周瑋婧++李書藝++王文娟

摘要：利用作為廢棄物的蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）節(jié)資源，采用乙醇超聲浸提的方法從蓮藕節(jié)中提取多酚。通過單因素試驗(yàn)確定了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、pH、溫度和時(shí)間對蓮藕節(jié)中多酚提取率的影響，并進(jìn)一步通過響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行分析和實(shí)際應(yīng)用考慮，確定蓮藕節(jié)中多酚提取的最佳工藝條件為pH 4.0，溫度40 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)61.04%，料液比1∶20.53（m∶V），提取時(shí)間45.20 min，經(jīng)過該工藝優(yōu)化后蓮藕節(jié)多酚提取率提高至6.27%。對通過優(yōu)化工藝提取的蓮藕節(jié)多酚進(jìn)行抗氧化性能測定，結(jié)果顯示蓮藕節(jié)多酚有較好的清除DPPH自由基的能力。

關(guān)鍵詞：蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）節(jié)；多酚；提取工藝；優(yōu)化

中圖分類號：S645.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0938-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.037

Technology Optimization for Extracting Polyphenol from Lotus Festival

ZHOU Wei-jing1，LI Shu-yi2，WANG Wen-juan2

（1.Wuhan Institute for Food and Cosmetic Control， Wuhan 430000， China；2.College of Food Science & Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract： In order to make full use of the resources of lotus festival as wastes，the optimal conditions for extraction yield of polyphenol from lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival，so this issue with lotus festival for raw materials，ethanol ultrasonic extraction method for extracting polyphenol from multiple intersecting in. By single factor test to determine the alcohol concentration，solid-liquid ratio，pH，temperature and time on lotus festival polyphenol extraction and further analysis and consideration of the practical application of response surface experiments to determine the lotus root section of the ultrasonic extraction of polyphenol. The process conditions were pH 4.0， temperature of 40 ℃， ethanol concentration 61.04%， solid-liquid ratio of 1∶20.53（m∶V），extraction time 45.20 min. It is better for industrialized extraction and lotus festival polyphenol maximum extraction yield 6.27%. The polyphenol from lotus festival have strong scavenging effects to DPPH radicals.

Key words： lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival； polyphenol； extraction technology； optimization

多酚具有較強(qiáng)的抗氧化特性，可以清除體內(nèi)自由基，從而達(dá)到預(yù)防心血管疾病、延緩衰老的作用，植物多酚大部分都存在于植物的根、莖和葉子中。蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）為睡蓮科蓮屬多年生大型水生草本植物，在中國栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富，是傳統(tǒng)的出口蔬菜，分布在湖北、湖南以及浙江等地。蓮藕的根、莖、葉到果實(shí)各個(gè)部位都是寶，有開胃消食、清熱解毒、滋生養(yǎng)性的功效，其中蓮藕節(jié)還可以用于治療咳血、尿血等疾病，具有較高的藥用價(jià)值。蓮藕節(jié)是蓮的干燥根莖節(jié)部，質(zhì)地較硬，附有一些須根及須根痕[1]。中國每年消費(fèi)大量的蓮藕，但由于有些部位不可食用，以及貯藏期很容易發(fā)生酶促褐變等原因，產(chǎn)生大量蓮藕廢棄物，然而蓮藕廢棄物中仍具有許多加工潛力的活性物質(zhì)。蓮藕節(jié)就是其中一種，其含有多種有效成分如多酚。有研究表明[2]，蓮藕的平均多酚含量約為117 mg/100 g（FW），主要由多巴、兒茶酚、沒食子酸、兒茶素和表兒茶素等組成。所以作為蓮藕的主要功能活性成分，多酚的制備開發(fā)對促進(jìn)產(chǎn)業(yè)精深加工并延展產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義，使蓮藕節(jié)更具有加工價(jià)值。

本研究從蓮藕節(jié)中提取多酚，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化確定蓮藕節(jié)中多酚的超聲輔助浸提工藝，得出最佳的蓮藕節(jié)多酚提取率，并通過體外化學(xué)體系評價(jià)提取物的抗氧化活性，為蓮藕節(jié)的綜合利用和加工以及藕節(jié)中多酚類物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的蓮藕藕節(jié)，購于當(dāng)?shù)厥袌觯粵]食子酸（分析純），購于上海金錦樂實(shí)業(yè)有限公司；無水乙醇（分析純），購于深圳市華昌化工有限公司；福林酚試劑（分析純），購于合肥BIOSHARP生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7200型紫外分光光度計(jì)（德國斯派克分析儀器公司）；R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；CHRIST ALPHA 2-4型真空冷凍干燥機(jī)（武漢利天科技儀器有限公司）；DS-1型高速組織搗碎機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；FuheHH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；SH2-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蓮藕節(jié)中多酚提取流程 稱取10 g蓮藕節(jié)并粉碎成渣→加入一定料液比的乙醇溶液→置于控溫超聲場中浸提→真空抽濾→旋蒸至10 mL→定容至25 mL→混勻后測定多酚含量。

1.3.2 測定蓮藕節(jié)中多酚含量 精密量取1.0 mL蓮藕藕節(jié)樣品溶液于10 mL刻度試管中，加5 mL去離子水，搖勻1 min后加1.5 mL 20% Na2CO3溶液，加入0.5 mL福林酚試劑，用去離子水定容至10 mL，室溫反應(yīng)2 h，以去離子水為空白對照，在760 nm波長處測定樣品溶液的吸光度[3]。

1.3.3 多酚提取率計(jì)算 蓮藕節(jié)中多酚提取率按公式（1）計(jì)算：

X=■×100% （1）

式中，X為多酚提取率（%）；n為稀釋倍數(shù)；C為多酚質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；m為蓮藕節(jié)質(zhì)量（g）。

1.3.4 蓮藕節(jié)多酚提取工藝優(yōu)化 在其他條件一致時(shí)，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、pH、溫度和時(shí)間作為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素分別設(shè)置5個(gè)水平進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析每個(gè)因素對蓮藕節(jié)中多酚提取的影響。通過單因素試驗(yàn)，得出每個(gè)因素條件下蓮藕節(jié)多酚的提取率，從中選出對蓮藕節(jié)多酚提取率影響較大的3個(gè)因素，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 蓮藕節(jié)多酚清除DPPH自由基能力 取不同稀釋度的蓮藕節(jié)多酚提取液2 mL和2×10-4 mol/L的DPPH甲醇溶液2 mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應(yīng)30 min后于515 nm處測定其吸光度，并用維生素C溶液作為陽性對照，去離子水為空白對照，計(jì)算蓮藕節(jié)多酚對DPPH·的清除率[4]， DPPH自由基清除率按公式（2）計(jì)算：

P=（1-■）×100% （2）

式中，A0為去離子水空白試劑的吸光度；A1為不同濃度提取液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

精確稱取干燥至恒重的沒食子酸10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配成0.1 mg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液管依次準(zhǔn)確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL刻度試管中，按照“1.3.2”方法測定吸光度，以沒食子酸的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。計(jì)算回歸方程為y=0.994 9x-0.075 4，R2=0.995 4。通過線性方程計(jì)算樣品中多酚含量，并根據(jù)公式折算出蓮藕節(jié)多酚提取率。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響 在提取時(shí)間20 min、料液比1∶15（g∶mL，下同）、提取溫度40 ℃和pH 4.0的條件下，測定不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）對蓮藕節(jié)多酚提取效果的影響。如圖2所示，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對蓮藕節(jié)中多酚提取率有影響，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，提取率逐漸增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，蓮藕節(jié)中多酚的提取率最大，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加，多酚提取率呈下降趨勢，故蓮藕節(jié)中多酚提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)選為50%～70%。

2.2.2 料液比對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響 在提取時(shí)間20 min、60%乙醇、提取溫度40 ℃和pH 4.0的條件下，測定不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）對蓮藕節(jié)多酚提取效果的影響。如圖3所示，隨著料液比的增加，蓮藕節(jié)多酚的提取率逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，蓮藕節(jié)多酚提取率達(dá)到最大值，在料液比1∶15以下和1∶25以上時(shí)多酚提取率變化不明顯，故蓮藕節(jié)多酚提取的料液比范圍選定為1∶15～1∶25。

2.2.3 pH對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響 在提取時(shí)間20 min、60%乙醇、提取溫度40 ℃、料液比1∶15的條件下，將pH分別調(diào)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，分析不同pH對蓮藕節(jié)多酚提取效果的影響。如圖4所示，在pH為2.0～6.0時(shí)，蓮藕節(jié)多酚提取率變化不大，所以pH的變化對蓮藕節(jié)多酚提取率影響不大。

2.2.4 溫度對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響 在提取時(shí)間20 min、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的條件下，測定不同提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）對蓮藕節(jié)多酚提取效果的影響。如圖5所示，溫度對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響不明顯，在20～60 ℃蓮藕節(jié)多酚提取率變化不明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5]，溫度的升高有利于植物中多酚類物質(zhì)的溶出和擴(kuò)散，從而提高多酚的浸提效率，但由于本試驗(yàn)采用超聲浸提的方法，超聲作用掩蓋了溫度的影響，所以使得溫度對多酚提取率的影響較小。

2.2.5 提取時(shí)間對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響 在提取溫度40 ℃、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的條件下，測定不同提取時(shí)間（5、10、20、40、60 min）對蓮藕節(jié)多酚提取效果的影響。如圖6所示，隨著超聲提取時(shí)間的增加，蓮藕節(jié)中多酚提取率明顯增大，但在超聲處理20 min后，多酚提取率增加較緩慢。隨著提取時(shí)間的延長，多酚提取率基本不變，由于超聲處理時(shí)耗能較大，從經(jīng)濟(jì)、節(jié)能的角度綜合考慮，將較為理想的蓮藕節(jié)多酚提取時(shí)間選為20、40、60 min。

2.3 蓮藕節(jié)中多酚提取的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)選擇3個(gè)關(guān)鍵因素乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）和提取時(shí)間（X3）為研究對象，以蓮藕節(jié)多酚提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平如表1所示，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，在17組處理組合中12組為分析因素試驗(yàn)，5組為零點(diǎn)。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert 9.0統(tǒng)計(jì)軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得出乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）、料液比（X2）和提取時(shí)間（X3）對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響可以用二次多項(xiàng)回歸方程表示為Y=6.20+0.21X1+0.16X2+0.39X3-0.09X1X2-0.16X1X3-0.019X2X3-0.75X12-0.66X22-0.71X32。對超聲波輔助乙醇提取蓮藕節(jié)中多酚的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。從表3可以看出，模型一次項(xiàng)X1、X3，二次項(xiàng)X12、X22、X32均極顯著，一次項(xiàng)X2影響顯著，交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，因素影響的順序?yàn)閄3>X1>X2。

其中二次響應(yīng)面回歸模型的F值為44.25，P<0.000 1，且Y的模型確定系數(shù)為R2=0.902 7，說明該模型能解釋90.27%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，因此可用此模型對蓮藕節(jié)中提取多酚工藝進(jìn)行分析和預(yù)測。

2.3.3 響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化 按照回歸方程進(jìn)行軟件編程運(yùn)算，得到交互因子的響應(yīng)面圖，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間這3個(gè)因素當(dāng)中的一個(gè)因素固定時(shí)，另外2個(gè)因素及其交互作用對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響見圖7、圖8、圖9。根據(jù)數(shù)據(jù)分析得出，蓮藕節(jié)多酚的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增加，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到一定程度后，多酚提取率有下降的趨勢；料液比也表現(xiàn)出和乙醇體積分?jǐn)?shù)一樣的趨勢，即蓮藕節(jié)多酚提取率隨著料液比的增大先增大后略微減小。然而提取時(shí)間的變化是隨著時(shí)間的增加，多酚提取率增大，由響應(yīng)曲面的陡峭程度可知，提取時(shí)間對蓮藕節(jié)多酚提取率的影響極顯著，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)，這與方差分析結(jié)果一致。乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）與提取時(shí)間（X3）的作用最為明顯。

根據(jù)Design Expert 9.0軟件建立二次多項(xiàng)回歸模型，經(jīng)檢驗(yàn)該模型合理可靠，可用于蓮藕節(jié)中多酚的提取。根據(jù)模型優(yōu)化，采用RSREG Procedure分析得到一個(gè)極值點(diǎn)（Y=6.27%），即從蓮藕節(jié)中提取多酚的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)為61.04%，料液比1∶20.54，提取時(shí)間45.20 min。在此條件下，蓮藕節(jié)多酚提取率為6.27%。

2.4 蓮藕節(jié)中多酚提取的抗氧化活性試驗(yàn)

從圖10可以看出，維生素C和蓮藕節(jié)多酚對DPPH自由基都有較強(qiáng)的清除能力，并且隨著濃度的增加，清除率也逐漸增加。當(dāng)蓮藕節(jié)多酚提取液的濃度達(dá)到400 μg/mL時(shí)，對DPPH自由基清除率達(dá)到60%以上。但蓮藕節(jié)的IC50為153.76 μg/mL，略高于維生素C，表明蓮藕節(jié)中多酚的清除能力比維生素C弱，這可能與蓮藕節(jié)的多酚提取物為粗提物有關(guān)。

3 小結(jié)

結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析，以提取率為指標(biāo)優(yōu)化蓮藕節(jié)多酚的超聲波提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)61.04%，料液比1∶20.53，提取時(shí)間45.20 min。在這個(gè)條件下所提取的蓮藕節(jié)多酚提取率為6.27%。影響蓮藕節(jié)多酚制備效果的各因素主次關(guān)系為提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比，應(yīng)用該方法制備蓮藕節(jié)中的多酚，其工藝較為簡單、操作較方便快捷。

蓮藕節(jié)中多酚的抗氧化性研究結(jié)果表明，在測定DPPH自由基清除率中，蓮藕節(jié)多酚的IC50為153.76 μg/mL，說明蓮藕節(jié)多酚有一定的抗氧化能力，并且隨著樣品濃度的增加，蓮藕節(jié)中的多酚對DPPH的清除力先增強(qiáng)后趨于水平。試驗(yàn)表明，蓮藕節(jié)多酚作為一種天然抗氧化劑，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景，但在試驗(yàn)中從蓮藕節(jié)中提取的多酚含量仍然不是很高，還需要進(jìn)一步優(yōu)化分離純化方法提高其純度。

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