陳思

（貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550023）

乳品中細(xì)菌含量的自動(dòng)識(shí)別與檢測(cè)方法研究

陳思

（貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550023）

乳品發(fā)生細(xì)菌污染可產(chǎn)生嚴(yán)重后果，威脅消費(fèi)者健康。為提高乳品中細(xì)菌的檢測(cè)精度，減少檢測(cè)誤差，我們開(kāi)發(fā)一種自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)方法。該方法采用圖像采集識(shí)別技術(shù)與快速基因檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)識(shí)別乳品細(xì)菌總數(shù)、活菌數(shù)和細(xì)菌種類的目的，與經(jīng)典的檢測(cè)方法相比符合率達(dá)到99%以上，具有實(shí)時(shí)、快速、便捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，適合推廣使用。

乳品；細(xì)菌污染；活菌數(shù)；細(xì)菌種類

乳品一直在人類食品中占有重要地位，其安全性對(duì)當(dāng)今我國(guó)的食品安全問(wèn)題具有顯著影響，一直是政府和媒體關(guān)注的重點(diǎn)[1]。在眾多危害乳制品質(zhì)量的因素中，由于細(xì)菌污染導(dǎo)致的乳制品品質(zhì)下降甚至產(chǎn)生毒性是主要的危害因素。受到細(xì)菌污染的乳品不僅僅對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生危害，同時(shí)影響我國(guó)的乳制品行業(yè)和整個(gè)食品行業(yè)的聲譽(yù)，甚至對(duì)我國(guó)的國(guó)家形象也會(huì)產(chǎn)生不良影響[2]。因此，采用科學(xué)的手段對(duì)乳品中污染細(xì)菌含量進(jìn)行檢測(cè)，具有較大的市場(chǎng)需求。傳統(tǒng)的微生物含量檢測(cè)方式是主要包括：光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)法、電子儀器計(jì)數(shù)法、吸光度換算法、平板計(jì)數(shù)法、濾膜計(jì)數(shù)法、熒光或同位素染色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法等，這些經(jīng)典的方法均存在一些缺點(diǎn)，比如：計(jì)數(shù)染料存在污染性，難以清除；濾膜法可以篩選出多種菌落，但無(wú)法精確計(jì)數(shù)；光學(xué)顯微鏡和電子儀器計(jì)數(shù)無(wú)法區(qū)分細(xì)胞的存活狀態(tài)；平板計(jì)數(shù)法所需的檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響乳品的生產(chǎn)[3-5]。為了解決現(xiàn)存問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一套乳品中微生物含量自動(dòng)檢測(cè)識(shí)別的技術(shù)，該技術(shù)具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確和快速的特點(diǎn)，可以準(zhǔn)確對(duì)乳品中的微生物含量進(jìn)行定量，同時(shí)可以對(duì)微生物的種類進(jìn)行識(shí)別。

1自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)的組成

1.1乳品中細(xì)菌含量的自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)技術(shù)的總體構(gòu)成

完整的自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)系統(tǒng)由4個(gè)主要部分組成，分別為樣品前處理系統(tǒng)、圖像采集與識(shí)別系統(tǒng)、快速基因檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件。樣品前處理系統(tǒng)可以根據(jù)乳品濃度，按比例將PMT和乳品樣本進(jìn)行充分混勻，并進(jìn)行光照激活處理，做好檢測(cè)前的準(zhǔn)備工作。處理好得樣品需要通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器將10μL樣品滴入檢測(cè)臺(tái)，準(zhǔn)備開(kāi)始圖像采集和識(shí)別工作。圖像采集與識(shí)別系統(tǒng)和快速基因檢測(cè)系統(tǒng)是核心部分，通過(guò)顯微鏡對(duì)乳品樣本中的菌體進(jìn)行自動(dòng)觀察和拍照，連續(xù)記錄3個(gè)視野后識(shí)別出菌落和菌團(tuán)后進(jìn)行分別計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)，得到10μL乳品中的細(xì)菌種類和數(shù)量。為了進(jìn)一步得到乳品中活菌的數(shù)量，我們?cè)诘谌糠衷O(shè)置快速基因檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)PMT-qPCR的方法對(duì)乳品樣本中的活菌數(shù)目進(jìn)行精確檢測(cè)。至此，我們完成完整的檢測(cè)工作，最后將得到的數(shù)據(jù)通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，得到最終結(jié)果。完整的自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)系統(tǒng)流程圖如1所示，各部分系統(tǒng)詳細(xì)功能描述如下：

圖1 乳品中細(xì)菌自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)方法的構(gòu)成Fig.1 Thestructureof thebacteria autom atic identification detectionmethod in dairy products

1.2樣本處理系統(tǒng)

無(wú)論是巴氏奶還是發(fā)酵乳，均存在脂肪濃度過(guò)高影響檢測(cè)的現(xiàn)象，樣品前處理系統(tǒng)的第一步通過(guò)高速離心（10 000 g，10min）的方法使乳品分層，去除干擾物質(zhì)錄。隨后通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器，將20μgPMT注入1mL乳品樣本中，經(jīng)過(guò)低速混勻后，采用650W鎢絲燈照射15min，達(dá)到樣本的完全制備，準(zhǔn)備進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3顯微鏡自動(dòng)檢測(cè)識(shí)別系統(tǒng)

經(jīng)過(guò)處理的樣品首先經(jīng)過(guò)顯微鏡自動(dòng)檢測(cè)識(shí)別系統(tǒng)檢測(cè)，自動(dòng)對(duì)3個(gè)視野下的所有物質(zhì)進(jìn)行圖像分析。在圖像采集階段，軟件內(nèi)置判斷模塊，對(duì)拍攝圖片的清洗度和分辨率進(jìn)行比較，符合要求的圖片進(jìn)行下一環(huán)節(jié)，不符合要的圖片需要重新拍照。通過(guò)軟件對(duì)拍攝圖片上的細(xì)菌進(jìn)行識(shí)別和計(jì)算。該技術(shù)主要利用圖像處理軟件，在計(jì)算機(jī)上對(duì)照片事業(yè)上的細(xì)菌進(jìn)行逐個(gè)識(shí)別，識(shí)別方法主要包括：預(yù)處理（圖像對(duì)比增強(qiáng)）、對(duì)疑似細(xì)菌顆粒進(jìn)行特征提取、采用最佳算法進(jìn)行快速計(jì)算和對(duì)所有的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)分類標(biāo)號(hào)。具體的細(xì)菌識(shí)別方案如下：采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)中開(kāi)運(yùn)算的方法區(qū)分細(xì)菌間存在的粘附情況，采用十字結(jié)構(gòu)4領(lǐng)域元素對(duì)細(xì)胞圖像D（f，k）的原二值化進(jìn)行膨脹和腐敗處理，要求目標(biāo)圖像E（f，k）的初始數(shù)值為225，即為白色。分別對(duì)D（f，k）和E（f，k）的像素點(diǎn)進(jìn)行逐個(gè)腐蝕計(jì)算，計(jì)算結(jié)束后，重新掃描每個(gè)像素點(diǎn)，再逐個(gè)進(jìn)行膨脹運(yùn)算，最后輸出D（f，k）經(jīng)過(guò)腐蝕覆蓋后的圖像，即為去除細(xì)菌間粘連的圖像。經(jīng)過(guò)該方案處理過(guò)的圖像，細(xì)菌間的界面更平滑，菌團(tuán)的纖細(xì)連接點(diǎn)分離，增大細(xì)菌間的間隙，而正常的未發(fā)生粘連的細(xì)菌不發(fā)生任何改變。在圖像采集與識(shí)別系統(tǒng)中，微生物圖像數(shù)據(jù)庫(kù)是重要的組成部分，它根據(jù)當(dāng)今報(bào)道的乳品微生物形態(tài)特征構(gòu)建，利用網(wǎng)絡(luò)資源可以做到實(shí)時(shí)更新，通知利用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法增大檢索速度。目前對(duì)10個(gè)視野下的細(xì)菌進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)，得到數(shù)值后再根據(jù)細(xì)菌類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4快速基因檢測(cè)系統(tǒng)

快速基因檢測(cè)系統(tǒng)是以PMA-qPCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法，其中PMA是一種可以在藍(lán)光作用下與雙鏈DNA結(jié)合的染料。PMA具有疊氮基團(tuán)可以被藍(lán)光激活產(chǎn)生氮烯自由基，該自由基具有高活性特點(diǎn)可立即與核酸形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，將PMA穩(wěn)固的粘附在DNA上，抑制擴(kuò)增反應(yīng)，導(dǎo)致該DNA無(wú)法進(jìn)行qPCR檢測(cè)。PMA具有一個(gè)顯著的生物學(xué)特點(diǎn)，其不能通過(guò)活菌細(xì)胞膜而無(wú)法與其基因組結(jié)合，只能通過(guò)死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜與死菌基因組結(jié)合，這一功能被廣泛應(yīng)用在活菌數(shù)量檢測(cè)試驗(yàn)。在本試驗(yàn)中，我們利用PMA這一特性，在細(xì)菌基因組提取前先使用PMA溶液處理細(xì)菌，充分抑制死亡細(xì)菌基因組，保證qPCR的模板來(lái)自于活菌。在PMT處理后，采用商品化細(xì)菌基因組提取試劑盒進(jìn)行基因組提取，提取步驟嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，隨后立即進(jìn)行qPCR檢測(cè)，檢測(cè)使用的通用引物為16S-14f：CCGTACATAGCAGGGCCCAG；16S-15r：GAT CTAGTGATTCGACTAGCAGCCG。共擴(kuò)增長(zhǎng)度為289bp。該引物覆蓋常見(jiàn)乳品污染細(xì)菌35種，具有廣泛的通用性。PCR反應(yīng)體系如下，反應(yīng)條件：95℃8min，38個(gè)循環(huán)（95℃30 s，55℃45 s，72℃30 s）。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行檢測(cè)孔，試驗(yàn)接受后取3孔的平均Ct值，并經(jīng)過(guò)我們反復(fù)測(cè)定，證實(shí)該方法檢測(cè)Ct值在26.60～29.25間，乳品中每1mL含菌量小于1.25×105CFU/mL。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)

我們以SPSS18.0為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)一套數(shù)據(jù)自動(dòng)轉(zhuǎn)換軟件，該軟件可以根據(jù)Ct值直接進(jìn)行活菌數(shù)換算，簡(jiǎn)單快捷，準(zhǔn)確性高。

1.6實(shí)際樣本檢測(cè)分析

2015年8月～12月，我們從吉林省某乳業(yè)采集收細(xì)菌污染的乳品樣品共20份。在進(jìn)行試驗(yàn)前均進(jìn)行人工顯微鏡計(jì)數(shù)、平板計(jì)數(shù)、細(xì)菌形態(tài)學(xué)和微生物自動(dòng)分析儀鑒定，完成后采用我們的自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均采用spss18.0，計(jì)量資料進(jìn)行采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用Χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

2.1實(shí)際樣品細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)

我們采用經(jīng)典的平板計(jì)數(shù)法計(jì)算乳品樣品中的細(xì)菌數(shù)量作為對(duì)比，但需要注意的是平板計(jì)數(shù)法僅可以檢測(cè)活菌數(shù)，細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)Table1 The totalnumber of bacteria detection

如表1所示，我們建立的方法檢測(cè)的細(xì)菌總數(shù)與經(jīng)典鏡檢計(jì)數(shù)符合率達(dá)到95%以上，活菌總數(shù)與平板計(jì)數(shù)結(jié)果符合率達(dá)到100%，具有準(zhǔn)確性優(yōu)勢(shì)，同時(shí)所需而時(shí)間僅為平板計(jì)數(shù)的1/5，因此具有時(shí)效性優(yōu)勢(shì)。

2.2實(shí)際樣品細(xì)菌種類檢測(cè)

我們采用人工顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察和微生物鑒定儀作為對(duì)照，比較我們建立的檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。樣品細(xì)菌種類檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 樣品細(xì)菌種類檢測(cè)Table2 Bacterialspecies test sam ple

續(xù)表2樣品細(xì)菌種類檢測(cè)Continue table2 Bacterialspecies test sample

由表2可知，我們建立的檢測(cè)方法對(duì)乳品中細(xì)菌種類識(shí)別的數(shù)量明顯高于人工顯微鏡觀察（P＜0.05），與微生物鑒定儀的符合度達(dá)到99%以上。

3討論

乳制品具有易消化和營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)點(diǎn)，其中富含蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、維生素、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種制備簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的優(yōu)質(zhì)食品，受到廣大消費(fèi)者喜歡[6]。由于營(yíng)養(yǎng)豐富，乳品也容易受到細(xì)菌污染，細(xì)菌繁殖過(guò)程中大量消耗乳品營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物，影響乳品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)消費(fèi)者食用后可能產(chǎn)生嚴(yán)重中毒現(xiàn)象[7-8]。因此實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)乳品的細(xì)菌污染現(xiàn)象，對(duì)提高我國(guó)乳品形象，維護(hù)乳品行業(yè)的信譽(yù)，保護(hù)消費(fèi)者健康具有積極影響。在本研究中我們提出一種乳品污染細(xì)菌的自動(dòng)識(shí)別檢測(cè)方法，通過(guò)分析捕捉到的圖像資料，依據(jù)建立的細(xì)菌形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，采用數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)的方法可以快速進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和種類鑒定。同時(shí)為了進(jìn)一步判斷乳品污染的活菌數(shù)，我們提出一種PMT-qPCR的檢測(cè)方法，可以在3 h內(nèi)對(duì)乳品中的活菌數(shù)進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。與傳統(tǒng)的方法相比，我們的方法具有實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、快速的優(yōu)勢(shì)，大幅度縮短試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)所需的儀器要求不高，大部分試驗(yàn)室均有可以立即使用。在將來(lái)的研究中，我們將以此方法為基礎(chǔ)，開(kāi)發(fā)一套具備自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)檢測(cè)和自動(dòng)讀值的檢測(cè)設(shè)備，為維護(hù)我國(guó)乳品品質(zhì)，維持食品安全，盡一份力。

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Research on Bacteria Autom atic Identification and Detection M ethod in Dairy Products

CHENSi
（Guiyang Vocationaland TechnicalCollege，Guiyang 550023，Guizhou，China）

Dairy bacteria pollution could caused seriousconsequences，threatened the consumershealth.To improve the accuracy ofbacteria detection in dairy products，and reduced detection error，an automatic identification detectionmethodwere developed.Themethod uses image acquisition and recognition technology combinedwith rapid gene detection technology to realize the purposeofautomatically identifying the totalnumberof bacteria，number ofviable bacteria and bacteria species.Compared with the classical detectionmethod，the co incidencerateismorethan99%，andhad fast，convenient，economicadvantages，suitable forpromotionanduse.

dairyproduct；bacterialcontamination；viablecount；bacterialspecies

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.040

2016-10-20

陳思（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：生物技術(shù)。