梁錦榮

(云浮市環(huán)境監(jiān)測站 527300)

甘薯中β‐淀粉酶水溶劑法提取的研究

梁錦榮

(云浮市環(huán)境監(jiān)測站 527300)

本文從β-淀粉酶的來源、性質(zhì)、提取方法、純化、鑒定、應(yīng)用和保存等幾個(gè)方面綜述了它們的研究進(jìn)展。目的是，確定水溶劑法從甘薯中提取β—淀粉酶的最佳條件，為工業(yè)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。從時(shí)間、溫度、pH、還原劑以及表面活性劑等單因素探討了甘薯中β-淀粉酶的提取條件。并通過正交實(shí)驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最佳提取條件為提取時(shí)間1h、提取溫度40℃、酸度pH 6.5。0.1mol L-1Na2S2O5，0.5（w/v）% NaHSO3，0.（w/v）% Triton-100使提取量提高10～20%。

甘薯；β-淀粉酶；提取方法；酶活力.

1 預(yù)備實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器

pHS-3C數(shù)字酸度計(jì)，7200分光光度計(jì)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，刻度移液管，試管，燒杯，玻璃棒，DHG-9060A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，全自動(dòng)電光天平，直流穩(wěn)壓電源，刻度吸量管，真空干燥器，容量瓶，秒表，SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵。

1.2 β-淀粉酶的酶活力測定

1.2.1 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取于105～110℃干燥后的麥芽糖100毫克，用蒸餾水溶解，定容至50毫升容量瓶中，配成2毫克／毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液。按表1比例操作后，將各試管在沸水浴l5分鐘，迅速冷卻至室溫。加入10.5 mL蒸餾水稀釋，搖勻，在550 nm處比色測定。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，麥芽糖濃度為橫坐標(biāo)，作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性回歸方程為y = 1.0545 x-0.0773；r2 = 0.999。該曲線用于計(jì)算β-淀粉酶水解淀粉的實(shí)驗(yàn)中所釋放出的還原糖量。

1.2.2 β-淀粉酶活力測定

DNS，配制后經(jīng)放置二十天后使用。具體操作如下：取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液0.1 mL于9.9 mL 2%（w/v）的可溶性淀粉溶液中（pH 6.0，磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉的緩沖液），淀粉和酶的溶液在40℃時(shí)預(yù)熱3 ～5 min后再混合。反應(yīng)15 min 后，移取0.1 mL混合液到1.5 mL DNS和0.4 mL蒸餾水中，立即放入沸水浴中加熱15 min，隨后迅速冷至室溫，再用10.5 mL二次蒸餾水稀釋。用分光光度計(jì)于550 nm處測定。

酶活力定義：在40℃、pH 6.5的條件下，每分鐘水解1 mg麥芽糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（1 U）。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 粉酶提取

材料取一定量新鮮的甘薯，洗凈去皮，切細(xì)，加入2倍（w/v）的去離子水，至于豆?jié){機(jī)中進(jìn)行打漿粉碎7min。然后倒入干凈燒杯，用去離子水洗滌豆?jié){機(jī)壁，一共用去離子水為甘薯的6倍（w/v）。將料液分裝，然后在不同的酸度、溫度、鹽、表面活性劑、還原劑或螯合劑下提取一段時(shí)間。收集用雙層紗布過濾的濾液后，在4000 r / min的離心機(jī)上離心15 min。傾出清液，取0.1 mL上清液，按β-淀粉酶活力測定方法測定酶活力。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.3.1 提取時(shí)間

甘薯β淀粉酶提取量隨時(shí)間變化較為敏感，在提取時(shí)間 1 h處有最大酶活力 。提取時(shí)間低于1 h，提液酶活力上升較迅速，1 時(shí)后酶活力逐漸下降 。由此可見，提取最佳時(shí)間為 1 h，提取時(shí)間過短，β淀粉酶來不及溶出，提取時(shí)間過長，易感染雜菌，β淀粉酶也易變質(zhì)。因此，提取時(shí)間選為0.5 h為宜。

3.3.2 提取溫度

溫度對酶的提取有顯著的影響。一般來講，適當(dāng)?shù)靥岣邷囟?，可提高酶分子在水溶液中的擴(kuò)散速度，也可以增大酶的溶解度，但溫度過高，則容易引起酶的變性失活。

保持料水比、提取酸度和提取時(shí)間不變，甘薯中β-淀粉酶的最佳提取溫度為40℃。當(dāng)提取溫度超過40℃時(shí)，β-淀粉酶會(huì)因?yàn)樘崛囟冗^高而部分失活，從而導(dǎo)致提取率下降。

3.3.3 最適pH

去洗凈去皮的甘薯適量，經(jīng)豆?jié){機(jī)打漿7min，提取溫度40℃，液料比1:6的條件下，分別于 pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的提取液中提取1h，考察不同酸度對甘薯中β淀粉酶提取的影響。

酸度對酶提取的影響較大。在pH 6.5時(shí)酶的提取酶效果最佳。pH低于5或者pH大于7時(shí)，酶的提取量急劇下降，說明過酸或過堿都可能引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)的變化，從而使蛋白質(zhì)變性失活。

3.3.5 還原劑

β-淀粉酶的催化活性基團(tuán)為半胱氨酸（Cys），含有巰基，該基團(tuán)易被金屬離子或氧化劑所屏蔽。所以，向漿液中添加一定量的還原劑或螯合劑能排除重金屬離子和氧化劑的干擾，進(jìn)而提高β-淀粉酶的提取率。

研究表明，無水Na2SO3 能提高約14%的產(chǎn)量，NaHSO3能使酶的提取率提高10%，Na2S2O5能使酶的提取率18%。而L-胱氨酸對提取貢獻(xiàn)不大。

3.3.6 表面活性劑

一定量的表面活性劑可以與細(xì)胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，從而增加細(xì)胞膜的通透性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知Triton-100對酶提取量有較明顯的促進(jìn)效果，而Tween 80對提取效果影響不大。

3.3.7 正交實(shí)驗(yàn)

3.3.7.1 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)，選出影響提取的幾個(gè)條件：提取溫度、提取酸度、提取時(shí)間，按照正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。按照表 5操作后進(jìn)行提取并測量酶活，根據(jù)正交試驗(yàn)找出最佳提取條件。

由結(jié)果可知：（1）影響提取的最主要因素為時(shí)間，其后是提取酸度，影響最小的是提取溫度。（2）最佳提取條件是：提取時(shí)間1 h，提取溫度為40℃，提取酸度pH 6.5。

4 結(jié)論

本文主要討論了提取時(shí)間、溫度、pH、還原劑、表面活性劑等因素對甘薯中酶的提取率的影響，并通過正交實(shí)驗(yàn)確定了最佳提取方案。研究表明，時(shí)間對提取率的影響最為明顯，同時(shí)，加入一定量的還原劑和表面活性劑對于提高甘薯中β-淀粉酶的提取量可以起到一定的幫助。實(shí)驗(yàn)表明，無水Na2SO3 能提高約14%的產(chǎn)量，NaHSO3能使酶的提取率提高10%，Na2S2O5能使酶的提取率18%，Triton-100對酶提取量有較明顯的促進(jìn)效果，而Tween 80對提取效果影響不大。

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G322

B

1007-6344（2017）02-0304-01

據(jù)研究表明，水溶劑法從甘薯中提取β淀粉酶可以應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)。