鄭曉麗，陳芳，張小喬，劉伯毅

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院綜合醫(yī)療科，湖北 十堰 442000)

Toll樣受體4在膿毒癥大鼠心肌中的表達(dá)

鄭曉麗，陳芳，張小喬，劉伯毅

(十堰市太和醫(yī)院湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院綜合醫(yī)療科，湖北 十堰 442000)

目的 觀察Toll樣受體4(TLR4)在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達(dá)，探討其在膿毒癥心肌損傷發(fā)生機(jī)制中的作用。方法將40只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組，n=20)及膿毒癥組(CLP組，n=20)，采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒癥動(dòng)物模型，24 h后，檢測(cè)各組的血清腦鈉肽(BNP)、肌鈣蛋白I(cTnI)的水平，觀察心肌組織病理變化及心肌組織腫瘤壞死因子(TNF-α)和TLR4的表達(dá)水平。結(jié)果CLP組大鼠出現(xiàn)明顯的心肌損傷(心肌水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、紊亂)，CLP組大鼠血清BNP和cTnI水平分別為(5.33±0.26)ng/mL、(3.89±0.13)ng/mL，均高于SH組的(1.05±0.19)ng/mL和(0.87±0.07)ng/mL，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；CLP組大鼠心肌組織的TNF-α和TLR4表達(dá)水平分別為(23.71±1.59)ng/mL、(38.03±5.02)，均高于SH組的(8.99±0.52)ng/mL和(11.32±2.51)，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論TLR4在膿毒癥大鼠心肌組織中表達(dá)上調(diào)，TLR4可能在膿毒癥心肌損傷發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

Wistar大鼠；膿毒癥；心肌損傷；Toll樣受體4

膿毒癥是臨床上非常難處理的棘手問題，多器官功能障礙是膿毒癥高死亡率的主要原因，心肌損傷是膿毒癥嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)生率可達(dá)40%～50%，直接影響膿毒癥患者預(yù)后[1]。膿毒癥心肌損傷發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，部分原因及機(jī)制仍不明，進(jìn)一步探明其發(fā)生機(jī)制對(duì)膿毒癥診斷、預(yù)防及治療上具有重要的意義。Toll樣受體4(toll like receptor 4，TLR4)是Toll樣受體(toll like receptors，TLRs)家族中的一種，在膿毒癥及心血管疾病方面已有部分研究[2-3]，本研究旨在通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討TLR4在膿毒癥心肌損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)在湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑均由該中心提供。健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量220～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組(SH組，n=20)及膿毒癥組(CLP組，n=20)。

1.2 模型制作 采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)制備膿毒癥動(dòng)物模型，大鼠禁食12 h，禁水2 h，用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，消毒、鋪巾，在腹部正中作切口，暴露并游離出盲腸，CLP組：在距盲腸末端用4#絲線結(jié)扎，并用18#針頭于盲腸游離末端穿孔，將盲腸放回腹腔原位，關(guān)腹。SH組：不結(jié)扎、不穿孔盲腸，將盲腸放回腹腔原位，關(guān)腹。術(shù)后進(jìn)食自由，24 h后抽取股靜脈血2 mL，處死大鼠。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清血清腦鈉肽(BNP)、肌鈣蛋白I(cTnI)測(cè)定 將靜脈血分離血清，采用ELISA方法，按試劑盒說明測(cè)定BNP、cTnI。

1.3.2 病理學(xué)檢查 切取左心室兩塊心肌組織，取一塊心肌組織用2.5%戊二醛溶液固定12 h，HE及Masson染色，制備心肌組織切片，在顯微鏡下觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.3.3 心肌組織TNF-α及TLR4測(cè)定 另一塊心肌組織加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用-70℃液氮冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后將勻漿保持在2℃～8℃的溫度，3 000 r/min離心20 min。收集上清液待檢。采用ELISA法測(cè)定TNF-α、雙抗體夾心ELISA法測(cè)定心肌組織TLR4蛋白表達(dá)，按照試劑盒操作步驟操作，在400倍光鏡下對(duì)每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，采用MIAS-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行TLR4蛋白半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血清BNP和cTnI水平比較 CLP組大鼠血清BNP、cTnI水平顯著升高，與SH組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 兩組大鼠血清BNP和cTnI水平比較（ng/mL，±s）

表1 兩組大鼠血清BNP和cTnI水平比較（ng/mL，±s）

組別SH組CLP組t值P值例數(shù)20 20 BNP 1.05±0.19 5.33±0.26 6.256＜0.01 cTnI 0.87±0.07 3.89±0.13 4.398＜0.01

2.2 兩組大鼠病理學(xué)檢查結(jié)果比較 HE染色：SH組心肌未見明顯異常(圖1)，CLP組可見心肌水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、紊亂(圖2)。masson染色：SH組心肌未見明顯異常(圖3)，CLP組可見心肌細(xì)胞肥大、水腫及壞死，心肌細(xì)胞排列紊亂(圖4)。

圖1 SH組HS染色病理學(xué)改變(×400)；圖2 CLP組HS染色病理學(xué)改變(×400)；圖3 SH組masson染色病理學(xué)改變(×400);圖4 CLP組masson染色病理學(xué)改變(×400)

2.3 兩組大鼠心肌組織TNF-α及TLR4表達(dá)比較 免疫熒光染色后(棕黃色胞漿為陽(yáng)性細(xì)胞)，心肌組織TNF-α表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量：SH組數(shù)量較少(圖5)，而CLP組數(shù)量顯著增多(圖6)。心肌組織TLR4表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量：SH組數(shù)量較少(圖7)，而CLP組數(shù)量顯著增多(圖8)。蛋白定量分析結(jié)果顯示，心肌組織CLP組大鼠的TNF-α及TLR4表述水平較SH組顯著，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

圖5 SH組心肌組織TNF-α表達(dá)(×400)；圖6 CLP組心肌組織TNF-α表達(dá)(×400)；圖7 SH組心肌組織TLR4表達(dá)(×400)；圖8 CLP組心肌組織TLR4表達(dá)(×400)

表2 兩組大鼠心肌組織TNF-α及TLR4表達(dá)水平比較(±s)

表2 兩組大鼠心肌組織TNF-α及TLR4表達(dá)水平比較(±s)

組別SH組CLP組t值P值例數(shù)20 20 TNF-α(ng/mL) 8.99±0.52 23.71±1.59 7.521＜0.01 TLR4 11.32±2.51 38.03±5.02 8.138＜0.01

3 討 論

膿毒癥是宿主對(duì)感染的特異性反應(yīng)導(dǎo)致的威脅生命的器官功能障礙[4]，心肌損傷即是其表現(xiàn)之一，發(fā)生率很高，進(jìn)展迅速，直接影響膿毒癥患者臨床預(yù)后。膿毒癥心肌損傷的主要表現(xiàn)為：心臟收縮和舒張功能損害，以心臟擴(kuò)大、左室射血分?jǐn)?shù)下降為主要特征[5]。BNP和CTnI是臨床常用的評(píng)估心功能不全及心肌損傷的標(biāo)志物，在膿毒癥患者中，其水平明顯升高，被證實(shí)是可評(píng)估膿毒癥患者心肌損傷的標(biāo)志[6]。膿毒癥心肌損傷在光鏡下表現(xiàn)為心肌纖維斷裂現(xiàn)、肌膜細(xì)胞增生、心肌細(xì)胞空泡變性等[7]。

本研究通過CLP法制作膿毒癥模型，結(jié)果顯示大鼠CLP組大鼠血清BNP、cTnI水平顯著升高(P＜0.01)，病理學(xué)檢查HE染色及Masson染色均提示心肌損傷表現(xiàn)。同時(shí)，心肌組織TNF-α表達(dá)也明顯升高(P＜0.01)，提示心肌局部炎癥反應(yīng)的存在。而SH組相應(yīng)指標(biāo)正常，結(jié)果表明膿毒癥心肌損傷模型制作成功。

引起心肌損傷的機(jī)制復(fù)雜，且尚未完全明確，目前認(rèn)為可能的機(jī)制包括[8-9]：(1)細(xì)菌毒素、細(xì)胞因子作用；(2)線粒體功能障礙；(3)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載；(4)心肌細(xì)胞凋亡；(5)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活等。本研究發(fā)現(xiàn)：CLP組大鼠心肌組織TLR4表達(dá)顯著高于SH組(P＜0.01)。提示心肌TLR4表達(dá)升高在膿毒癥心肌損傷發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。

TLR4在人體內(nèi)分布廣泛，主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上，主要分布在外周血白細(xì)胞和淋巴組織的中，在心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有分布[10]，TLR4在心血管方面的作用包括：動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷、心力衰竭等[3]。

在膿毒癥心肌損傷方面，TLR4的主要作用機(jī)制可能是：(1)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路激活NF-κB，導(dǎo)致TNF-α、IL-1炎癥介質(zhì)增加，發(fā)生SIRS，最終導(dǎo)致膿毒癥及MODS[11]。TNF-α等炎癥介質(zhì)可通過直接損傷心肌纖維、降低β-腎上腺素能受體敏感性、降低鈣離子敏感度、促使氧自由基生成及誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡參與心室重塑等作用而導(dǎo)致心肌損傷[12-13]；(2)TLR4能通過作用于凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax、p53、Fas/FasL等促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌的損傷[14]。

本研究表明，膿毒癥大鼠心肌TLR4表達(dá)升高，在膿毒癥心肌損傷中可能起重要作用，通過調(diào)控TLR4表達(dá)，對(duì)于防止膿毒癥心肌損傷發(fā)生可能有重要臨床指導(dǎo)價(jià)值。

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Effect of TLR4 in myocardial tissue of septic rats.

ZHENG Xiao-li,CHEN Fang,ZHANG Xiao-qiao,LIU Bo-yi. Department of Geriatric Medicine＆General Medicine,Shiyan Taihe Hospital/the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Toll-like receptor 4(TLR4)in myocardial tissue of septic rats,and it’s roles on sepsis-induced myocardial injury in rats.MethodsForty healthy male Wistar rats were randomly divided into sham group(SH group,n=20)and sepsis group(CLP group,n=20).The sepsis models were established by cecal ligation and puncture(CLP).The levels of serum brain natriuretic peptide(BNP)and cardiac troponin I (cTnI)were detected after 24 hours.The myocardial tissue pathological changes and the expression levels of tumor necrosis factorα(TNF-α),TLR4 in myocardial tissue were observed.ResultsIn CLP group,myocardial tissue was seriously injured(myocardial edema and inflammatory cell infiltration,loose and disorganized myocardial cell structure). The levels of serum BNP,cTnI in CLP group were increased than those in SH group,with BNP(5.33±0.26)ng/mLvs(1.05±0.19)ng/mL and cTnI(3.89±0.13)ng/mLvs(0.87±0.07)ng/ml,allP＜0.01.The levels of myocardial TNF-α, TLR4 in CLP group were increased than those in SH group,with TNF-α(23.71±1.59)ng/mLvs(8.99±0.52)ng/mL and TLR4(38.03±5.02)vs(11.32±2.51),allP＜0.01.ConclusionThe expression of TLR4 increased in myocardial tissue of septic rats,and TLR4 may play an important role in the pathogenesis of sepsis-induced myocardial injury.

Wistar rats;Sepsis;Myocardial injury;Toll-like receptor 4(TLR4)

R-332

A

1003—6350（2017）06—0872—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.06.003

2016-10-11)

劉伯毅。E-mail：liuboyi66@163.com