吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

“新吉富”羅非魚(yú)免疫球蛋白單克隆抗體的制備及其在免疫效果評(píng)價(jià)上的應(yīng)用

吳 斌

(福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站/福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002)

制備了“新吉富”羅非魚(yú)血清免疫球蛋白IgM單克隆抗體(McAb)并進(jìn)行了特性分析，以血清IgM McAb為基礎(chǔ)，建立了IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法.采用親和層析法純化健康“新吉富”羅非魚(yú)IgM，純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為75～78、23～25 ku；以純化的IgM為抗原制備IgM McAb，制備McAb雜交瘤細(xì)胞株系3株，分別命名為2H5、2D4、2B11，抗體亞型均為IgM，小鼠腹水效價(jià)分別為1.0×10-5、1.0×10-4、1.0×10-5，對(duì)IgM敏感度測(cè)定表明，2H5、2D4、2B11檢測(cè)靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.以抗羅非魚(yú)IgM McAb包被酶標(biāo)板，建立IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法.以無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚(yú)，受免血清按建立的IgM捕獲ELISA方法檢測(cè)特異性抗體，結(jié)果表明，建立的IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法可應(yīng)用于免疫應(yīng)答抗體水平分析.

“新吉富”羅非魚(yú); 免疫球蛋白IgM; 單克隆抗體; ELISA檢測(cè)方法

羅非魚(yú)作為我國(guó)主要的淡水魚(yú)養(yǎng)殖品種之一，2006年以來(lái)，鏈球菌病給羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危機(jī)，免疫防治將成為控制該疾病的主要方向.在魚(yú)類(lèi)的體液免疫應(yīng)答過(guò)程中，免疫球蛋白是重要的免疫效應(yīng)分子.目前從硬骨魚(yú)類(lèi)中已經(jīng)分離到的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ、IgT、IgG等[1].IgM是一類(lèi)存在于所有有頜類(lèi)脊椎動(dòng)物中的抗體[2]，其單體由兩條輕鏈(L鏈)、兩條重鏈(H鏈)組成，通過(guò)連接鏈將5個(gè)單體連接成一個(gè)五聚體，相對(duì)分子質(zhì)量為700～850 ku.

為了研究羅非魚(yú)的免疫機(jī)制，吳鐵軍等[3]克隆獲得了羅非魚(yú)IgM重鏈的cDNA，其序列全長(zhǎng)1 885 bp，有一個(gè)長(zhǎng)1 770 bp的完整閱讀框，編碼588個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為41 453.94 u，為羅非魚(yú)IgM重鏈基因功能的鑒定工作提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù).黃婷等[4]采用rProtein A Sepharose親和層析一步法純化羅非魚(yú)IgM，并制備其兔抗血清，結(jié)果表明，血清IgM重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為88.0、21.0 ku，由血清IgM制備的兔多抗效價(jià)為1∶32 000.由于羅非魚(yú)IgM兔多抗成分復(fù)雜，IgM多克隆抗體應(yīng)用于免疫血清特異性抗體檢測(cè)存在靈敏度不足、特異性差的問(wèn)題.因此，制備特異性強(qiáng)的羅非魚(yú)免疫球蛋白IgM單克隆抗體(monoclonal antibody, McAb)顯得尤為重要.目前，尚未見(jiàn)以羅非魚(yú)免疫球蛋白IgM McAb為制劑，建立IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法的報(bào)道.本試驗(yàn)通過(guò)制備羅非魚(yú)IgM McAb，建立血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法，為羅非魚(yú)疫苗免疫效果評(píng)價(jià)、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測(cè)以及IgM的結(jié)構(gòu)與功能分析、免疫應(yīng)答模式研究等建立物質(zhì)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 “新吉富”羅非魚(yú)由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供；Balb/c雌性小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司.

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 RPMI-1640培養(yǎng)液、HAT培養(yǎng)液、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、Ig亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自廈門(mén)泰京生物技術(shù)有限公司；Hitrap IgM Purification抗體純化試劑盒購(gòu)自Pierce公司；TMB顯色液、牛血清白蛋白購(gòu)自Sigma公司；PEG(MW4000)購(gòu)自Merck公司；BHI、LB等細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋公司.

1.1.3 菌株、抗體與細(xì)胞株 無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)070717LL、SIP-pET32a重組原核表達(dá)工程菌及SIP重組表達(dá)蛋白、SIP抗兔多克隆抗體、羅非魚(yú)IgM兔多克隆抗體均由福建省淡水水產(chǎn)研究所水產(chǎn)動(dòng)物病害防治研究室制備與保存；骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由第四軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室提供.

1.2 羅非魚(yú)IgM的分離與純化

1.2.1 血清的制備 羅非魚(yú)心臟采血，血清置冰箱(4 ℃)過(guò)夜，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清備用.

1.2.2 IgM的分離純化 血清經(jīng)20% PEG6000沉淀后，用HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR凝膠過(guò)濾層析，收集第一個(gè)峰的組分，用Hitrap IgM Purification精細(xì)純化，SDS-PAGE電泳分析純化樣品.

1.3 羅非魚(yú)IgM免疫小鼠

取8周齡的Balb/c雌性小鼠5只，將純化的羅非魚(yú)IgM與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，以0.2 mL·只-1腹腔注射免疫小鼠[5]，一免后于第14、28、35天分別用羅非魚(yú)IgM與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后加強(qiáng)免疫,4免后尾部采血，應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)鼠血清效價(jià).

1.4 羅非魚(yú)IgM雜交瘤細(xì)胞株的建立與McAb的制備

當(dāng)免疫Balb/c小鼠血清的效價(jià)達(dá)到1.0×10-5后，按照文獻(xiàn)[5]的方法，應(yīng)用McAb制備技術(shù)，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，采用間接ELISA檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性細(xì)胞孔，有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆，建立、保存McAb雜交瘤細(xì)胞株，并制備McAb細(xì)胞株小鼠腹水.

1.5 羅非魚(yú)IgM McAb小鼠腹水效價(jià)的測(cè)定

McAb小鼠腹水的效價(jià)采用間接ELISA檢測(cè)方法測(cè)定.酶標(biāo)板包被羅非魚(yú)IgM(20 μg·mL-1)；5% BSA封閉；加入以10倍梯度稀釋的IgM McAb小鼠腹水，分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照(受免的Balb/c小鼠多抗血清)、陰性對(duì)照(未免疫的Balb/c小鼠血清)，于37 ℃溫育1 h；加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，于37 ℃溫育1 h；加TMB顯色液，室溫避光顯色10～20 min；加終止液，靜置10 min；將空白對(duì)照調(diào)零，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450、630 nm雙波長(zhǎng)的光密度(D)；若待測(cè)孔的D大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍時(shí)為陽(yáng)性.

1.6 羅非魚(yú)IgM McAb細(xì)胞株亞類(lèi)的鑒定

羅非魚(yú)IgM McAb細(xì)胞株Ig亞類(lèi)鑒定按Ig亞類(lèi)鑒定試劑盒步驟進(jìn)行.

1.7 羅非魚(yú)IgM McAb靈敏度的測(cè)定

將羅非魚(yú)IgM兔多克隆抗體包被酶標(biāo)板，IgM按一定倍數(shù)梯度稀釋?zhuān)? 000 ng至1 ng的系列質(zhì)量作抗原，IgM McAb(15 μg·mL-1)作抗體，采用雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法測(cè)定McAb對(duì)IgM的靈敏度.

1.8 受免羅非魚(yú)血清特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立

用抗原SIP蛋白免疫羅非魚(yú)，收集血清用于建立特異性IgM抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法.具體步驟如下：將羅非魚(yú)IgM McAb 2H5純化，以20 μg·mL-1的含量包被酶標(biāo)板；用5%牛血清白蛋白封閉；加入待測(cè)的受免羅非魚(yú)血清(按一定倍數(shù)梯度稀釋)100 μL,同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(按一定倍數(shù)梯度稀釋的正常羅非魚(yú)血清)、空白對(duì)照(PBS液)，于37 ℃溫育；洗滌后加入SIP蛋白(10 μg·mL-1)，于37 ℃溫育；洗滌后加入抗SIP蛋白的兔多克隆抗體(按1∶100稀釋)，于37 ℃溫育；洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗；最后用TMB顯色；終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定450、630 nm雙波長(zhǎng)的D；測(cè)定待測(cè)樣品的D(P)、同倍稀釋的陰性對(duì)照樣品的D(N)，當(dāng)P/N≥2.1時(shí)判為陽(yáng)性.

1.9 IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法應(yīng)用于抗體效價(jià)的檢測(cè)

1.9.1 無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗的制備 無(wú)乳鏈球菌菌株070717LL在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)收集菌體，調(diào)整菌液濃度至1×108CFU·mL-1，用0.5%甲醛滅活24 h，于5 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次，用超聲波破碎菌體，備用.

1.9.2 無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗免疫羅非魚(yú) 取質(zhì)量約80 g的健康“新吉富”羅非魚(yú)，暫養(yǎng)1周后，分為3組，每組50只.第1組為陰性對(duì)照組，腹腔注射0.5 mL生理鹽水；第2組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1)，一免后第21天用全菌滅活疫苗浸泡加強(qiáng)免疫(浸泡菌濃度1.0×107CFU·mL-1)；第3組腹腔注射全菌滅活疫苗，免疫0.5 mL·只-1(菌濃度1.0×108CFU·mL-1).

1.9.3 受免羅非魚(yú)血清特異性抗體效價(jià)的檢測(cè) 一免后，于第7、14、21、28、35、42天各組均隨機(jī)取5尾“新吉富”羅非魚(yú)，分離血清，按“1.8”建立的IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，分析羅非魚(yú)血清中特異性抗體的效價(jià).

2 結(jié)果與分析

1:蛋白Marker;2:20% PEG6000;3:HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR洗脫液;4:Hitrap IgM Purification洗脫液.

表1 3株羅非魚(yú)McAb的亞型及其效價(jià)

2.1 羅非魚(yú)血清IgM的分離純化

羅非魚(yú)血清用20% PEG6000沉淀去除了大量雜蛋白，凝膠過(guò)濾層析得到進(jìn)一步純化，親和層析得到較純的IgM，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，可見(jiàn)75～78、23～25 ku的條帶(圖1).

2.2 羅非魚(yú)IgM McAb雜交瘤細(xì)胞株系的建立

在羅非魚(yú)IgM McAb雜交瘤細(xì)胞株系的建立過(guò)程中共進(jìn)行5次細(xì)胞融合，融合率均達(dá)55.8%以上.檢測(cè)到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞孔后，對(duì)細(xì)胞孔中的細(xì)胞進(jìn)行3次以上的單克隆化，獲得3株能穩(wěn)定分泌McAb的陽(yáng)性細(xì)胞株，分別命名為2H5、2D4、2B11.

2.3 羅非魚(yú)IgM McAb的特性

3株羅非魚(yú)McAb的效價(jià)測(cè)定、Ig亞類(lèi)鑒定結(jié)果(表1)顯示，3株McAb效價(jià)均較高.

2.4 羅非魚(yú)IgM McAb的敏感度

根據(jù)雙抗夾心ELISA方法，應(yīng)用3株羅非魚(yú)IgM McAb檢測(cè)IgM，結(jié)果(表2)顯示，2H5、2D4、2B11檢測(cè)IgM的靈敏度分別為31.25、125.00、62.50 ng.

2.5 無(wú)乳鏈球菌滅活疫苗免疫的羅非魚(yú)血清特異性抗體效價(jià)

應(yīng)用羅非魚(yú)IgM捕獲ELISA檢測(cè)方法分別檢測(cè)3組羅非魚(yú)血清的特異性抗體效價(jià)，結(jié)果(圖2)顯示：第1組(陰性對(duì)照組)血清的效價(jià)均小于1∶50；第2組血清首免后第7天的效價(jià)為1∶200，第21、28天的效價(jià)最高(1∶800)，第42天的效價(jià)為1∶200；第3組血清首免后第7天的效價(jià)為1∶200，第21天的效價(jià)最高(1∶800)，從第28天到第42天，血清效價(jià)從1∶400降低到1∶100.

表2 應(yīng)用3株羅非魚(yú)IgM McAb ELISA檢測(cè)IgM的靈敏度1)

1)+表示陽(yáng)性；-表示陰性.

圖2 全菌滅活疫苗免疫的羅非魚(yú)血清特異性抗體效價(jià)

3 討論

當(dāng)前，針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)已建立了斑點(diǎn)叉尾鮰、草魚(yú)、歐洲鰻、牙鲆、銀鯽、大黃魚(yú)、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚(yú)、烏鱧IgM的分離與純化方法[4,6-16]，通過(guò)蛋白電泳、蛋白質(zhì)印跡、液相色譜分析等方法明確了這些魚(yú)種IgM重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為52～79 ku，輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為25～29 ku.本試驗(yàn)采用PEG6000沉淀粗提、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等步驟獲得較高純度的“新吉富”羅非魚(yú)IgM，重鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為75～78 ku，輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量為23～25 ku.張小萍等[17]研究表明，尼羅羅非魚(yú)IgM重鏈、輕鏈的相對(duì)分子質(zhì)量分別為77、27 ku，與本試驗(yàn)的結(jié)果基本相符.

目前，羅非魚(yú)和斑點(diǎn)叉尾鮰[4]，以及草魚(yú)、大黃魚(yú)、黃鰭棘鯛、黃鱔、鱸血、美洲黑石斑魚(yú)、烏鱧IgM的多克隆抗體已經(jīng)制備[7,11-16]，并應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)IgM的結(jié)構(gòu)分析.但由于魚(yú)類(lèi)Ig分子中的糖基具有強(qiáng)免疫原性，能刺激受免疫動(dòng)物產(chǎn)生大量抗糖基抗體，導(dǎo)致多克隆抗體產(chǎn)生非特異反應(yīng)；另外制備高度純化的免疫原技術(shù)難度大，殘留的雜質(zhì)也將影響二抗的特異性[8].而魚(yú)類(lèi)IgM McAb具有抗原決定簇單一、對(duì)抗原純度要求不高、抗原與抗體結(jié)合力強(qiáng)、可體外大量制備的優(yōu)點(diǎn).因此，制備魚(yú)類(lèi)IgM McAb并應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)免疫細(xì)胞的鑒定、抗體結(jié)構(gòu)分析、血清流行病學(xué)調(diào)查、免疫應(yīng)答水平監(jiān)測(cè)、免疫效果評(píng)價(jià)等方面，為魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)、血清學(xué)研究提供了重要工具.目前，草魚(yú)[6]、歐洲鰻[8]、牙鲆[9]、銀鯽[10]、尼羅羅非魚(yú)[17]、紫紅笛鯛[18]、奧尼羅非魚(yú)[19]等魚(yú)體的IgM McAb已被制備，并廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)研究.本試驗(yàn)制備出“新吉富”羅非魚(yú)IgM McAb，并初步應(yīng)用于羅非魚(yú)免疫血清的特異性抗體檢測(cè)與疫苗免疫效果分析，在后期的工作中，有必要應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡、B細(xì)胞定位等方法，明確所制備的McAb針對(duì)的羅非魚(yú)IgM抗原決定簇和表位結(jié)構(gòu)，以進(jìn)一步應(yīng)用于羅非魚(yú)IgM結(jié)構(gòu)和功能的分析，以及羅非魚(yú)病原診斷、免疫機(jī)理研究.

應(yīng)用本試驗(yàn)制備的羅非魚(yú)IgM McAb檢測(cè)IgM的靈敏度，可以用IgM直接包被酶標(biāo)板的間接ELISA方法檢測(cè)，也可以用IgM多克隆抗體捕獲IgM，再進(jìn)行間接ELISA檢測(cè).本試驗(yàn)使用的方法可以避免在IgM直接包被的過(guò)程中，抗原包被不完全而造成檢測(cè)數(shù)據(jù)誤差的狀況；同時(shí)在羅非魚(yú)血清樣品的特異性抗體檢測(cè)中，由于待測(cè)血清未經(jīng)過(guò)純化，成分中除了IgM，還有其他復(fù)雜的細(xì)胞因子成分，使用捕獲ELISA檢測(cè)方法可有效地排除血清中的非特異性成分對(duì)檢測(cè)過(guò)程的干擾.

為了尋找合適的免疫途徑，本試驗(yàn)應(yīng)用捕獲ELISA檢測(cè)方法對(duì)用不同方式免疫的受免疫羅非魚(yú)的抗體水平進(jìn)行了評(píng)估.結(jié)果表明，采用注射、浸泡2種免疫方式的羅非魚(yú)在浸泡加強(qiáng)免疫后，血清特異性抗體的效價(jià)不僅在高水平上維持的時(shí)間長(zhǎng)，且第28～42天的特異性抗體表達(dá)水平均比單獨(dú)采用注射免疫的高，能讓受免羅非魚(yú)魚(yú)體保持更持久的抗體水平，有利于延長(zhǎng)疫苗免疫的保護(hù)期并提高保護(hù)率.

致謝：感謝福建省淡水水產(chǎn)研究所張新艷高級(jí)工程師、鄭磊工程師在本研究中給予的幫助和支持.

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(責(zé)任編輯:施曉棠)

Preparation of McAbs against immunoglobulinin fromOreochromisniloticusand its application in immune effect analysis

WU Bin

(Fujian Provincial Fishery Technical Extention Center/Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To prepare effective monoclonal antibody (McAb) against serum immunoglobulin (Ig) of tilapia, antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was conducted, and Ig of healthyOreochromisniloticuswas purified by protein A affinity chromatography to characterize its immunological feature. Then purified IgM was used as antigen to immunize Balb/c mice. SDS-PAGE analysis showed that molecular weight of tilapia Ig heavy chain and light chain was 75-78 and 23-25 ku, respectively. Three hybridomas strains secreting monoclonal antibodies (McAb) were obtained and named 2H5, 2D4, and 2B11, with the common isotype being IgM. And titers in the ascites of Balb/c mice were 1.0×10-5, 1.0×10-4, 1.0×10-5, respectively. Sensitivities of McAb against tilapia IgM was high, with detection limits being 31.25, 125.00, and 62.50 ng, respectively. Furthermore, MAC-ELISA showed that specific antibody was detected within tilapia immuned byStreptococcusagalaciateinactivated vaccine.

Oreochromisniloticus; immunoglobulin; monoclonal antibody; ELISA

2016-06-22

2017-01-16

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-49)；福建省公益類(lèi)科研院所專(zhuān)項(xiàng)(2014R1002-3)；福建省海洋與漁業(yè)廳重點(diǎn)項(xiàng)目(閩海漁合同[2010]2-12號(hào)).

吳斌(1978-)，男，高級(jí)工程師，碩士.研究方向：水產(chǎn)動(dòng)物病害分子免疫學(xué).Email：wubinfire@126.com.

S948

A

1671-5470(2017)02-0187-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.02.011