhuǎn)基因香蕉表達(dá)MSI-99可顯著提高對(duì)由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf.sp.Cubense)引起的枯萎病、褐條斑小球殼菌(Mycosphaerellamusicola)引起的葉斑病的抗性。

抗菌肽轉(zhuǎn)基因植株的培育不僅在果蔬中應(yīng)用，同時(shí)在棉花、水稻等經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物中也有應(yīng)用。Sharma等[51]將Cecropin B基因和水稻幾丁質(zhì)酶信號(hào)肽基因轉(zhuǎn)入水稻植株中，轉(zhuǎn)基因水稻植株抗白葉枯病能力顯著增強(qiáng)；Rahnamaeian等[52]研究表明，在轉(zhuǎn)基因的大麥中表達(dá)抗菌肽metchinkowin基因能提高大麥對(duì)白粉病的抗病性。

3.2 抗菌肽在果蔬采后病害控制的應(yīng)用

采后病原菌導(dǎo)致的果蔬質(zhì)量下降或完全腐爛將造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于殺菌劑的安全性和病原體耐藥性的逐漸形成，應(yīng)用化學(xué)殺菌劑控制果蔬采后病害越來(lái)越受到限制[53]?？咕拇姹ｕr劑的應(yīng)用將有很大發(fā)展前景。生物體直接提取抗菌肽、化學(xué)合成抗菌肽和利用基因重組技術(shù)改造微生物表達(dá)抗菌肽是目前抗菌肽在采后果蔬病害控制研究中的主要方式。

Liu等[54]發(fā)現(xiàn)牡蠣(Crassostreagigas)酶解液提取到的抗菌肽CgPep33可有效控制由灰霉菌(Botrytiscinerea)引起的草莓灰霉病。由意大利青霉(Peniciliumitalicum)和指狀青霉(Peniciliumdigitatum)引起的柑橘青、綠霉最為普遍，Muoz A等[55]對(duì)比了8種抗菌肽(PAF26、PAF38、PAF40、BM0、melittin、indolicidin、BP15和BP76)對(duì)柑橘綠霉病的控制效果，結(jié)果表明PAF26控病效果良好。López-Garci等[56]也對(duì)比了合成抗菌肽PAF19、PAF26和LfcinB4-9及化學(xué)保鮮劑對(duì)柑橘綠霉病的控制效果，結(jié)果也表明PAF26抑菌效果顯著。Badosa等[57]合成了幾種雜合肽cecropin A-melittin并應(yīng)用于蘋果青霉病防控，其中BP22效果最好。

相對(duì)于化學(xué)保鮮劑，生防酵母應(yīng)用于果蔬采后保鮮有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但是目前，由于生防效力較弱的原因，投入商業(yè)化使用的酵母生防保鮮劑還很少。其中，基因改造是提高酵母生防效力的眾多方法之一。Jones等[58]將cecropin A的部分基因?qū)氲结劸平湍?Saccharomycescerevisiae)中表達(dá)，重組酵母可有效抑制導(dǎo)致番茄腐爛的炭疽菌(Colletotrichumcoccodes)的生長(zhǎng)。Wisniewski等[59]將桃的防御基因rDFN1重組于畢赤酵母(Pichiapastoris)，顯著提高了酵母對(duì)蘋果主要病原菌擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)和灰霉(Botrytiscinerea)孢子生長(zhǎng)的抑制能力。任雪艷等[12]43-61[26]將抗菌肽基因Psd及Cecropin A基因重組于巴斯德畢赤酵母GS115，并用于幾種采后水果果實(shí)真菌病害(番茄灰霉病和黑斑病、蘋果與梨的青霉病及柑橘酸腐病)的生物防治?？堤K等[60]通過釀酒酵母培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得新疆家蠶抗菌肽(CecropinXJ)，將其添加到鮮榨的番茄汁和葡萄汁中可顯著延長(zhǎng)鮮榨番茄汁和葡萄汁保鮮期。部分抗菌肽的來(lái)源及氨基酸序列等信息見表1。

4 展望

目前，抗菌肽研究雖然取得了一定進(jìn)展，但要廣泛應(yīng)用于果蔬病害控制，仍然存在很多待解決的問題。首先，抗菌肽大規(guī)模應(yīng)用受阻于其制備方式：天然抗菌肽一般含量比較低，提取工藝復(fù)雜；化學(xué)合成抗菌肽成本很高，且難以保證合成物的活性與一致性；利用基因工程技術(shù)合成抗菌肽，表達(dá)效率較低，由于抗菌肽的殺菌性，原核表達(dá)系統(tǒng)一般不如真核表達(dá)系統(tǒng)，但提取純品時(shí)由于融合蛋白表達(dá)的緣故很難實(shí)施。其次，抗菌肽的活性、穩(wěn)定性依舊不如傳統(tǒng)抗生素、殺菌劑，仍需提高和改善；最后，抗菌肽應(yīng)用存在一定未知的安全性問題，抗菌肽藥劑和轉(zhuǎn)基因果蔬的安全性仍需繼續(xù)研究證實(shí)。

隨著對(duì)抗菌肽作用機(jī)理、生產(chǎn)及其轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷深入研究和應(yīng)用，廣譜、高效、安全的抗菌肽藥劑和優(yōu)良的抗病植株將會(huì)廣泛應(yīng)用于果蔬病害控制。同時(shí)，抗菌肽也將在農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)、畜牧業(yè)、制藥業(yè)發(fā)揮其重要作用。

表1 抗菌肽在果蔬病害控制中的應(yīng)用Table 1 Application of antimicrobial peptides in the control of fruit and vegetable diseases

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Antimicrobial peptides and its application in the control of fruit and vegetable diseases

WANG Wen-jun1ZENGKai-fang1,2DENGLi-li1,2YAOShi-xiang1,2

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.ChongqingSpecialFoodEngineeringandTechnologyResearchCenter,Chongqing400715,China)

Antimicrobial peptides are widely present in the organism, which are gene-encoded, ribosomal synthesized polypeptides. Antimicrobial peptides have anti bacteria, fungi, viruses and other biological functions. They are the important part of non-specific immune function of organism. With the development of the research on the antimicrobial peptides, they are expected to be excellent substitutes for antibiotics, fungicides. This review briefly introduces the classification, mechanism and application in the control of fruits and vegetables diseases of antimicrobial peptides, and prospects the problems existing in the research and widely application.

antimicrobial peptides; mechanism of action; fruit and vegetable; diseases control

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目課題(編號(hào)：2015BAD16B07)；重慶市科委柑桔主題專項(xiàng)課題(編號(hào)：cstc2016shms-ztzx80005)

王文軍，男，西南大學(xué)在讀碩士研究生。

曾凱芳(1972—)，女，西南大學(xué)教授，博士。 E-mail:zengkaifang@163.com

2016—12—26

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.042