復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院EpiRNA實驗室，上海 200032

LIANG Ying

EpiRNA Lab, Institues of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

miRNA：除了抑制，它還有激活功能

梁 英

復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院EpiRNA實驗室，上海 200032

早在1993年，美國科學(xué)家維克托?安博斯在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA(微小RNA，長度約21～23個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA)。由于其研究的超前性，該結(jié)果并未得到廣泛關(guān)注與認可，并與諾貝爾科學(xué)獎失之交臂。至今miRNA的研究已有20多個年頭，其功能涉及參與腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲等種種生物學(xué)行為。因此，研究miRNA的調(diào)控機制對腫瘤臨床診斷和治療具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。傳統(tǒng)意義上認為miRNA在細胞漿中通過結(jié)合靶基因3’UTR抑制翻譯或降解mRNA進而發(fā)揮負向調(diào)控作用。然而，這很難解釋許多位于細胞核內(nèi)的miRNA的作用機制。近期的研究發(fā)現(xiàn)存在核內(nèi)的miRNA通過結(jié)合增強子起到激活基因表達的作用，命名為NamiRNA(nuclear activating miRNA)。那么miRNA的細胞定位是否會影響miRNA的功能呢？定位于細胞核內(nèi)的miRNA到底與胞漿中的miRNA有何不同呢？

miRNA；NamiRNA；定位；增強子；功能

1 miRNA：從抗皮膚衰老開始說起

每個女孩內(nèi)心深處都渴望青春永駐，擁有嬰兒般吹彈可破的細膩肌膚，無奈歲月的刻刀，毫不留情地在臉上留下深深淺淺的印痕，皺紋一來便是排山倒海，不可思量。這如同夢魘般的事實，簡直讓人輾轉(zhuǎn)反側(cè)、夜不成寐。精明的商人窺探到這一秘密，于是向愛美人士大力鼓吹護膚神器，有些產(chǎn)品就應(yīng)用了miRNA與肌膚衰老相關(guān)的原理。他們比較了年輕肌膚與衰老肌膚中的miRNA，篩選出與調(diào)控皮膚蛋白息息相關(guān)的三條miRNA：miR-29，miR-34和miR-203。從天然產(chǎn)物中分離出抑制這三條miRNA的成分，進而起到抗老化、增強皮膚彈性、減輕皺紋等一系列效果(圖1)。其真正的作用機制和作用效果雖然有待時間的檢驗，但因為愛美，很多人甘當(dāng)小白鼠。

不過，這也說明人類從基因?qū)用嬉约氨碛^遺傳角度，有可能創(chuàng)造與時間抗衡的辦法。miRNA的發(fā)現(xiàn)恰與皮膚相關(guān)。研究者在做實驗時發(fā)現(xiàn)在線蟲中突變某個基因片段，幼年線蟲的柔嫩皮膚變得又老又皺，而老年線蟲的皮膚竟然變得又嫩又軟[1]。接下來，讓我們來追溯一下這個在人體龐大基因組中僅有約21個堿基的單鏈片段的歷史。

2 人小鬼大的miRNA，曾與諾獎失之交臂

miRNA的發(fā)現(xiàn)，牽涉到一位祖籍波蘭的生物學(xué)家維克托?安博斯(Victor Ambros，圖2)的工作。1993年，他在線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA lin-4[1]。20世紀50年代，安博斯出生于美國東北部新罕布什爾州。從小受其父親的影響，他喜愛閱讀及動手制作一切他認為新奇的小玩意兒，以致長大之后，他想成為一名科學(xué)家。20世紀60年代，美國阿波羅飛船登月成功，如同那個年代的很多年輕人一樣，安博斯也想成為一名天文學(xué)家。直到1971年他進入麻省理工學(xué)院學(xué)習(xí)天文知識時，發(fā)現(xiàn)自己的物理算術(shù)能力一般。睡在他旁邊的室友好幾個晚上與他討論分子生物與基因組學(xué)，于是他把興趣愛好又轉(zhuǎn)接到了分子生物科學(xué)。在博士期間他師從諾貝爾獲得者戴維?巴爾的摩(David Baltimore)。

圖1 miRNA對皮膚細胞中蛋白的調(diào)控

圖2 發(fā)現(xiàn)首個miRNA的Victor Ambros(百度搜索)

1993年，安博斯在哈佛大學(xué)成立了自己的實驗室。繼他發(fā)現(xiàn)lin-14后[1]，他的同事加里?魯弗肯(Gary Rovkun)探索了lin-14的調(diào)控機制[3]。魯弗肯發(fā)現(xiàn)突變lin-14的成年線蟲，長出幼嫩的皮膚，而突變掉lin-14的幼年線蟲，則會長出皺皺的皮膚，原因竟是在線蟲中l(wèi)in-4可調(diào)控lin-14并抑制它的表達。lin-14能調(diào)控合成lin-14p蛋白，這個蛋白在幼年線蟲中大量富集，而在成年線蟲中大量減少。所以突變掉lin-4后，lin-14會增加，lin-14p蛋白的大量富集會使得成年線蟲長出幼嫩皮膚。

安博斯早期以為lin-4是某種蛋白質(zhì)，結(jié)果這種具有調(diào)控功能的分子竟是一種只有21個堿基的RNA分子。這讓安博斯感到非常意外。該研究最終發(fā)表在《Cell》雜志上。可以說當(dāng)時安博斯的發(fā)現(xiàn)，開拓了科學(xué)家們對細胞內(nèi)非編碼RNA——也就是不參與編碼蛋白質(zhì)的RNA——生物學(xué)功能的認識。然而該發(fā)現(xiàn)的前瞻性，并未引起很多科學(xué)家的重視，因為miRNA在當(dāng)時被認為不具有普遍的調(diào)控意義，很多問題難以被解釋?；蛟S連安博斯和魯弗肯本人也認為miRNA lin-4對lin-14的調(diào)控只是個例，因此并未對此進行跟進研究。此后一段時間miRNA的相關(guān)研究基本處于停滯狀態(tài)。直到2000年，第二個miRNA let-7被發(fā)現(xiàn)[2]，人們終于開始意識到miRNA對基因調(diào)控具有普遍意義。

轉(zhuǎn)眼到了2006年，當(dāng)年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎頒給了安德魯?法爾(Andrew Fire)和克雷格?梅洛(Craig Mello)，以表彰他們在RNAi領(lǐng)域(RNA干擾，指某些雙鏈小RNA能夠沉默基因表達的現(xiàn)象，這一類小RNA也被稱作siRNA)做出的貢獻。許多人認為，首次發(fā)現(xiàn)miRNA的安博斯同樣應(yīng)該在諾貝爾獎的歷史上留下名字。由于諾貝爾獎評選委員會很少會針對同一個領(lǐng)域重復(fù)頒獎，所以盡管安博斯曾一度被提名諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎，卻最終抱憾，失之交臂。如果當(dāng)時安博斯繼續(xù)堅持對miRNA進行研究，是不是在諾貝爾獎的歷史篇章中，少留一份遺憾呢？

多年之后，我們不得不承認，無論是法爾和梅洛，還是發(fā)現(xiàn)首個miRNA的安博斯，他們都對表觀遺傳學(xué)的研究開辟了新方向。所謂的表觀遺傳是指包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等的研究。RNAi和miRNA的研究都屬于非編碼RNA的范疇。

簡單來說，生物體內(nèi)的RNA可分為兩種：一種是可編碼的，即參與編碼蛋白質(zhì)，遺傳物質(zhì)DNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA(mRNA，也就是信使RNA，由DNA轉(zhuǎn)錄而來，能進一步翻譯蛋白質(zhì))，信使RNA進一步翻譯生成蛋白質(zhì)；另一類是不能編碼的，即非編碼RNA。miRNA正是后面這種非編碼RNA中的一種，由于它的長度很短，僅有21～23個核苷酸組成，因此稱作miRNA(圖3)。從第一個miRNA的發(fā)現(xiàn)距今已有20多個年頭，目前miRNA的研究可謂是進入了井噴時代。根據(jù)miRBase的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，當(dāng)前已發(fā)現(xiàn)的人類miRNA前體有1 881條，成熟miRNA有2 588條。隨著miRNA相關(guān)研究不斷推進，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用也不斷地被揭示出來。腫瘤細胞十大特征的維持，均有miRNA參與。腫瘤細胞中存在miRNA 的異常高表達，這些高表達的miRNAs 通過靶向基因3’UTR區(qū)域，干擾靶基因，尤其是腫瘤抑制基因的正常表達，導(dǎo)致正常細胞獲得了癌細胞的生物學(xué)特性。

圖3 miRNA是非編碼RNA的一種

3 miRNA研究中的“cherry-picking”現(xiàn)象

miRNA的研究已進入白熱化時代，不管是什么研究方向，科研工作者熙熙攘攘擠入miRNA研究之門?？梢哉f，miRNA的作用是“working anytime anywhere”。近幾年，miRNA的研究由于其思路單一化、缺乏創(chuàng)新性而有慢慢變冷的趨勢。正如魯迅先生說：“其實地上本沒有路，走的人多了，也便成了路。”可是，走的人太多，就成了套路。miRNA研究的人越來越多，創(chuàng)新卻越來越少。

幾乎所有的研究都認為miRNA在細胞漿中通過結(jié)合靶基因3’UTR抑制翻譯或降解mRNA。如果信使RNA被降解，那么對應(yīng)的蛋白質(zhì)不能被翻譯，可能造成相應(yīng)的生理功能障礙，進而發(fā)揮負向調(diào)控作用—— 抑制靶基因表達(圖4)。事實上，大部分這類研究常常淪為了典型的“馬后炮”(miRNA對已經(jīng)存在的基因發(fā)揮抑制作用，而很少從根本上調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄)。當(dāng)miRNA作用于細胞時，基因芯片檢測總是會發(fā)現(xiàn)一些基因下調(diào)，也有一些基因上調(diào)。受以往的“抑制理論”影響，我們總是在下調(diào)的基因中尋找miRNA的靶基因，即使在上調(diào)基因中勉強找到某個基因與這個miRNA功能相關(guān)，我們還是必須找到這個基因的“Repressor”(抑制子，抑制靶基因表達的基因片段)，然后通過“Repress Repressor”來講述一個“完整”的miRNA故事。這樣miRNA上調(diào)基因的相關(guān)研究則被“選擇性無視”(selectively neglected)。

圖4 miRNA抑制翻譯或降解mRNA的負向調(diào)控機制

同時，通過對定位于細胞核和細胞漿的miRNA 測序，發(fā)現(xiàn)許多miRNAs 存在于細胞核中(要知道，以往對于miRNA的研究大多是默認在細胞漿中)，后續(xù)研究也證實這些miRNA定位于細胞核中，但其功能并不清楚[4]。

是不是這些定位于細胞核內(nèi)的miRNA在基因的表達調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用呢？如果miRNA負向調(diào)控機制不能完全解釋所有的調(diào)控現(xiàn)象，有沒有新的理論來補充并撐起未來miRNA研究的一片藍天？在紛擾繁雜的科研熱點中，miRNA研究要怎樣站住腳，它的出路在哪里呢？

4 一身二任：除了抑制，還能激活

科學(xué)的發(fā)展總伴隨著兩面性。那些“跟風(fēng)式”的研究可能暫時存在于科研的舞臺，但是遲早會淹沒于汪洋中。除了miRNA負向調(diào)控，有些個案報道在特殊情況下miRNA能夠促進基因表達或翻譯[5-7]，但其確切的作用機制還不夠明確。遺憾的是，目前為止人類的2 588條成熟的miRNA，尤其是新近發(fā)現(xiàn)的miRNA，大部分功能都聚焦在miRNA的負向調(diào)控的作用機制上，對任何一個miRNA的功能研究，幾乎都是千篇一律地找到對應(yīng)的靶基因，并對其負向調(diào)控的作用機制進行闡述，進而與腫瘤控制與靶向治療相關(guān)聯(lián)。

隨著人類基因組計劃的順利完成，我們已開始迎接后基因組時代的到來。ENCODE作為后基因組時代重要的發(fā)展計劃，其很多研究表明miRNA定位于細胞核中，雖然其功能并不清楚，但“天生我材必有用”，我們相信這些定位于細胞核內(nèi)的miRNA在基因的表達調(diào)控過程中一定發(fā)揮著某種重要作用，而且這些miRNA所發(fā)揮的功能應(yīng)該不同于傳統(tǒng)的細胞漿miRNA。另一方面，一些定位于核內(nèi)的miRNA是具有組織特異性的。也就是說，特定的miRNA在一些特定的組織中高度富集而在其他組織中低表達甚至不表達。比如，miR-1在肌肉組織中高表達，miR-124在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達。有意思的是增強子(enhancer)，這種能強化轉(zhuǎn)錄的DNA序列片段，也具有組織特異性。比如之前朋友圈里流傳甚廣的“蛇與老鼠的故事”中(簡單來說就是敲除小鼠染色體上的增強子序列ZRS，小鼠不會長出四肢，而給敲除ZRS后的小鼠重新補上缺失的序列，小鼠又會長出四肢)，決定四肢的增強子ZRS會高度富集在四肢中來維持四肢的正常發(fā)育發(fā)展[8](圖5)。那么，具有組織特異性的核內(nèi)miRNA是不是與增強子有關(guān)聯(lián)呢？如果有，核內(nèi)miRNA又是怎樣與增強子相互協(xié)調(diào)，決定組織細胞的特異性？

筆者所在實驗室近期的研究表明，許多miRNA自身在基因組的位置與增強子區(qū)域高度重合，如hsa-miR-26a-1、hsa-miR-3179和hsamiR-24-1等(圖6)。這些miRNA大多定位于細胞核內(nèi)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，這些miRNA能夠與增強子結(jié)合，并在全基因組的水平上激活基因表達[9]。我們后續(xù)的工作表明，miRNA的這種特性并非是個例，而是適用于很多組織和細胞。在研究miRNA自身的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制時，我們在7種不同的組織細胞中，對1 594條miRNA前體進行了系統(tǒng)分析，意外地發(fā)現(xiàn)有300多條miRNA前體在基因組中的位置與增強子的組蛋白修飾標(biāo)志H3K4me1或H3K27ac高度重疊。這讓我們將同時具有組織細胞特異性的miRNA和增強子這兩個重要的分子生物學(xué)事件聯(lián)系起來。我們發(fā)現(xiàn)，這些核內(nèi)miRNA的激活作用依賴于增強子的完整性，如果敲除增強子所在位點的某段序列，miRNA便不能發(fā)揮上調(diào)作用，同時腫瘤細胞的增殖與遷移能力都受到影響。

圖5 缺失增強子ZRS的小鼠長不出四肢，而把缺失的ZRS片段補上，小鼠長出了四肢

基于此，我們認為miRNA是重要的雙功能分子。當(dāng)miRNA位于細胞漿時，它可以作用于mRNA 3’UTR區(qū)域，如同滅火器一樣，阻斷mRNA的翻譯進而發(fā)揮基因的負調(diào)控作用；與此相反的是，當(dāng)它位于細胞核中時，就像一個點火器，通過結(jié)合增強子改變增強子的染色質(zhì)狀態(tài)，從而激活基因的轉(zhuǎn)錄表達(圖7)。

我們把定位于核內(nèi)并有激活作用的RNA稱為NamiRNA(nuclear activating miRNA)?；诖?，我們提出了NamiRNA-增強子-靶基因網(wǎng)絡(luò)激活模型，用于揭示細胞核內(nèi)miRNA功能。這一激活模型能解釋很多之前研究中不能解釋甚至被刻意忽略的研究現(xiàn)象(比如腫瘤細胞中除了下調(diào)基因，上調(diào)基因怎么解釋)。

令人驚喜的是，NamiRNA與靶基因存在直接的正向調(diào)控關(guān)系，它還參與腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲等生物學(xué)行為。雖然NamiRNA現(xiàn)在剛起步，踽踽獨行難免寂寥，但未來如果能深入探討研究，NamiRNA的正向調(diào)控理論無疑會幫助解釋更多的生物學(xué)現(xiàn)象，應(yīng)用于更多的研究領(lǐng)域，為腫瘤的臨床診斷和治療提供新的線索和策略。

圖6 miRNA所在的基因組位置與增強子區(qū)域的重疊分析(圖中H3K4me1和H3K27ac為增強子表觀遺傳修飾標(biāo)記)

圖7 miRNA在胞漿與胞核中的雙向性功能

編者按本文選自《知識分子》微信公眾號的“表觀遺傳學(xué)”專欄文章。

(2017年1月4日收稿)

[1] LEE R C, FEINBAUM R L, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 [J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[2] REINHART B J, SLACK F J, BASSON M, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans [J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[3] WIGHTMAN B, HA I, RUVKUN G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans [J]. Cell, 1993, 75(5): 856-862.

[4] HWANG H W, WENTZEL E A, MENDELL J T. A hexanucleotide element directs miRNA nuclear import [J]. Science, 2007, 315: 97-100.

[5] VASUDEVAN S, TONG Y, STEITZ J A. Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation [J].Science, 2007, 318(5858): 1877-1878.

[6] VASUDEVAN S, STEITZ J A. AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2 [J]. Cell, 2007, 128(6): 1105-1118.

[7] PLACE R F, LI L C, POOKOT D. et al. MicroRNA-373 induces expression of genes with complementary promoter sequences [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105(5): 1608-1613.

[8] KVON E Z, KAMNEVA O K, MELO U S. et al. Progressive loss of function in a limb enhancer during snake evolution [J]. Cell, 2016, 167(3): 633-642.

[9] XIAO M, LI J, LI W, et al. MicroRNAs activate gene transcription epigenetically as an enhancer trigger [J]. RNA Biology, doi: 10.1080/15476286.2015.112487.

LIANG Ying

EpiRNA Lab, Institues of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

(編輯：溫文)

Dual roles of miRNAs: functions of activation and inhibition

Since the American scientist Victor Ambros found the first miRNA (short for microRNA) lin-4 in C.elegans in 1993, the research for miRNA has been elapsed more than twenty years. miRNAs are a group of small non-coding RNAs of approximately 22 nucleotides in length which are endogenous and single-stranded. Existed evidence showed that miRNAs are involved in the proliferation, migration and invasion of many tumor cells, hence it is of great theoretical and applicable significance to understand the molecular mechanism of miRNA for the clinical diagnosis purpose. Traditionally, miRNAs are thought to inhibit mRNA translation or degradation and then play a negative regulatory role in gene expression by binding the targeted 3’UTR in the cytoplasm. However, it is difficult to explain many miRNAs located in the nucleus which may play a positive role in regulating gene expression. Does miRNA localization affect the function of miRNAs? What are the differences between miRNA located in the nucleus and cytoplasm respectively?

miRNA, NamiRNA, localization, enhancer, function

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.01.006

?通信作者，E-mail: lynne3665@163.com