李靖坤，王珊珊，陳相峰＊，王曉利，林云良

（山東省分析測試中心，山東 濟南 250014）

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定基因毒性雜質(zhì)3,4-二氯苯胺的方法學(xué)驗證

李靖坤，王珊珊，陳相峰＊，王曉利，林云良

（山東省分析測試中心，山東 濟南 250014）

文章建立了一種氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定吉非替尼中3,4-二氯苯胺的方法。本方法采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）掃描模式，能夠有效的降低基質(zhì)效應(yīng)，在1～100ng/mL 范圍內(nèi)3,4-二氯苯胺線性關(guān)系良好，化合物相關(guān)系數(shù)均大于0.990，回收率在92.53%～118.15%，目標化合物峰面積(RSD%)值均小于10.0%。可滿足吉非替尼中基因毒性雜質(zhì)3,4-二氯苯胺的測定要求。

GC/MS/MS；基因毒性雜質(zhì)；3,4-二氯苯胺

1 前言

吉非替尼（易瑞沙）是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑[1]，是一種新型的治療癌癥的藥物，可以通過抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中細胞信號的傳導(dǎo)來抑制惡性腫瘤細胞的增生[2-4]，目前已在多個國家批準上市用于癌癥的治療[5]。吉非替尼常被應(yīng)用于治療已經(jīng)接受了化學(xué)治療或者是不適于化療的晚期的或者轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌。在制備吉非替尼的工藝流程中往往會存在溶劑殘留問題，而這些殘留的溶劑中有許多是基因毒性雜質(zhì)?；蚨拘噪s質(zhì)在低濃度時就可造成人體的遺傳物質(zhì)的損傷[6-7]，從而導(dǎo)致基因突變[10-12]并可能促使腫瘤的發(fā)生。近幾年來，隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)的逐步完善，美國食品和藥物管理局( FDA) 和歐洲藥物管理局( EMEA)等部門對基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管要求越來越高。藥物中基因毒性雜質(zhì)如果控制不當，可能會導(dǎo)致臨床隱患，同時也會影響新藥上市時間。歐洲EMEA和美國FDA 均提出采用“毒理學(xué)關(guān)注閾值”( thresh-old of toxicological concern，TTC) 作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度[8-9]。本文對吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性雜質(zhì)進行了研究。

2 實驗部分

2.1 材料、試劑與儀器

分析儀器采用Agilent 7890A-7000B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱采用DB-5 30 m×0.25 mm×0.25μm, 固定相為5%-苯基-甲氧基聚硅氧烷，柱溫采用起始溫度80℃，維持0分鐘，以15℃每分鐘的速率升溫至250℃，維持0.5分鐘。進樣口溫度設(shè)定為220℃，分流模式為不分流，載氣采用高純氦氣，流速為1.0 ml/min，進樣體積為1.0 μl，離子源溫度為230℃，采集模式為多反應(yīng)監(jiān)測采集模式（MRM），定量離子對為166/99，定性離子對為166/90，碰撞能為25eV。超聲使用KQ2202型數(shù)控超聲波清洗機。

圖1 全掃描色譜圖Fig.1 Full scan chromatogram

圖2 3，4-二氯苯胺質(zhì)譜圖Fig.2 3,4-dichloroaniline mass spectrogram

2.2 溶液配制

稀釋溶劑采用甲醇。供試品溶液采取吉非替尼40mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加稀釋溶劑溶解并定容至刻度，搖勻，超聲2min，作為供試品溶液。對照品貯備液取3，4-二氯苯胺100mg，精密稱定，置10ml量瓶中，加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液1。精密量取1.0ml貯備液1，置100ml量瓶中，加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，貯備液2。精密量取1.0ml 貯備液2，置100ml量瓶中，加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2.0ml，置100ml量瓶中，加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，作為對照品溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 專屬性研究

專屬性實驗要求單獨進空白溶液，證明該溶液對被測物測試無干擾，然后取對照品貯備液進樣。結(jié)果見圖1、圖2，由色譜圖可以看出，空白溶液對雜質(zhì)檢測無干擾，供試品中其他雜質(zhì)對3,4-二氯苯胺的檢測無干擾。

3.2 標準曲線

精密量取適量對照品儲備液，配置成100ng/mL、50ng/ mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL濃度梯度的標準溶液，取上述各線性溶液各1μL 進樣，記錄峰面積。以目標物濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標作回歸曲線，計算回歸方程及相應(yīng)的線性回歸系數(shù)。獲得化合物的標準曲線及相關(guān)系數(shù)。得到2,4 -二氯苯胺的回歸方程y=3.1736x+4.358，其相關(guān)系數(shù)為0.9984，說明方法線性良好。

3.3 檢出限及定量限

準確配制被測物標準溶液，逐步稀釋至一定濃度并進樣，其信噪比（S/N）為3左右時的樣品濃度即為檢測限濃度，檢測限連續(xù)進3針；信噪比在10～15的樣品的濃度即為定量限濃度，定量限連續(xù)進樣6針；檢測限濃度與樣品理論濃度的比值即為檢測限；定量限濃度與樣品理論濃度的比值即為定量限，計算對應(yīng)的峰高RSD應(yīng)≤10.0%，定量限為2.5ppm，檢出限為1ppm。結(jié)果見表1。

表1 檢出限及定量限結(jié)果Table 1 Detection limit and the quantitative results

3.4 方法回收率及精密度

精密稱取吉非替尼40mg，置10ml量瓶中，再精密加入對照品儲備溶液0.16mL，再加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，超聲2min。取上清液作為80%限度測試溶液。同上述方法，做100%和120%限度測試溶液分析。由表3可見，回收率在92.53%～118.15%之間，回收率的相對標準偏差為4.86%。方法的精密度為7.68%?；厥章屎途芏葘嶒灲Y(jié)果良好，符合方法學(xué)的要求。

表2 方法的加標回收率Table 2 The method of standard addition recovery rate

3.5 樣品檢測

精密稱定1#、2#和3#樣品各40mg，置于10mL的量瓶中，超聲2min，搖勻，按照上述方法分析，分別測三次。三批樣品中均未檢出該基因毒性雜質(zhì)，可見所分析樣品安全。

4 結(jié)論

本方法采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性雜質(zhì)，方法靈敏度高，基質(zhì)干擾小，適合應(yīng)用到實驗室中藥物基因毒性雜質(zhì)的日常檢測。

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Validation of GC-MS/MS Method for The Analysis of Genotoxic Impurity 3,4-Dichloroaniline

Li Jingkun, Wang Shanshan, Chen Xiangfeng*, Wang Xiaoli, Lin Yunliang
(Shandong Analysis and Test Centre, Jinan 250014 Shandong China)

A gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) method was developed for the determination of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib. The matrix effect was effectively reduced by multiple reaction monitoring (MRM) mode. The developed method has good linear relationship in the concentration range of 1～100 ng/mL with correlation coefficient above 0.990. The recoveries of target analyte ranged from 92.53% to 118.15%. The precision of method (RSD%) were less than 10.0%. This method can be used to the analysis of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib.

GC/MS/MS, Genotoxic impurity, 3,4-Dichloroaniline

TS255.7

A

10. 11967/ 2017150112

TS255.7

A DOI：10. 11967/ 2017150112

李靖坤 , 山東省分析測試中心, 碩士研究生, 研究方向: 藥物分析。

陳相峰, 副研究員，博士, 山東省分析測試中心, 研究方向: 復(fù)雜體系質(zhì)譜分析方法、技術(shù)與應(yīng)用研究 E-Mail: xiangfchen@aliyun.com.

基金支持: 山東省科學(xué)院科技發(fā)展基金 (科基合字(2012)第11號)。