李光偉， 苗宏志， 李 波， 沈云虹， 邱麗萍， 張亞珍， 金香蘭， 朱坤杰△

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理教研室， 2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科， 3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

鈣敏感受體通過PI3K/AKT通路對(duì)缺氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖的影響*

李光偉1， 苗宏志2， 李 波1， 沈云虹3， 邱麗萍3， 張亞珍3， 金香蘭3， 朱坤杰3△

(1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，2齊齊哈爾市第一醫(yī)院胸心外科，3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的： 探討鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)在缺氧誘導(dǎo)的A549及A549/DDP細(xì)胞增殖中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。方法: 通過缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)(93%N2、2% O2、5% CO2)培養(yǎng)24 h的方法復(fù)制細(xì)胞缺氧模型。應(yīng)用Western blot技術(shù)分析PCNA及p-AKT蛋白不同處理情況下的表達(dá)水平；采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)不同處理因素對(duì)細(xì)胞周期及增殖指數(shù)的影響，應(yīng)用BrdU摻入法分析不同處理因素對(duì)細(xì)胞DNA合成的影響。結(jié)果: 缺氧引起A549及A549/DDP細(xì)胞PCNA及p-AKT蛋白水平上調(diào)，增加 BrdU 摻入量、S期細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖指數(shù)，GdCl3能夠增強(qiáng)缺氧的作用，但上述效應(yīng)可以被LY294002抑制。結(jié)論: PI3K/AKT信號(hào)通路在缺氧活化CaSR并促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞增殖中起重要作用。

鈣敏感受體； A549細(xì)胞； 缺氧； 細(xì)胞增殖； PI3K/AKT信號(hào)通路

近年來肺癌成為我國第一大癌癥[1]，發(fā)病率和死亡率逐年提高。鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在肺癌發(fā)生中起重要作用，但其具體機(jī)制不詳。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CaSR)是1993年發(fā)現(xiàn)的一種G蛋白偶聯(lián)受體[2]，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，但它在肺癌中的作用未見報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中有CaSR蛋白的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示非小細(xì)胞肺癌中CaSR的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。為探究CaSR在肺癌增殖中的具體機(jī)制，我們以A549細(xì)胞為研究對(duì)象，做如下研究，以期為肺癌的臨床防治提供新思路和新靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和A549/DDP購置于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

細(xì)胞周期試劑盒購置于Becton Dickinson；BrdU購置于Roche；抗增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、AKT和p-AKT的Ⅰ抗及Ⅱ抗均購自于Santa Cruz；細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀為Thermo產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為Becton Dickinson產(chǎn)品。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及缺氧模型的復(fù)制 對(duì)照(control)組：細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h后，正常條件培養(yǎng)24 h；缺氧(hypoxia, H)組：細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h后，置于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h (93% N2、2% O2、5% CO2)；GdCl3干預(yù)組(H+GdCl3組)：細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h，加入GdCl3(300 μmol/L)后，置于細(xì)胞缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；LY294002干預(yù)組(H+LY組)：細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h，加入LY294002(10 μmol/L)孵育30 min后加入GdCl3(300 μmol/L)，置于缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

2.2 Western blot分析CaSR、PCNA、AKT和p-AKT的蛋白水平 A549及A5459/DDP細(xì)胞刮下后加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，12 000 r/mim 4 ℃離心 20 min，取上清進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE分離蛋白，100 V轉(zhuǎn)移1 h至硝酸纖維素薄膜，封閉液中封閉1 h； 分別加入PCNA(1∶500)、AKT(1∶500)、p-AKT (1∶500)和GAPDH(1∶500)I抗，4 ℃過夜。洗膜，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)標(biāo)記的抗IgG抗體(1∶1 000)孵育1 h，最后用顯色劑(Promega)顯色，吸光度掃描半定量分析顯影條帶[4-6]。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期 分別取各組細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/L，制成單細(xì)胞懸液，2 000 r/min離心5 min，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，加3 mL預(yù)冷的乙醇固定，4 ℃過夜，2 000 r/min離心5 min，加入緩沖液3 mL洗滌，2 000 r/min離心5 min，加A液(trypsin buffer)250 μL，室溫作用10 min，加B液(trypsin inhibitor and RNase buffer)200 μL，室溫作用10 min，加預(yù)冷的C液(PI stain solution)200 μL，室溫避光10 min，上機(jī)檢測(cè)[7]。

2.4 DNA BrdU摻入法測(cè)定細(xì)胞增殖 細(xì)胞種在96孔板上，每孔3 500個(gè)。各組細(xì)胞去血清培養(yǎng)24 h后按照實(shí)驗(yàn)方法2.1分別給藥及復(fù)制模型，每孔加入BrdU標(biāo)記的溶液(10 μmol/L)，固定60 min，過氧化物酶標(biāo)記的抗BrdU抗體(1∶100)室溫孵育90 min，細(xì)胞沖洗3次，底物溶液室溫孵育5 min， 酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度(A)值[7]。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用 SPSS 17.0軟件。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢測(cè)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同處理因素對(duì)CaSR表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，缺氧組CaSR表達(dá)增加(P<0.05)，GdCl3能增加其表達(dá)(P<0.05)，NPS2390(CaSR抑制劑)的作用相反，A549/DDP細(xì)胞與A549細(xì)胞CaSR蛋白表達(dá)結(jié)果一致,見圖1。

Figure 1. The protein expression of CaSR determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H： hypoxia. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group.

2 不同處理因素對(duì)PCNA表達(dá)的影響

在A549及A549/DDP細(xì)胞中，缺氧組PCNA蛋白表達(dá)增加(P<0.05)；缺氧基礎(chǔ)上GdCl3能上調(diào)這種增加(P<0.05)；LY294002(PI3K抑制劑)則能夠抑制PCNA的表達(dá)上調(diào)(P<0.05),見圖2。

Figure 2. The protein expression of PCNA determined by Western blot in different groups of the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia； LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

3 不同處理因素對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

在A549細(xì)胞，與control組比較，缺氧組G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S和G2/M期細(xì)胞比例均顯著增加。細(xì)胞增殖指數(shù) (proliferation index，PI) 計(jì)算結(jié)果顯示，缺氧狀態(tài)下PI比對(duì)照組增加，是對(duì)照組的1.34倍(P<0.05)；而H+GdCl3組S和G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，PI值明顯增高，達(dá)到30.55，高于缺氧組(P<0.05)；LY294002可抑制缺氧誘導(dǎo)的A549細(xì)胞增殖，PI指數(shù)回落到20.48。A549/DDP細(xì)胞的變化趨勢(shì)與A549細(xì)胞一致，見圖3。

Figure 3.The cell cycle analysis by flow cytometry in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

4 不同處理因素對(duì)BrdU摻入量的影響

對(duì)照組BrdU摻入量作為100%，其它組的BrdU摻入量表示為對(duì)照組的百分?jǐn)?shù)。A549和A549/DDP細(xì)胞結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，缺氧組的BrdU摻入量增加(P<0.05)；而H+GdCl3組的BrdU摻入量顯著高于缺氧組(P<0.05)； LY294002可抑制缺氧和GdCl3誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，BrdU摻入量降低(P<0.05),見圖4。

Figure 4. The cell proliferation determined by BrdU incorporation assay in the A549 and A549/DDP cells. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; #P<0.05 vs H+GdCl3 group.

5 不同處理因素對(duì)p-AKT蛋白水平的影響

2種細(xì)胞Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，和對(duì)照組比較，缺氧能夠上調(diào)p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；缺氧基礎(chǔ)上GdCl3能夠進(jìn)一步增加p-AKT蛋白的水平(P<0.05)；這種促進(jìn)效應(yīng)可以被PI3K通路阻斷劑LY294002抑制(P<0.05),見圖5。

討 論

肺癌居惡性腫瘤發(fā)病率之首，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前我國已為世界第一肺癌大國，因此肺癌的診斷和治療已成為我國臨床工作者必須面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的信息分子可以激活不同的信號(hào)通路，參與許多重要生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程常伴隨鈣離子信號(hào)的異常，但其發(fā)生機(jī)制不甚清楚。因此，認(rèn)識(shí)肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于改善患者預(yù)后，提高其生存質(zhì)量有重要意義。

CaSR是細(xì)胞膜上一種G蛋白偶聯(lián)受體。1993年Brown等[2]首先從牛的甲狀旁腺中克隆出來。在體內(nèi)分布廣泛，功能主要是維持Ca2+和其它金屬離子穩(wěn)態(tài)，此外在細(xì)胞分泌、增殖、分化、趨化、凋亡、基因表達(dá)、維持膜電位、離子通道開關(guān)、衰老等過程中亦發(fā)揮重要作用[8]。大量研究表明，其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。CaSR是影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子[9-11]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌組織中有CaSR蛋白的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度隨腫瘤分化程度、TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，提示非小細(xì)胞肺癌中CaSR的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。但其具體機(jī)制如何，目前未見報(bào)道。

Figure 5.The protein levels of p-AKT in the A549 and A549/DDP cells determined by Western blot. H: hypoxia; LY: LY294002. Mean±SD. n=3. △P<0.05 vs control group; *P<0.05 vs H group; # P<0.05 vs H+GdCl3 group.

缺氧是實(shí)質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一，研究證實(shí)缺氧能夠活化多種細(xì)胞上的CaSR[12-13]。實(shí)驗(yàn)中我們觀察到缺氧能夠上調(diào)A549及A549/DDP細(xì)胞鈣敏感受體蛋白的表達(dá)，GdCl3能夠加強(qiáng)缺氧的作用，而NPS2390能減弱缺氧的作用，說明缺氧能夠活化A549及A549/DDP細(xì)胞的CaSR。

研究證實(shí),CaSR基因敲除可導(dǎo)致體外細(xì)胞增殖和體內(nèi)骨轉(zhuǎn)移的進(jìn)程減慢[14]。我們對(duì)增殖指標(biāo)評(píng)估的結(jié)果顯示：缺氧促進(jìn)PCNA蛋白的表達(dá)，增加BrdU摻入量，能夠使S期細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞增殖指數(shù)增加。上述這些作用能夠被CaSR激動(dòng)劑GdCl3所增強(qiáng)，提示缺氧活化的CaSR可能參與了A549及A549/DDP細(xì)胞的增殖活動(dòng)。

PI3K/AKT通路是細(xì)胞增殖的經(jīng)典信號(hào)途徑之一，為進(jìn)一步探索其在缺氧活化CaSR促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的作用，我們使用了PI3K信號(hào)通路的抑制劑LY294002進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示LY294002能夠減弱GdCl3所引起的細(xì)胞增殖作用，表現(xiàn)為BrdU摻入量，S期細(xì)胞數(shù)量均減少，細(xì)胞增殖指數(shù)降低；蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示：缺氧能夠增加p-AKT蛋白水平，GdCl3能增強(qiáng)缺氧的作用，被LY294002所減弱。這些結(jié)果均提示PI3K/AKT信號(hào)通路在缺氧活化CaSR促進(jìn)A549及A549/DDP細(xì)胞增殖中起重要作用。

[1] Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics， 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2):74-108．

[2] Brown EM, Gamba G, Riccardi D, et al. Cloning and characterization of an extracellular Ca2+-sensing receptor from bovine parathyroid[J]. Nature, 1993, 366(6455):575-580．

[3] 崔愷麟， 吳冰霞， 李 波， 等. 鈣敏感受體在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床病理意義[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2015, 1(12):27-29.

[4] 孫 健， 白淑芝， 李 爽， 等. CaSR 在淫羊藿苷誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016,32(2): 234-239．

[5] 李光偉， 苗宏志， 李 波， 等. 鈣敏感受體通過G 蛋白-PLC-IP3信號(hào)途徑調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈張力[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(1):18-22．

[6] 林佳瓊, 陳景福, 廖靜秋, 等. 外源性硫化氫通過抑制JAK/STAT通路對(duì)抗高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(7):1161-1166．

[7] 李光偉， 邢文婧， 郝靜輝， 等．鈣敏感受體在缺氧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(12):2433-2437．

[8] Smajilovic S, Tfelt-Hansen J. Calcium acts as a first messenger through the calcium-sensing receptor in the cardiovascular system[J]. Cardiovasc Res, 2007, 75(3):457-467.

[9] El Hiani Y, Ahidouch A, Lehen’kyi V, et al. Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 and TRPC1 channels are required for calcium-sensing receptor-stimulated MCF-7 breast cancer cell proliferation[J]. Cell Physiol Biochem, 2009, 23(4-6):335-346.

[10]Vanhouten JN, Wysolmerski JJ. The calcium-sensing receptor in the breast[J]. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab, 2013, 27(3):403-414.

[11]Li X, Li L, Moran MS, et al. Prognostic significance of calcium-sensing receptor in breast cancer[J]. Tumour Biol, 2014, 35(6):5709-5715.

[12]Li GW, Xing WJ, Bai SZ, et al. The calcium-sensing receptor mediates hypoxia-induced proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells through MEK1/ERK1,2 and PI3K pathways[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2011,108(3): 185-193.

[13]Wang P, Wang L, Wang S, et al. Effects of calcium-sensing receptors on apoptosis in rat hippocampus during hypoxia/reoxygenation through the ERK1/2 pathway[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(9):10808-10815.

[14]Liao J, Schneider A, Datta NS, et al. Extracellular cal-cium as a candidate mediator of prostate cancer skeletal metastasis[J]. Cancer Res, 2006, 66(18):9065-9073.

(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Calcium-sensing receptor mediates hypoxia-induced proliferation of A549 cells through PI3K/AKT pathway

LI Guang-wei1, MIAO Hong-zhi2, LI Bo1, SHEN Yun-hong3, QIU Li-ping3, ZHANG Ya-zhen3, JIN Xiang-lan3, ZHU Kun-jie3

(1DepartmentofPathophysiology,QiqiharMedicalUniversity,2DepartmentofThoracicandCardiovascularDisease,TheFirstHospitalofQiqihar,3DepartmentofFunctionalLaboratory,QiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161006,China.E-mail: 1102044987@qq.com)

AIM: To explore the cell signal transduction pathway of calcium-sensing receptor (CaSR) mediating hypoxia-induced proliferation of A549 cells and A549/DDP cells. METHODS: The cell proliferation was tested by BrdU incorporation assay. The cell cycle analysis was carried out by flow cytometry. The protein levels of PCNA and p-AKT were analyzed by Western blot. RESULTS: Hypoxia significantly increased the protein levels of PCNA and p-AKT, the BrdU incorporation and the cell proliferation index. GdCl3(an agonist of CaSR) amplified the effect of hypoxia. LY294002 (a PI3K inhibitor) decreased the up-regulation of PCNA expression, the BrdU incorporation and the increased cell proliferation index induced by hypoxia and GdCl3in the A549 cells and A549/DDP cells. CONCLUSION: CaSR is expressed in A549 cells and 549/DDP cells, and CaSR activation induced by hypoxia promotes the proliferation of A549 cells and A549/DDP cells through PI3K/AKT signaling pathway.

Calcium-sensing receptor; A549 cells; Hypoxia; Cell proliferation; PI3K/AKT signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0505- 05

2016- 10- 09

2016- 12- 05

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院博士基金資助項(xiàng)目(No. QY2016B-16)

△通訊作者 Tel： 0452-2663161; E-mail: 1102044987@qq.com

R363；R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.020