陳冠林，劉學(xué)文，韓門娣，駱春霞，陳松根，*

（1.佛山市職業(yè)病防治所，廣東佛山528000；2.廣東省生物工程研究所，廣東廣州510316）

分心木多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

陳冠林1，劉學(xué)文2，韓門娣1，駱春霞1，陳松根1，*

（1.佛山市職業(yè)病防治所，廣東佛山528000；2.廣東省生物工程研究所，廣東廣州510316）

以分心木為材料，輔助超聲波技術(shù)提取多酚研究，結(jié)合單因素和正交試驗(yàn)，確定多酚提取的最佳工藝組合為料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。用FRAP、DPPH和ABTS3種方法測(cè)定了分心木多酚的抗氧化能力并用Folin-Ciocalteu法測(cè)定其總酚含量。結(jié)果表明分心木多酚在抗氧化能力和總酚含量方面是很好的抗氧化劑來(lái)源。

分心木；多酚；抗氧化性

分心木（Diaphragma juglandis Fructus），別名胡桃衣、胡桃?jiàn)A、胡桃隔、核桃芯，為胡桃科胡桃屬植物胡桃（Juglans regia L.）。中醫(yī)認(rèn)為，本品性味苦、澀、平，入脾、腎經(jīng)，有健脾固腎、利尿清熱，治淋病尿血、暑熱瀉痢等功效，適用于治療遺溺、崩中下血、耳聾、治遺精、尿頻、帶下等[1]。我國(guó)的核桃資源非常豐富，2010年我國(guó)核桃年產(chǎn)量為128萬(wàn)t，面積和產(chǎn)量均為世界第一[2]，分心木的產(chǎn)量也極其豐富。長(zhǎng)期以來(lái)，我們只關(guān)注核桃仁的開(kāi)發(fā)和利用，而對(duì)分心木的關(guān)注甚少，雖然一些學(xué)者對(duì)分心木進(jìn)行了相關(guān)的研究[1，3-6]，但對(duì)分心木多酚提取條件的優(yōu)化研究較少，而對(duì)分心木多酚的抗氧化性也缺少系統(tǒng)的研究，為了充分利用分心木資源以及減少能源、溶劑等生產(chǎn)成本的消耗，本文對(duì)分心木多酚提取條件進(jìn)行優(yōu)化，采用超高效液相（UPLC）測(cè)定其成分含量，并系統(tǒng)地研究其抗氧化活性，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

分心木：購(gòu)于廣東省佛山市某市場(chǎng)。分心木干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩，超聲波輔助乙醇浸提備用。

1.1.2試驗(yàn)試劑

乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；乙醇（色譜純）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素E）、ABTS（2，2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，2，2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）、福林-酚試劑（Folin-Ciocalteu reagent）：購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；TPTZ（2，4，6-tris-2，4，6-tripiridyl-2-triazine，三吡啶三吖嗪）、DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）：購(gòu)自阿拉丁公司；FeCl3、HCl、乙酸鈉、過(guò)硫酸鉀、沒(méi)食子酸、乙醇，均為分析純，由天津化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2儀器與設(shè)備

UV-9600紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京瑞利分析儀器有限公司；LEO-150S超聲清洗儀：昆山力波超聲波設(shè)備有限公司；ACQUITY UPLCH-CLASS超高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；HD-100高速多功能粉碎機(jī)：諸暨市海道機(jī)械有限公司；SY2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1單因素試驗(yàn)

依據(jù)溶劑浸提理論，確定影響提取條件的主要因素有乙醇濃度、料液比、提取溫度以及提取時(shí)間，通過(guò)測(cè)定提取液中的分心木多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)確定各因素的最佳提取條件。

1.3.2正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，針對(duì)各因素的影響規(guī)律，利用四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，對(duì)影響多酚提取效果的各因素進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.3總酚含量的測(cè)定

取0.10mL待測(cè)樣品，加入2.50mLFolin-Ciocalteu試劑中，反應(yīng)4min后，加入2.00mL 75 g/L的Na2CO3溶液，置室溫下反應(yīng)120min，于760 nm下測(cè)定吸光度。結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位為mgGAE/g[7-8]。

1.3.4 UPLC色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLCHSST3（50mm×2.1mm，1.8μm）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL；流速：0.3mL/min；流動(dòng)相：乙腈-甲酸水溶液（0.2%甲酸），梯度洗脫（洗脫程序：0min，7%乙腈；4min，16%乙腈；6min，40%乙腈；7min，7%乙腈；10min，7%乙腈）[9]，結(jié)果以μg/g DW（dryweight）表示。

1.3.5 FRAP法測(cè)定抗氧化活性

FRAP試劑由10mmol/L的TPTZ（溶于40mmol/L鹽酸）、20mmol/L的三氯化鐵、300mmol/L的乙酸鈉緩沖液（pH3.6）以1∶1∶10（體積比）的比例混合而成。取100μL待測(cè)樣品，加入3mLFRAP溶液中充分混合，反應(yīng)120min后于593 nm處測(cè)定吸光度。以Trolox溶液為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化活性用μmol Trolox/g表示[10-11]。

1.3.6 DPPH法測(cè)定抗氧化活性

取0.1mL待測(cè)樣品，加入0.06mmol/LDPPH 80%乙醇溶液3.9mL，振蕩15 s，放置暗處反應(yīng)2 h后，于515 nm處測(cè)定吸光度，按以下公式計(jì)算清除率：

以3.9mLDPPH+0.1mL 80%乙醇作對(duì)照，空白為80%乙醇，以Trolox溶液為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當(dāng)量表示，單位為μmolTrolox/g[12]。

1.3.7 ABTS法測(cè)定抗氧化能力

將7mmol/L的ABTS（用pH為4.5、20mmol/L的乙酸鈉配制）和2.45mmol/L的過(guò)硫酸鉀等體積混合，室溫下避光反應(yīng)12 h～16 h，形成ABTS+·儲(chǔ)備液。使用前用20mmol/L乙酸鈉（pH4.5）將ABTS+·儲(chǔ)備液稀釋成為工作液，使其在734 nm處吸光度為0.700±0.005。取100μL待測(cè)樣品，加入3mLABTS+·工作液，室溫下反應(yīng)2 h后，在734 nm處測(cè)定吸光度。以20mmol/L乙酸鈉（pH4.5）為空白，ABTS+·為對(duì)照，以Trolox溶液為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品的抗氧化樣品的抗氧化活性用TEAC（trolox equivalentantioxidant capacity）表示[10]，單位為μmol Trolox/g。

2結(jié)果與分析

2.1料液比

料液比對(duì)分心木多酚提取效率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)分心木多酚提取效率的影響Fig.1 Effectof the ratio ofmaterial to extraction solventon extraction of phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

由圖1可知，隨著溶劑用量的增加，分心木多酚的提取含量有所增加，但溶劑用量達(dá)到一定程度時(shí)，再增加溶劑用量不僅不能增加提取量，反而會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此確定料液比為1∶30（g/mL）。

2.2乙醇濃度

不同濃度的乙醇對(duì)分心木多酚提取效率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度的乙醇對(duì)分心木多酚提取效率的影響Fig.2 Effectof ethanolconcentration on extraction rateof phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，提取含量增加，乙醇濃度在40%時(shí)提取效率最高，當(dāng)乙醇濃度再增加時(shí)提取效率降低，乙醇量的增大也會(huì)增加生產(chǎn)成本。因此確定乙醇濃度為40%。

2.3提取時(shí)間

提取時(shí)間對(duì)分心木多酚提取效率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)分心木多酚提取效率的影響Fig.3 Effectof extraction tim eon extraction rateof phenolic contentsobtained from Diaphragma juglandis Fructus

從圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)提取效率有所增加，但10min后提取效率反而下降，提取時(shí)間過(guò)短則提取不完全，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則耗時(shí)。因此確定10min為最佳的提取時(shí)間。

2.4提取溫度

提取溫度對(duì)分心木多酚提取效率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)分心木多酚提取效率的影響Fig.4 Effectof temperatureon extraction rateof phenolic contents obtained from Diaphragma juglandis Fructus

從圖4可以看出，隨著溫度的升高提取效率有所增加，但45℃后提取效率反而下降，提取溫度過(guò)低則提取不完全，提取溫度過(guò)高則耗能。因此確定45℃為最佳的提取溫度。

2.5分心木多酚提取的正交試驗(yàn)分析

利用分心木多酚水解過(guò)程的單因素結(jié)果，確定料液比、乙醇濃度、超聲時(shí)間和提取溫度為4個(gè)主要的影響因素，并選定每個(gè)因素最佳范圍的3個(gè)水平（表1），然后設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab le1 Factorsand levels in theorthogonalarray design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonalarray designm atrix and experimental results

從表2可知，影響分心木中多酚物質(zhì)提取效果的因素排列順序?yàn)椋篈＞D＞C＞B，即料液比＞提取溫度＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度，說(shuō)明料液比對(duì)多酚的提取效果影響最大，其次是提取溫度，再次是超聲時(shí)間，而乙醇濃度對(duì)多酚的提取效果影響最小。4個(gè)因素的最佳組合方案時(shí)A3B1C3D3，即料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得，在該條件下從1 g分心木中可提取得多酚物質(zhì)為56.46mgGAE。

2.6 UPLC分析結(jié)果

分心木多酚是分心木中含有多個(gè)苯環(huán)并且結(jié)合多個(gè)羥基的化學(xué)物質(zhì)的總稱，主要包括酚酸類和黃酮類兩大部分，其色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 對(duì)照品（A）和分心木（B）的高效液相色譜圖Fig.5 UPLC chromatogram of standard（A）and Diaphragma juglandis Fructus（B）

由UPLC法測(cè)得的每克分心木中多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 分心木多酚含量Table3 M ain phenolic com poundsand their contentsof Diaphragma juglandis Fructus

由表3可知，在現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)中，分心木中蘆丁的含量最高，其含量為1 168.78μg/g DW；其次是異鼠李素，其含量為713.85μg/g DW；丁香酸和對(duì)香豆酸的含量較低，分別為124.63、124.77μg/g DW。研究發(fā)現(xiàn)，純的酚酸和黃酮類化合物可以抑制銅誘導(dǎo)的低密度脂蛋白膽固醇的氧化，在眾多的羥基酸中，咖啡酸對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制效果最好而對(duì)香豆酸和阿魏酸的抑制效果較差[13-16]。然而，其他的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸，沒(méi)食子酸，咖啡酸，兒茶素，表兒茶素等對(duì)低密度脂蛋白膽固醇的氧化有很好的抑制作用[13，16-17]，且混合酚類對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用更好[18]。酚類化合物對(duì)低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用可能是酚類對(duì)自由基的清除或者與金屬離子螯合有關(guān)[19]。對(duì)除此以外，兒茶素和表兒茶素對(duì)N-二硝基亞硝胺和N-亞硝基哌啶誘導(dǎo)DNA損傷的肝癌細(xì)胞有保護(hù)作用[20]。

2.7抗氧化活性試驗(yàn)

清除活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的研究中，DPPH，F(xiàn)RAP以及ABTS法是研究提取物抗氧化能力常用的方法。因此，本文采用FRAP、DPPH和ABTS法測(cè)定核桃殼多酚的抗氧化性，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 多酚物質(zhì)的抗氧化活性研究Fig.6 Antioxidant capacitiesof phenolic contents

由圖6可知，F(xiàn)RAP、DPPH和ABTS法測(cè)得核桃殼多酚的抗氧化性分別為214.62、248.86和260.98μmol Trolox/g，表明分心木多酚的FRAP、DPPH·和ABTS+·抗氧化活性都比較強(qiáng)。Chen[21]等對(duì)33中水果抗氧化能力進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三華李的抗氧化能力最強(qiáng)，其對(duì)Fe3+還原能力為15.57μmol Trolox/g，對(duì)ABTS+·的清除能力為12.61μmol Trolox/g，但低于分心木多酚的抗氧化能力。與水果[22]、野生花[23]、蔬菜[24]以及谷類[25]等抗氧化能力相比較，分析木多酚的抗氧化能力均高于上述物質(zhì)，但其抗氧化活性低于芍藥花以及桂花[9]。在對(duì)ABTS+·的清除能力研究中，分心木多酚的抗氧化活性低于龍眼核[26]、瞿麥等[27]中藥。研究發(fā)現(xiàn)，總酚含量與其抗氧化能力相關(guān)，總酚含量高，則其抗氧化能力強(qiáng)，酚類對(duì)預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病有重要的作用[9]。原兒茶酸與ABTS以及DPPH的相關(guān)性較強(qiáng)；對(duì)香豆酸與ABTS以及FRAP的相關(guān)性較強(qiáng)；咖啡酸與FRAP的相關(guān)性較強(qiáng)；兒茶素與ABTS、DPPH以及FRAP的相關(guān)性較強(qiáng)；表兒茶素則與FRAP的相關(guān)性較強(qiáng)；槲皮素與ABTS、DPPH以及FRAP的相關(guān)性較強(qiáng)[9]。

3結(jié)論

通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)得出了分心木多酚提取的優(yōu)化工藝條件為：料液比1∶40（g/mL），乙醇濃度30%，超聲15min，提取溫度為50℃。通過(guò)FRAP、DPPH以及ABTS 3種抗氧化活性方法測(cè)定分心木多酚的抗氧化能力，結(jié)果顯示分心木多酚是很好的抗氧化劑來(lái)源。

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Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Phenolic Contents in Diaphragma juglandis Fructus

CHENGuan-lin1，LIUXue-wen2，HANMen-di1，LUOChun-xia1，CHEN Song-gen1，*
（1.Foshan Institute ofOccupationalDisease Prevention and Control，F(xiàn)oshan 528000，Guangdong，China；2.Guangdong Provincial Bioengineering Institute，Gaungzhou 510316，Guangdong，China）

This paper reported the use of single-factor and orthogonalarray designmethods to optimize the integrated ultrasonicassisted extraction ofphenolic contents in Diaphragma juglandis Fructus.The optimal technological conditions for extracting phenolic contents in Diaphragma juglandis Fructuswere as follows：the ratio of material to solventwas1∶40（g/mL），ethanol concentrationwas30%，extraction timewas15min，and extraction temperaturewas50℃.FRAP，DPPH and ABTSmethodswere used to determine the antioxidantactivities of phenolic contents in Semen juglandis，and Folin-Ciocaheumethod was used to determine the total phenolic contents.Results indicated that phenolic contents in Diaphragma juglandis Fructuswere significant sources of antioxidants in termsof theirantioxidantactivitiesand totalphenolic contents．

Diaphragma juglandis Fructus；totalphenolic contents；antioxidantactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.015

2016-06-12

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（A2015617）

陳冠林（1984—），男（漢），醫(yī)師，碩士，研究方向：職業(yè)衛(wèi)生、營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生。

*通信作者：陳松根（1965—），男，主任醫(yī)師。