張學(xué)英 黃忠意 章發(fā)盛 石 艷 黃 靜

(1. 湘西自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000；2. 湖南省食品監(jiān)督檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

兩種檢測(cè)還原糖方法的比較

張學(xué)英1黃忠意2章發(fā)盛1石 艷1黃 靜1

(1. 湘西自治州食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 吉首 416000；2. 湖南省食品監(jiān)督檢測(cè)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410000)

采用費(fèi)林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定湘西野生菊芋中還原糖(及總糖)含量，分析比較二者的測(cè)定結(jié)果及可操作性等。結(jié)果表明，費(fèi)林試劑滴定法平行樣檢測(cè)RSD值為2.00%，精密度為8%～13%；3,5-二硝基水楊酸比色法平行樣檢測(cè)RSD值為1.68%，精密度為2.5%～4.0%；費(fèi)林試劑滴定法易受終點(diǎn)計(jì)量等因素的干擾，特別是對(duì)于糖含量低的樣品檢測(cè)誤差較大，但較適用于自帶顏色產(chǎn)品的檢測(cè)；3,5-二硝基水楊酸比色法操作簡(jiǎn)單、快速、適宜批量處理，其顯色反應(yīng)體系在135 min內(nèi)同一標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)RSD值為0.55%，且顯色反應(yīng)體系相當(dāng)穩(wěn)定，客觀因素對(duì)其低濃度樣品影響較小，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度較高。

3,5-二硝基水楊酸比色法；費(fèi)林試劑滴定法；菊芋；還原糖

菊芋，又名洋姜，為菊科向日葵屬多年生宿根性草本植物，地下塊莖富含菊糖，因菊糖對(duì)人體內(nèi)糖含量有雙重調(diào)節(jié)作用，故菊糖是食品、保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域重要的加工原料。其地上莖稈既可作為造紙的原料，也可作為生物發(fā)電的燃料，同時(shí)由于其生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng)，近年在風(fēng)沙治理領(lǐng)域運(yùn)用廣泛[1-2]。菊芋在食品加工領(lǐng)域主要用于制作醬腌菜、蜜餞等食品，在食品精細(xì)加工及保健食品研究方面主要是對(duì)塊莖中菊糖、低聚果糖、高果糖漿等提純及應(yīng)用，新鮮菊芋的總糖含量高達(dá)20%～35%，其中鮮菊芋中菊糖含量也較高達(dá)15%～20%[2-3]。

食品中還原糖(及總糖)的含量測(cè)定，有旋光法、氣相色譜法、液相色譜法、分光光度計(jì)法和化學(xué)滴定法，一般現(xiàn)常見有高錳酸鉀滴定法(但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，需高錳酸鉀法糖類檢索表)、費(fèi)林試劑滴定法(含直接滴定法和返滴定法)、濃硫酸苯酚法(此法因使用有強(qiáng)腐蝕性的濃硫酸，且檢測(cè)過程中比色樣液量太少而不宜使用)和3,5-二硝基水楊酸比色法等方法。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有費(fèi)林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法。前人曾對(duì)滴定法、比色法兩種測(cè)糖法進(jìn)行過研究，如王歡等[4]固態(tài)發(fā)酵食醋中還原糖、總糖含量測(cè)定，董林青等[5]應(yīng)用不同方法測(cè)定發(fā)酵液中糖的含量，何紅梅等[6]在食品中還原糖含量測(cè)量的不確定度評(píng)估，邱曉紅等[7]在富含脂肪食品總糖含量的測(cè)定，研究了檢測(cè)方法、不確定度、前處理方法等。但對(duì)兩種檢測(cè)方法的對(duì)比研究較少，特別是檢測(cè)方法適用性研究較少，本試驗(yàn)擬通過對(duì)菊芋鮮品樣品進(jìn)行總糖和還原糖含量檢測(cè)方法研究，比較分析費(fèi)林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法在實(shí)際應(yīng)用中的利弊，并分析糖含量高低對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的影響及方法的適用性，旨在為食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)和食品企業(yè)指導(dǎo)生產(chǎn)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)用湘西野生菊芋和網(wǎng)購(gòu)菊芋(浙江金華縣)作為檢測(cè)對(duì)象。

1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

葡萄糖：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

五水硫酸銅：分析純，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；

酒石酸鉀鈉：分析純，湖南匯虹試劑有限公司；

3,5-二硝基水楊酸試劑：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 設(shè)備與儀器

紫外可見分光光度計(jì)：UV-2500型，島津儀器(蘇州)有限公司；

分析天平：BSA 224S型，長(zhǎng)沙康源科技開發(fā)有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.4 樣品檢測(cè)

1.4.1 樣品前處理

(1) 制樣：樣品洗凈、陰干、取可食部分，用均質(zhì)器均質(zhì)3 min，制成均勻樣品備用。

(2) 樣品中還原糖檢測(cè)：稱取均勻樣品5～6 g置于250 mL 三角瓶中，直接用50 mL水振蕩提取(必要時(shí)加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各5 mL，用于去除蛋白質(zhì)和脂肪)，然后用水定容至250 mL過濾即可。

(3) 樣品中總糖的檢測(cè)：稱取約樣品2 g置于250 mL三角瓶中，加入鹽酸水溶液(3∶20)130 mL，于三角瓶上加1 m長(zhǎng)玻璃回流管，沸水浴中酸水解15 min，然后冷水冷卻，用6 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性(必要時(shí)加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀各5 mL，用于去除蛋白質(zhì)和脂肪)，并用水定容至250 mL用濾紙過濾，得總糖水解液。

1.4.2 費(fèi)林試劑滴定法(簡(jiǎn)稱滴定法)

(1) 費(fèi)林AB液標(biāo)定：準(zhǔn)確吸取費(fèi)林A、B溶液各5 mL放入預(yù)先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中(可預(yù)先加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，一般加入9～10 mL)，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰(為使三角瓶受熱均勻及易于觀察終點(diǎn)顏色，可在電爐上加一石棉網(wǎng))，用1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)液滴定至終點(diǎn)(藍(lán)色剛好消失)，記錄消耗葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，即得K值(即費(fèi)林AB液各5 mL相當(dāng)于1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液量)。

(2) 樣品預(yù)滴定：準(zhǔn)確吸取費(fèi)林A、B溶液各5 mL放入預(yù)先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰，用樣品水解液滴定至終點(diǎn)，記錄消耗水解液的體積。

(3) 樣品正式滴定：準(zhǔn)確吸取費(fèi)林A、B溶液各5 mL放入預(yù)先加入20 mL水的200 mL錐形瓶中，加入比預(yù)滴定少1 mL的樣品水解液，搖勻后置于電爐上加熱至沸騰，用樣品水解液滴定至終點(diǎn)，記錄消耗水解液的體積(注：整個(gè)滴定過程控制在2 min內(nèi)完成)。

(4) 還原糖(以葡萄糖計(jì))含量計(jì)算：

(1)

式中：

X——試樣中還原糖的含量，%；

K——費(fèi)林AB液各5.0 mL相當(dāng)于1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液量，mL；

250——樣品檢測(cè)過程定容體積，mL；

V——試樣滴定費(fèi)林AB時(shí)消耗的體積，mL；

M——樣品重量，g。

1.4.3 3,5-二硝基水楊酸比色法(簡(jiǎn)稱比色法)

(1) 樣品及標(biāo)準(zhǔn)液前處理：按表 1試驗(yàn)設(shè)計(jì)取不同體積的1.0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品處理液放入25 mL比色管中，并補(bǔ)足水量至3 mL，各比色管中加入顯色試劑2.0 mL，沸水浴中加熱5 min，冰水浴中冷卻后定容至25 mL搖勻(注：沸水浴及冰水冷卻條件盡量一致)，比色反應(yīng)30 min 后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度Abs值，由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度(質(zhì)量含量)與吸光度Abs值作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2) 還原糖(以葡萄糖計(jì))含量計(jì)算：

(2)

式中：

X——試樣中還原糖的含量，%；

m'——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得的比色液中葡萄糖含量，mg；

表1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)液前處理設(shè)計(jì)表?Table 1 Liquid samples and standards before processing design table

? 沸水浴完成后，于冰水中快速冷卻至室溫。

250——樣品檢測(cè)過程定容體積，mL；

f——稀釋倍數(shù)；

v——比色測(cè)定時(shí)移取試樣待測(cè)液的體積，mL；

m——樣品重量，g。

2 檢測(cè)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

2.1 吸收光譜波長(zhǎng)的選擇

經(jīng)查王歡等[4]、董林青等[5]等論文資料，及NY/T 2332—2013《紅參中總糖含量的測(cè)定 分光光度法》等標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)DNS比色法檢測(cè)波長(zhǎng)通常為490，500，510，520，540 nm，本試驗(yàn)通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列中間點(diǎn)1 500 μg 在400～600 nm進(jìn)行光譜掃描，發(fā)現(xiàn)在540 nm處吸收最為明顯且穩(wěn)定，故本試驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)用540 nm。

2.2 顯色反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列中間點(diǎn)1 500 μg在不同時(shí)間段內(nèi)吸光值及標(biāo)準(zhǔn)物含量的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表2。

表2 顯色反應(yīng)體系的穩(wěn)定性?Table 2 The stability of chromogenic reaction system

? 數(shù)據(jù)分析：平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，SD值8.60，RSD值0.55%。

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖1 500 μg顯色反應(yīng)體系的穩(wěn)定性很高，30～135 min顯色反應(yīng)體系非常穩(wěn)定，平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，精密度均大于95%以上，RSD值0.55%。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況

按表1設(shè)計(jì)所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為X1=6 392.070 57Y+12.233 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，估計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)誤差為45.539 7；殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為40.732 0(儀器系統(tǒng)提供的數(shù)據(jù))；本試驗(yàn)同時(shí)用果糖作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比色法測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為X2=5 272.656 2Y-9.275 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，說明兩種標(biāo)準(zhǔn)品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線均非常理想,標(biāo)準(zhǔn)液檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)液檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 3 Standard test results and data analysis

2.4 樣品總糖檢測(cè)

用兩種不同檢測(cè)方法對(duì)同一樣品總糖進(jìn)行5次平行檢測(cè)，所得檢測(cè)結(jié)果及相對(duì)平均偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等數(shù)據(jù)分析見表4。

由表4可知，樣品總糖檢測(cè)直接滴定法重復(fù)測(cè)定5次，通過計(jì)算測(cè)定結(jié)果，相對(duì)平均偏差為1.59%，RSD為2.00%，說明其精密度比較高。用比色法對(duì)同一樣品重復(fù)測(cè)定5次，由表4中“對(duì)應(yīng)比色液糖含量”和樣品檢測(cè)結(jié)果分析可知，相對(duì)平均偏差為1.37%，RSD為1.68%(因?yàn)閿?shù)據(jù)分析要考慮樣品稱樣量及處理過程稀釋倍數(shù)等因素，故在此只分析檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)而不分析比色液糖含量數(shù)據(jù))，說明樣品比色液糖含量1 500 μg以上的樣品，比色法的精密度也很高。

2.5 樣品還原糖檢測(cè)

用兩種不同檢測(cè)方法對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行還原糖項(xiàng)目的檢測(cè)，所得結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表5。

由表5可知，比色液糖含量低于1 500 μg的樣品滴定法檢測(cè)樣品平行性較差(因?yàn)閿?shù)據(jù)分析要考慮樣品稱樣量及處理過程稀釋倍數(shù)等因素，故在此只分析檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)而不分析比色液糖含量數(shù)據(jù))，精密度一般在8%～13%，而比色法精密度一般在2.0%～4.5%，說明比色液糖含量低于1 500 μg 樣品的檢測(cè)比色法比滴定法平行性和重現(xiàn)性均高很多。

表4 樣品總糖檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析Table 4 Samples of total sugar test results and data analysis

表5 樣品還原糖檢測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析?Table 5 Sample reducing sugar test results and data analysis %

? 樣品1、3、5為湘西野生菊芋；樣品2、4為浙江金華菊芋；精密度是指在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的5%?！?”后數(shù)據(jù)為對(duì)應(yīng)比色液糖含量，單位為μg。

2.6 不同濃度葡萄糖標(biāo)液的檢測(cè)

用兩種檢測(cè)方法檢測(cè)不同溶度標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，所測(cè)結(jié)果及數(shù)據(jù)分析見表6。

由表6可知，采用直接滴定法測(cè)定不同濃度(或質(zhì)量含量)的葡萄糖標(biāo)液含量，1 500 μg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液RSD值滴定法為1.86%，比色法為3.04%，而150 μg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液RSD值滴定法為5.04%，比色法3.27%，可見滴定法較適宜于檢測(cè)高濃度樣品，與2.4和2.5的分析一致。綜上可知，① 兩種方法檢測(cè)樣品的重復(fù)性均較好，但滴定法在檢測(cè)較低濃度樣品時(shí)其精密度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，如表5中樣品1、3、4，以及表6中的150 μg的標(biāo)準(zhǔn)液，因?yàn)橘M(fèi)林試劑滴定法影響因素較多如玻璃儀器、滴定時(shí)間、化學(xué)反應(yīng)、人員因素等，且滴定法終點(diǎn)計(jì)量控制為1滴或半滴，而沒有更準(zhǔn)確的計(jì)量方法，從而導(dǎo)致的誤差對(duì)于低濃度樣品則更為突顯。而比色法對(duì)高低濃度的檢測(cè)精密度控制均在于其氨基化合物的生成量，以化學(xué)量比關(guān)系反應(yīng)作為計(jì)量方法，故濃度高低對(duì)于檢測(cè)結(jié)果影響不大(只要保證顯色劑過量和Abs值在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)即可)；② 在比色法檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)其每次的吸光度Abs值相差較大，故要求每次檢測(cè)樣品必同時(shí)做相同條件的標(biāo)準(zhǔn)曲線，比色法對(duì)于受熱程度、煮沸時(shí)間、冷卻時(shí)間等控制要求一致，并且每批次檢測(cè)必做相同條件的標(biāo)準(zhǔn)曲線；③ 滴定法檢測(cè)適用于高濃度樣品的檢測(cè)，其對(duì)于自帶顏色產(chǎn)品檢測(cè)又有其特定優(yōu)勢(shì)，比色法檢測(cè)適用于高濃度和低濃度樣品檢測(cè)，但對(duì)于自帶顏色樣品的檢測(cè)受干擾影響較大。

表6 不同濃度葡萄糖標(biāo)液測(cè)定結(jié)果及數(shù)據(jù)分析?Table 6 Different concentrations of glucose standard solution determination results and data analysis

? 精密度指檢測(cè)平均值減去標(biāo)準(zhǔn)值的差值與標(biāo)準(zhǔn)值比值，反應(yīng)檢測(cè)值與標(biāo)準(zhǔn)值的相符性或接近性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)證明1 500 μg標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖顯色反應(yīng)體系在常溫下穩(wěn)定性很高，平均值1 559.93 μg，極差值21.57 μg，精密度均大于95%以上，RSD值0.55%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999。在測(cè)定菊芋中總糖和還原糖含量時(shí)，費(fèi)林試劑滴定法和3,5-二硝基水楊酸比色法均適用于較高濃度(比色液糖含量1 500 μg以上)樣品的檢測(cè)，滴定法RSD為2.00%，比色法RSD為1.68%；但對(duì)于濃度較低(比色液糖含量低于1 500 μg 以下)樣品的檢測(cè)宜使用比色法，滴定法檢測(cè)樣品平行性較差，精密度一般在8%～13%，而比色法精密度一般在2.0%～4.5%。3,5-二硝基水楊酸比色法應(yīng)用較為廣泛，處理過程簡(jiǎn)單可控，可用于大批量檢測(cè)，適用于不同含量樣品的檢測(cè)，但不適用于自帶顏色樣品的檢測(cè)。

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Comparative study on two methods for sugar detection in Jerusalem artichoke

ZHANG Xue-ying1HUANGZhong-yi2ZHANHFa-sheng1SHIYan1HUANGJing1

(1.XiangxiAutonomousPrefecture,TheFoodandDrugInspection,Jishou,Hunan416000,China; 2.HunanFoodSupervisionandInspectionInstitute,Changsha,Hunan410000,China)

This paper compared the pros and cons, the operability of two methodology, by using the Fenlin reagent titration and the 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry, to determine the reducing sugar content and the total sugar content in the wildJerusalemartichokefrom Xiangxi. The RSD value is 2.00% by using Fenlin reagent titration and the precision is 8%～13%, while, the RSD value is 1.68% by using 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry and the precision is 2.5%～4.0%. It is concluded that the Fenlin reagent titration method is susceptible to the finish measurement etc factors, especially for samples with low sugar content, but is more suitable for detection of sample with color, while the 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetric method is simple, fast and suitable for batch processing, the RSD value is 0.55% when the color reaction system is in 135 min, the color reaction system is quite stable, little effect on the low concentration sample, and the result is more accurate.

3, 5-2 nitro salicylic acid colorimetry; the fehling reagent titration; inulin; reducing sugar

張學(xué)英(1975-)，女，湘西自治州食品藥品檢驗(yàn)所高級(jí)工程師，碩士。E-mail: 1760013691@qq.com

2017-01-03

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.014