王媛妹， 張玉超， 陳吉翠， 趙蕙琛， 傅余芹△， 劉元濤△

(1山東大學第二醫(yī)院腎內科， 山東 濟南 250031; 2青島市市立醫(yī)院內分泌科， 山東 青島 266071; 3山東大學醫(yī)學院細胞所， 山東 濟南 250031)

利拉魯肽通過激活CAMKK2/AMPK通路促進骨骼肌FNDC5的表達*

王媛妹1， 張玉超2， 陳吉翠3， 趙蕙琛2， 傅余芹1△， 劉元濤2△

(1山東大學第二醫(yī)院腎內科， 山東 濟南 250031;2青島市市立醫(yī)院內分泌科， 山東 青島 266071;3山東大學醫(yī)學院細胞所， 山東 濟南 250031)

目的： 探討利拉魯肽(LG)對骨骼肌細胞Ⅲ型纖連蛋白結構域包含蛋白5 (fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5)表達水平的影響并探討其機制。方法: 小鼠成肌細胞系C2C12經(jīng)誘導分化后，給予梯度濃度(1～1 000 nmol/L) LG處理不同時間 (0～24 h)，觀察LG對FNDC5表達及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號通路活性的影響，以及應用胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)受體拮抗劑exendin9-39、鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶激酶2(Ca2+/calmodulin-depen-dent protein kinase kinase 2，CAMKK2)的抑制劑STO609或AMPK的抑制劑Compound C預處理C2C12肌管細胞，觀察FNDC5蛋白表達的改變。AMPK的活性及FNDC5的表達用Western blot法檢測。結果: LG 能夠促進C2C12骨骼肌細胞FNDC5的蛋白表達，并具有劑量及時間依賴性，同時激活AMPK。LG的上述作用可被exendin9-39、STO609或Compound C阻斷。結論: 利拉魯肽可促進C2C12小鼠骨骼肌細胞合成FNDC5，此作用依賴于GLP-1受體，可能是通過激活CAMKK2/AMPK信號通路實現(xiàn)的。

CAMKK2/AMPK信號通路； C2C12成肌細胞； 利拉魯肽； Ⅲ型纖連蛋白結構域包含蛋白5

利拉魯肽(liraglutide, LG)是一種胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)類似物，與人體天然的GLP-1氨基酸序列具有97%的同源性，通過激活GLP-1受體，促進胰島素分泌[1]，抑制胰高血糖素分泌[2]，可用于治療2型糖尿病。骨骼肌細胞胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)生的一個重要因素，近年來研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌細胞也存在GLP-1受體，研究表明生理濃度的GLP-1受體激動劑LG在骨骼肌細胞中能夠發(fā)揮類似胰島素的作用，改善胰島素抵抗[3]。但是具體機制尚未完全清楚。鳶尾素(irisin)是一種新發(fā)現(xiàn)的肌源性糖基化多肽[4]，其前體物質為Ⅲ型纖連蛋白結構域包含蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5, FNDC5)。Irisin是一種調節(jié)糖脂代謝的新激素，能夠改善糖耐量異常和胰島素抵抗[5]。臨床實驗表明2型糖尿病病人的irisin分泌減少，但利拉魯肽是否通過促進骨骼肌細胞irisin的合成來發(fā)揮類胰島素作用，從而改善骨骼肌的胰島素抵抗，目前尚不清楚。故本研究擬用C2C12小鼠骨骼肌細胞，觀察LG對irisin前體FNDC5合成的影響并探討其機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清購于Gibco；特級馬血清購于Solarbio；胰蛋白酶(粉末)、瓊脂糖、丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、脫脂奶粉、TEMED、Triton X-100和吐溫20(Tween-20)購于Amresco； 兔抗磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase, AMPK)、兔抗鈣/鈣調素依賴的蛋白激酶激酶2(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2, CAMKK2)和兔抗FNDC5購于武漢三鷹生物技術有限公司；小鼠抗GAPDH、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠Ⅱ抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ⅱ抗購于北京中杉金橋公司；Compound C購于Selleckchem； STO609 購于Santa Cruz；利拉魯肽購于Novo Nordisk；抗體稀釋液和全細胞蛋白提取裂解液購于碧云天公司。

-80 ℃超低溫冰箱和低溫高速臺式離心機(Thermo)；超凈工作臺(蘇州安泰公司)；電子分析天平(Sartorius)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海三騰科學儀器有限公司)；電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設備有限公司)；紫外超純水系統(tǒng)(上海Rephile公司)；酶標儀(Bio-Rad)；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、蛋白印跡轉移槽和水平搖床(北京六一儀器廠)；FluorChem E型蛋白凝膠成像儀(ProteinSimple)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠成肌細胞系C2C12購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。C2C12細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱，當細胞生長接近于鋪滿整個瓶底時，用0.25%的胰蛋白酶消化液消化細胞后均勻地接種于6孔板，待細胞生長密度達到約70%～80%時，更換為含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基誘導分化，分化培養(yǎng)6 d后肌管大量形成。

2.2 細胞干預 待細胞誘導分化6 d后開始干預，設對照組及LG干預組：對照組不加干預因素;LG干預組加LG(終濃度為100 nmol/L)干預不同時間(15 min～24 h)，或者加入不同濃度LG(1、10、100和1 000 nmol/L)培養(yǎng)30 min或4 h。另設對照組、DMSO組、LG組(100 nmol/L)、抑制劑組和LG+抑制劑組[抑制劑為exendin9-39(10 nmol/L)、STO609 (40 μmol/L)或Compound C (40 μmol/L)]。LG+抑制劑組預先給予相應抑制劑處理1 h,再予LG (終濃度為100 nmol/L) 刺激30 min或4 h。干預結束，收集各組細胞檢測CAMKK2、AMPK和FNDC5的蛋白表達。

2.3 Western blot法檢測蛋白表達 細胞用預冷的PBS洗2次后加入含1% PMSF的裂解液提取細胞總蛋白，以BCA法進行蛋白定量，取等量蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白濕轉法電轉至PVDF膜，5%的脫脂奶粉封閉2～4 h，用Ⅰ抗稀釋液按適度濃度稀釋Ⅰ抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)搖床室溫作用1 h，TBST洗膜，ECL化學發(fā)光顯影，以GAPDH為內參照，結果用灰度值比值表示。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)分析軟件統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用LSD法或Bonferroni法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LG對FNDC5蛋白表達的影響

C2C12細胞未經(jīng)LG 干預時，F(xiàn)NDC5的蛋白量表達較少，經(jīng)過LG干預其表達量明顯增加，并且在實驗所選濃度及時間范圍內蛋白表達量隨著LG干預濃度及時間的增加而增加。與對照組相比，100 nmol/L濃度LG作用C2C12肌管細胞1 h，或者10 nmol/L濃度LG作用4 h即可顯著促進FNDC5的蛋白表達量，見圖1。

Figure 1.The effect of LG at concentration of 100 nmol/L on the protein expression of FNDC5 in C2C12 myotubes for different time (A), and the effect of LG at different concentrations on the protein expression of FNDC5 in C2C12 myotubes for 4 h (B). Mean±SD. n=3. #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 h group; *P<0.05 vs 0 nmol/L group.

2 LG對AMPK信號通路活性的影響

Western blot的實驗結果顯示對照組AMPK活性增加較少，經(jīng)過LG干預其活性明顯增加，并且在實驗所選濃度及時間范圍內其活性隨著LG干預濃度及時間增加而增加。與對照組相比，10 nmol/L LG作用C2C12肌管細胞30 min即激活AMPK，差異具統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of LG at concentration of 100 nmol/L on the activation of AMPK for different time (A), and the effect of LG at different concentrations on the activation of AMPK for 30 min (B). Mean±SD. n=3. #P<0.05 vs 0 h group; *P<0.05 vs 0 nmol/L group.

3 GLP-1受體拮抗劑exendin9-39對LG誘導的成肌細胞FNDC5蛋白表達及AMPK信號通路活性的影響

成肌細胞經(jīng)GLP-1受體拮抗劑exendin9-39預處理1 h，再予LG干預，與單獨用LG干預相比，F(xiàn)NDC5和p-AMPK的蛋白表達明顯下調(P<0.01)，與對照組及exendin9-39處理組持平。這提示加入GLP-1R拮抗劑exendin9-39可以抑制由LG促進的成肌細胞FNDC5表達及AMPK信號通路激活，見圖3。

Figure 3.The effect of GLP-1 receptor antagonist exendin9-39 (EX) on LG-induced activation of AMPK (A) and protein expression of FNDC5 (B) in C2C12 myotubes. CON: control. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs LG group.

4 CAMKK2抑制劑STO609對LG促進的成肌細胞FNDC5蛋白表達及AMPK信號通路活性的影響

由圖4可見，成肌細胞經(jīng)CAMKK2抑制劑STO609預處理1 h，再予LG干預，與單獨用LG干預相比，F(xiàn)NDC5和p-AMPK的蛋白表達明顯下調(P<0.01)。這提示加入CAMKK2抑制劑STO609可以抑制由LG促進的成肌細胞FNDC5蛋白表達及AMPK信號通路激活。

5 AMPK抑制劑Compound C對LG促進的成肌細胞FNDC5蛋白表達的影響

成肌細胞經(jīng)AMPK抑制劑Compound C預處理1 h，再予LG干預，與單獨用LG干預相比，F(xiàn)NDC5蛋白表達明顯下調 (P<0.01)， 提示加入AMPK抑制劑Compound C可以抑制由LG促進的成肌細胞FNDC5蛋白表達，見圖5。

討 論

Irisin是一種新發(fā)現(xiàn)的過氧化酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)依賴性肌肉因子。PGC-1α能夠促進跨膜蛋白FNDC5的表達，F(xiàn)NDC5被蛋白酶切成一種新的激素irisin并被分泌入血液循環(huán)[4]。有研究表明, irisin作為AMPK激活后PGC-1α的表達產(chǎn)物，可能參與BCL2所調控的骨骼肌細胞內自噬作用，從而改善骨骼肌對胰島素的敏感性，所以一些臨床研究已經(jīng)證實的2型糖尿病病人irisin分泌會減少的現(xiàn)象可能是肌肉組織發(fā)生胰島素抵抗的一個原因[6-7]。

新型抗糖尿病藥物利拉魯肽不僅能夠作用于胰島細胞，促進胰島素分泌[1]，還能作用于肌肉細胞發(fā)揮類似胰島素的作用，促進糖原的合成以及葡糖糖的氧化利用，改善胰島素抵抗[8-9]，但是其具體機制尚未完全清楚。本研究證實GLP-1受體激動劑LG能夠以濃度和時間依賴性促進小鼠骨骼肌細胞合成FNDC5，表明GLP-1受體激動劑LG在骨骼肌細胞中發(fā)揮類似胰島素作用的機制之一可能是通過促進irisin的合成來實現(xiàn)的。

為了探討LG促進骨骼肌細胞合成FNDC5的機制，本研究觀察了其對AMPK活性的影響。AMPK廣泛存在于真核細胞中，屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族[10]，受多種因素的調節(jié)，如運動、藥物、上級激酶、細胞因子等。在骨骼肌中AMPK的活化促使葡萄糖攝取、糖原合成及脂肪酸氧化，其表達及活性降低參與胰島素抵抗及相關糖脂代謝紊亂[11-12]。

Figure 4.The effect of CAMKK2 inhibitor STO609 on LG-induced activation of AMPK (A) and protein expression of FNDC5 (B) in C2C12 myotubes. CON: control. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs LG group.

LG可激活AMPK在肌肉細胞中已經(jīng)得到證實，并且運動可通過激活Ca2+/CAMKK2/AMPK信號通路調節(jié)PGC-1α的活性,從而促進irisin的表達[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，LG能夠激活AMPK，并且GLP-1受體拮抗劑exendin9-39可以抑制LG對FNDC5以及AMPK的作用，提示LG促進FNDC5的合成可能與激活AMPK信號途徑有關。為了進一步證實以上結論，本研究觀察了CAMKK2和AMPK相應的抑制劑STO609和Compound C對LG作用的影響，結果顯示LG的作用可以被STO609和Compound C抑制，提示LG促進FNDC5的合成可能是通過CAMKK2/AMPK信號途徑調控的。

綜上所述，本研究證實利拉魯肽能夠促進FNDC5的合成，其機制可能與CAMKK2/AMPK信號通路有關。GLP-1能否通過促進irisin的分泌逆轉2型糖尿病病人發(fā)生在肌肉細胞的胰島素抵抗是一個亟待解決的難題，此研究提示利拉魯肽不僅可以作用于胰島細胞治療糖尿病，對肌肉細胞的作用也具應用前景。

Figure 5.The effect of AMPK inhibitor Compound C (A) on LG-induced protein expression of FNDC5 (B) in C2C12 myotubes. CON: control. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs LG group.

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Liraglutide increases FNDC5 expression in C2C12 myotubes via activation of CAMKK2/AMPK signaling pathways

WANG Yuan-mei1, ZHANG Yu-chao2, CHEN Ji-cui3, ZHAO Hui-chen2, FU Yu-qin1, LIU Yuan-tao2

(1DepartmentofNephrology,theSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250031,China;2DepartmentofEndocrinology,QingdaoMunicipalHospital,Qingdao266071,China;3LaboratoryofCells,SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250031,China.E-mail:sduliuyuantao@163.com;yuqinfuhappy@sina.com)

AIM: To investigate the effect of liraglutide (LG) on the expression of fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5 (FNDC5) in the C2C12 myotubes. METHODS: The C2C12 mouse myoblast cell line was induced to differentiation. Differentiated cells were stimulated with gradient concentrations (1～1 000 nmol/L) of LG for different time (0～24 h). The effects of LG on the expression of FNDC5 and the activation of adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase (AMPK) signaling pathway were determined. After pretreated with glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor antagonist exendin9-39, the inhibitor of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2 (CAMKK2), STO609, or the inhibitor of AMPK, Compound C, the LG-induced FNDC5 expression in C2C12 myotubes was examined. The expression of FNDC5 and the activation of AMPK were determined by Western blot. RESULTS: In C2C12 myotubes, LG promoted the expression of FNDC5 in a dose- and time-dependent manner. LG also activated AMPK signaling pathway. These effects of LG were partly abolished by exendin9-39, STO609 and Compound C. CONCLUSION: LG promotes the expression of FNDC5 via GLP-1 receptor in the C2C12 myotubes possibly through activation of the CAMKK2/AMPK signaling pathways.

CAMKK2/AMPK signaling pathways; C2C12 myoblasts; Liraglutid; Fibronectine type Ⅲ domain-containing protein 5

1000- 4718(2017)03- 0475- 06

2016- 10- 09

2016- 12- 19

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(No. 2015WS0326)

△通訊作者 劉元濤 Tel: 0532-88905638; E-mail: sduliuyuantao@163.com; 傅余芹 Tel: 0531-85875450; E-mail: yuqinfuhappy@sina.com

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.015