李苗苗， 王 丹， 畢文鵬， 宋靈云， 于海玲△

(延邊大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院， 2藥學(xué)院，吉林 延吉 133002)

N-棕櫚酰乙醇胺對慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮抑郁樣行為的影響*

李苗苗1， 王 丹1， 畢文鵬1， 宋靈云2， 于海玲1△

(延邊大學(xué)1醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，吉林 延吉 133002)

目的： 采用慢性束縛應(yīng)激小鼠模型，研究N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)對小鼠焦慮抑郁樣行為的影響，進(jìn)一步探討PEA抗小鼠焦慮抑郁作用的可能機(jī)制。方法: 小鼠分為正常對照組、模型組、氟西汀(10 mg/kg)組和PEA 2.5、5、10 mg/kg組，每天灌胃給藥后30 min，將小鼠(除了正常對照組)放置于有機(jī)玻璃管內(nèi)接受4 h的慢性束縛應(yīng)激，持續(xù)21 d。第22天采用曠場實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)觀察PEA對慢性束縛應(yīng)激小鼠抑郁樣行為的影響；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)探討PEA對慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮樣行為的影響；水迷宮方法分析PEA對慢性束縛應(yīng)激小鼠學(xué)習(xí)、記憶、空間定向和認(rèn)知功能等方面的作用；ELISA方法檢測慢性束縛應(yīng)激小鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)及海馬5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量的變化；可見分光光度法檢測海馬乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)活性的改變。結(jié)果: 與模型組相比，在小鼠強(qiáng)迫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，PEA及氟西汀組小鼠不動(dòng)時(shí)間明顯減少；曠場試驗(yàn)中，PEA及氟西汀明顯增加小鼠水平移動(dòng)距離及運(yùn)動(dòng)總時(shí)間，但只有PEA 10 mg/kg及氟西汀組增加了小鼠直立次數(shù)；在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，PEA及氟西汀明顯增加小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)、開臂停留時(shí)間百分比及在臂總移動(dòng)距離；在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，PEA 5、10 mg/kg及氟西汀組明顯縮短小鼠尋臺(tái)潛伏期，PEA 10 mg/kg及氟西汀組明顯縮短小鼠搜尋距離。與應(yīng)激模型組比較，PEA 2.5～10 mg/kg及氟西汀顯著降低小鼠血清中ACTH水平，PEA 5、10 mg/kg及氟西汀顯著降低小鼠血清CORT水平及小鼠腎上腺指數(shù)，PEA 10 mg/kg及氟西汀顯著增高海馬5-HT含量，降低海馬AChE活性，但PEA 2.5和5 mg/kg組海馬組織中5-HT含量及AChE活性則無明顯改變。結(jié)論: PEA對束縛應(yīng)激模型小鼠的焦慮及抑郁樣行為具有一定的拮抗作用，其具體作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸功能、增加海馬單胺類遞質(zhì)5-HT水平及參與中樞膽堿系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。

N-棕櫚酰乙醇胺； 束縛應(yīng)激； 焦慮； 抑郁

焦慮和抑郁癥是兩種最常見的慢性病，屬于精神系統(tǒng)疾病[1]。抑郁癥患者通常表現(xiàn)出顯著而持久性心境低落、思維遲緩和意志活動(dòng)降低。焦慮癥是指在缺乏相應(yīng)的客觀因素情況下，表現(xiàn)為顧慮重重、緊張恐懼，伴有心悸、出汗、手抖、尿頻等自主神經(jīng)功能紊亂癥狀。近期研究表明，焦慮障礙與抑郁障礙的共病在臨床上非常普遍，具有癥狀明顯、病程多遷延易反復(fù)、社會(huì)功能損害、出現(xiàn)自殺觀念及行為、預(yù)后差等特征。抑郁癥的患者常伴有焦慮癥狀，焦慮又可加重抑郁的癥狀。但目前常用的選擇性5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)再攝取抑制劑類抗抑郁藥對頑固的抑郁癥尚不能達(dá)到滿意療效，且存在副作用，故研究和開發(fā)更高效的抗抑郁藥物一直是近些年研究的熱點(diǎn)。

N-棕櫚酰乙醇胺(N-palmitoylethanolamide，PEA)作為內(nèi)源性大麻素類似物，屬于內(nèi)源性脂肪酸乙醇胺家族(結(jié)構(gòu)見圖1)，具有抗炎[2]、鎮(zhèn)痛[3]、抗驚厥、抗癲癇作用[4]和其它神經(jīng)活性[5]。PEA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，多由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌，其抗痛覺過敏和神經(jīng)保護(hù)特性主要與神經(jīng)元活動(dòng)的減少相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，PEA可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]，特別是在周圍神經(jīng)病變模型中[7]。近年來生理學(xué)及藥理學(xué)對PEA作用的研究日漸增加。Cordaroa等[3]研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PEA可以預(yù)防糖尿病大鼠的腎功能不全和改善腎切除手術(shù)后造成的生化指標(biāo)紊亂。在小鼠福爾馬林疼痛實(shí)驗(yàn)中，PEA和反胺苯環(huán)醇聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)的鎮(zhèn)痛效果[8]。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中也發(fā)現(xiàn)PEA在小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用[9]。

Figure 1.The structure of N-palmitoylethanolamide.

為了進(jìn)一步探討PEA對束縛應(yīng)激小鼠的抗焦慮及抗抑郁作用，本研究采用兩種經(jīng)典的小鼠強(qiáng)迫應(yīng)激模型(懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn))以及曠場實(shí)驗(yàn)，探討PEA對束縛應(yīng)激模型小鼠的抗抑郁作用；采用高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)探討PEA對束縛應(yīng)激小鼠的抗焦慮作用；采用水迷宮方法分析PEA對小鼠學(xué)習(xí)、記憶等方面的影響。我們還采用生化實(shí)驗(yàn)方法檢測小鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone，ACTH)和皮質(zhì)醇(cortisol，CORT)水平以及海馬中5-HT含量，探討PEA是否通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA軸)以及經(jīng)典單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量，改善束縛應(yīng)激引發(fā)的焦慮抑郁樣癥狀，從而發(fā)揮其潛在的抗焦慮、抗抑郁作用；另外采用分光光度法檢測海馬乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)含量的變化，以分析PEA對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響是否與其改變AChE的活性有關(guān)，以進(jìn)一步探討PEA在改善小鼠束縛應(yīng)激中的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)昆明種小鼠，體重20～24 g，延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(吉2011-0007)。動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分組，自由攝食和飲水，自然光照，在溫、濕度恒定[室溫(23±2) ℃，相對濕度(55±5) %]的清潔空調(diào)室內(nèi)飼養(yǎng)。每籠5只。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)于上午9:00～11:00 之間，各實(shí)驗(yàn)組在安靜溫暖的環(huán)境中，平行進(jìn)行。

2 主要藥品與儀器

2 .1 藥品與試劑 受試化合物PEA，其結(jié)構(gòu)式見圖1，延邊大學(xué)藥學(xué)院提供; 氟西汀(fluoxetine)購自上海中西制藥有限公司；羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)購自沈陽化學(xué)試劑廠；小鼠ACTH和CORT酶聯(lián)免疫試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司)；小鼠5-HT酶聯(lián)免疫試劑盒(上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司)；BCA法總蛋白測定測試盒和AChE測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。PEA和氟西汀均于實(shí)驗(yàn)前用0.3%羧甲基纖維素鈉配置成混懸溶液備用，藥物均按動(dòng)物每公斤體重給予。

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TST-100小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)和TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；DW-2102A酶聯(lián)免疫檢測儀(北京六一生物科技有限公司)；UV-5800可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；DW-40L262醫(yī)用低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組及模型制備 60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為正常對照組、模型組、陽性對照組(氟西汀10 mg/kg)和PEA(2.5、5和10 mg/kg)劑量組，每組10只，每天上午8:00～9:00 灌胃給藥，灌胃0.5 h后，除正常對照組小鼠外，其它小鼠接受4 h的慢性束縛應(yīng)激，持續(xù)21 d。慢性束縛應(yīng)激模型制備方法為將小鼠放置在有機(jī)玻璃制成的束縛管內(nèi)，其長度和直徑分別是25和2.5 cm，束縛管表面設(shè)小孔以確保通風(fēng)良好。小鼠在束縛管內(nèi)有限的空間活動(dòng), 但不會(huì)造成肉眼可見的軀體上的傷害。在此階段，小鼠禁食水直至應(yīng)激完成。

3.2 曠場實(shí)驗(yàn)(open field test，OFT) 實(shí)驗(yàn)裝置由曠場反應(yīng)箱以及數(shù)據(jù)自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)兩部分組成。OFT-100實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)是一個(gè)不透明的塑料容器(625 mm×740 mm×510 mm)，實(shí)驗(yàn)區(qū)的體積是525 mm×525 mm×415 mm。底面被分為25個(gè)區(qū)域，實(shí)驗(yàn)全程由計(jì)算機(jī)控制并記錄。動(dòng)物活動(dòng)性被TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測，全程由敞箱上方攝像機(jī)錄制，其視野可覆蓋整個(gè)敞箱。在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)區(qū)分為4個(gè)區(qū)域：四邊、四角、四周和中央?yún)^(qū)域，每只小鼠被單獨(dú)放置在實(shí)驗(yàn)區(qū)的中心，記錄3 min內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)者將動(dòng)物輕柔地置于實(shí)驗(yàn)區(qū)中央，在實(shí)驗(yàn)間歇期，實(shí)驗(yàn)器材四壁和底面均用10%乙醇擦拭，以避免對下只小鼠的影響。

3.3 懸尾實(shí)驗(yàn)(tail suspension test，TST) 小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的活動(dòng)性由TST-100懸尾視頻分析軟件測試。懸尾實(shí)驗(yàn)參照Steru等的方法[10-11]，實(shí)驗(yàn)裝置有6個(gè)活動(dòng)區(qū)域，以確保實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)者用醫(yī)用膠帶在距小鼠尾尖2 cm處粘貼，沿附固定桿方向進(jìn)行粘貼固定，將固定磁鐵吸附于小鼠活動(dòng)箱通道頂部，小鼠倒置懸掛在活動(dòng)箱空間內(nèi)，確保小鼠頭部距底面5 cm。實(shí)驗(yàn)在安靜、微光的室內(nèi)進(jìn)行，全程由攝像機(jī)記錄，實(shí)驗(yàn)者可以觀察小鼠掙扎反應(yīng)強(qiáng)度并通過計(jì)算機(jī)記錄小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

3.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test，F(xiàn)ST) 強(qiáng)迫游泳測試實(shí)驗(yàn)方法參照Porsolt等[12]和本研究室以前的方法[11]，以小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間作為小鼠抑郁狀態(tài)評(píng)估[13-14]。實(shí)驗(yàn)中，小鼠被單獨(dú)放入一個(gè)透明的玻璃容器(高22 cm，直徑14 cm)，水深10 cm，水溫(25±0.5) ℃，測試環(huán)境保持安靜，各受試組平行測量，小鼠自由游泳，當(dāng)小鼠頭露出水面呈漂浮狀態(tài)而不盡力尋求逃脫，反映了其絕望和無助狀態(tài)[15]，測試時(shí)間為6 min，觀察后4 min內(nèi)小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

3.5 高架十字迷宮 (elevated plus maze, EPM)實(shí)驗(yàn) 裝置由高架臺(tái)和TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)兩部分組成。該裝置分為2個(gè)開臂和2個(gè)閉臂，距底面高度為100 cm，小鼠被單獨(dú)放入中心區(qū)，面向閉臂。測試全程保持環(huán)境安靜，微光下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程由攝像頭記錄，當(dāng)小鼠四肢都進(jìn)入開臂或閉臂時(shí)數(shù)據(jù)才能被記錄。為排除人為因素，實(shí)驗(yàn)者盲選動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)測試時(shí)間為3 min。每只小鼠測試后，均用10%乙醇擦拭設(shè)備，以避免上一只小鼠留下的氣味對下一只受試小鼠的影響。計(jì)算動(dòng)物在開臂停留時(shí)間百分比和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比。

3.6 水迷宮(water maze)實(shí)驗(yàn) 裝置由水迷宮設(shè)備和TM-Vision行為學(xué)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)兩部分組成。在正式實(shí)驗(yàn)前，小鼠經(jīng)過2 d的低難度訓(xùn)練。第3天，每只小鼠接受3 min測試，由攝像機(jī)記錄小鼠找到安全區(qū)域所需時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。每只小鼠在接受測試后用干毛巾擦拭身體并置于安靜溫暖環(huán)境中。

3.7 生化檢測標(biāo)本制備 最后一次行為學(xué)檢測結(jié)束后1 h，斷頭取血，分離血清；快速取腦，冰上分離雙側(cè)海馬；開腹摘取腎上腺、稱重，標(biāo)本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.8 ACTH、CORT 和5-HT的測定 小鼠血清ACTH和CORT以及海馬5-HT檢測均采用酶聯(lián)免疫試劑盒。實(shí)驗(yàn)方法參照使用說明書，具體操作步驟如下：稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，具體檢測孔包括標(biāo)準(zhǔn)孔、樣本孔和空白孔，添加100 μL辣根過氧化物酶，37 ℃ 孵育30 min，洗滌液每孔洗滌5次，最后1次洗后，拍干剩余清洗液，分別將50 μL顯色劑A和顯色劑B加入孔中，輕輕晃動(dòng)混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液50 μL，空白孔調(diào)零，終止液加入后15 min，450 nm測定吸光度值。血清ACTH和CORT分別以ng/L和 μg/L表示。5-HT含量用ng/g海馬組織蛋白表示。

3.9 AChE活性的測定 海馬AChE的活性根據(jù)AChE試劑盒使用說明書，以可見分光光度法，在波長412 nm處，0.5 cm光徑下檢測其吸光度值，計(jì)算小鼠海馬AChE的活性，單位以×103U/g 海馬組織蛋白表示。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 (mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析和Bonferroni多重檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PEA對強(qiáng)迫應(yīng)激小鼠不動(dòng)時(shí)間的影響

在連續(xù)用藥21 d后，由圖2可見，束縛應(yīng)激模型組與正常對照組相比，小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間及強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間均明顯延長(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間減少32%、35%和29%(P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少33%、39%和35%(P<0.05)，PEA 2.5 mg/kg組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間減少29%(P<0.05)，但此劑量組小鼠的懸尾不動(dòng)時(shí)間則無明顯改變。

Figure 2.The effect of PEA on immobility time in tail suspension test (TST) and forced swimming test (FST) in the mice. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

2 PEA對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)行為的影響

在連續(xù)用藥21 d后，束縛應(yīng)激模型組小鼠與正常對照組相比，水平移動(dòng)總距離及運(yùn)動(dòng)總時(shí)間，直立次數(shù)均明顯減少(P<0.05)；與模型對照組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀均明顯增加小鼠的水平移動(dòng)總距離和運(yùn)動(dòng)總時(shí)間(P<0.05)，但只有PEA 10 mg/kg及氟西汀增加了小鼠直立次數(shù)(P<0.05)，見圖3。

3 PEA對高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠行為學(xué)的影響

如圖 4顯示，束縛應(yīng)激模型組小鼠與正常對照組比較，開臂停留時(shí)間百分率及開臂進(jìn)入次數(shù)百分率均明顯縮短(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠開臂進(jìn)入次數(shù)百分比明顯延長(P<0.05)，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠開臂停留時(shí)間百分率明顯延長(P<0.05)，而PEA 2.5 mg/kg組小鼠開臂停留時(shí)間百分率與模型組相比無明顯差異，但與正常對照組相比卻明顯縮短(P<0.05)，說明PEA 2.5 mg/kg劑量組無明顯改變小鼠開臂停留時(shí)間百分率作用。與模型對照組相比，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀明顯延長小鼠在十字迷宮總在臂移動(dòng)距離(P<0.05)。

4 PEA對水迷宮實(shí)驗(yàn)小鼠行為學(xué)的影響

圖5顯示，束縛應(yīng)激模型組小鼠與正常對照組比較，水迷宮實(shí)驗(yàn)中的逃逸潛伏期及總游泳距離均明顯延長(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠逃逸潛伏期明顯縮短(P<0.05)，PEA 10 mg/kg和氟西汀組小鼠總游泳距離明顯縮短(P<0.05)。

以上行為學(xué)結(jié)果提示PEA 2.5～10 mg/kg劑量組可以一定程度地改善小鼠的焦慮和抑郁癥狀，且存在一定的量效關(guān)系。

5 PEA對束縛應(yīng)激小鼠腎上腺指數(shù)的影響

由圖6 顯示，束縛應(yīng)激模型組小鼠與正常對照組比較，腎上腺指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型對照組比較，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠的腎上腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)。

6 PEA對束縛應(yīng)激小鼠ACTH和CORT的影響

表 1 結(jié)果顯示，21 d的束縛應(yīng)激后模型組小鼠與正常對照組比較，小鼠血清ACTH和CORT水平均明顯增高(P<0.01)；與應(yīng)激模型組比較，PEA 2.5、5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠血清ACTH水平顯著降低(P<0.05)，PEA 5、10 mg/kg和氟西汀組小鼠血清CORT水平顯著降低(P<0.05)。

Figure 3.The effect of PEA on the open field test in the mice. Fxt: fluoxetine. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; #P<0.05 vs control group.

Figure 4.The effect of PEA on the elevated plus maze test in the mice. A: the percentages of the time spent in open arms and the entries into open arms; B: the total distance of mouse movements in four arms. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

Figure 5.The effect of PEA on the water maze test in mice. A: the escape latency; B: the total swimming distance. Mean±SEM. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

Figure 6.The effect of PEA on the changes of mouse adrenal index. Mean±SEM. n=10. *P<0.05 vs model group; ##P<0.01 vs control group.

表1 血清ACTH和CORT含量測定結(jié)果的比較

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vscontrol group.

7 PEA對束縛應(yīng)激對小鼠5-HT含量和AChE活性的影響

由表2顯示，21 d 的束縛應(yīng)激后模型組小鼠與正常對照組比較，海馬5-HT含量降低(P<0.01)，AChE活性增高(P<0.05)；與應(yīng)激模型組比較，PEA 10 mg/kg和氟西汀組小鼠海馬5-HT水平顯著增高(P<0.05或P<0.01)，AChE水平顯著降低(P<0.05)。

表2 海馬5-HT含量和AChE活性的測定結(jié)果

*P<0.05,**P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vscontrol group.

討 論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激和抑郁癥密切相關(guān)。慢性、低強(qiáng)度、長期的應(yīng)激源是促進(jìn)抑郁發(fā)生、加速抑郁癥發(fā)展的主要原因。應(yīng)激動(dòng)物模型通常被用在抑郁癥的病理生理機(jī)制研究和抗抑郁藥物篩選等方面[16]。慢性束縛應(yīng)激模型是抑郁癥常用的應(yīng)激模型，具有可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，其作為一種對機(jī)體無損傷性刺激，且能夠模擬抑郁癥的核心癥狀(快感缺乏)，被廣泛應(yīng)用于抑郁癥機(jī)制研究和藥物篩選模型的制備[17]。若抑郁癥或焦慮癥發(fā)生，動(dòng)物行為會(huì)表現(xiàn)為抑制狀態(tài)，機(jī)體出現(xiàn)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)失衡，而抗抑郁藥可緩解或逆轉(zhuǎn)此類癥狀。

小鼠TST和FST是評(píng)價(jià)抗抑郁藥物的兩種經(jīng)典動(dòng)物模型，在動(dòng)物無法擺脫環(huán)境刺激而導(dǎo)致絕望行為時(shí)，給予抗抑郁藥物可使其累積不動(dòng)時(shí)間減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢性束縛應(yīng)激21 d后，模型組小鼠累計(jì)不動(dòng)時(shí)間明顯延長，連續(xù)灌胃給藥21 d后，受試化合物PEA 2.5～10 mg/kg及陽性對照藥氟西汀10 mg/kg組小鼠表現(xiàn)為累計(jì)不動(dòng)時(shí)間顯著減少，且PEA 10 mg/kg組小鼠不動(dòng)時(shí)間的減少程度明顯強(qiáng)于氟西汀10 mg/kg劑量組，說明PEA對于慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠抑郁樣行為具有改善作用，且效果優(yōu)于等劑量的氟西汀。

OFT通常被用來探究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自發(fā)活性、探索性行為、抑郁樣行為和對新環(huán)境的警覺性，能夠反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性[18]。OFT實(shí)驗(yàn)中的直立次數(shù)、靜止時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離反映動(dòng)物的活動(dòng)性及其探索行為。EPM被用來評(píng)價(jià)小鼠焦慮樣行為，這是對于探究-回避沖突產(chǎn)生的條件性應(yīng)答，與小鼠大腦邊緣區(qū)、海馬、杏仁核、中縫背核等腦區(qū)密切相關(guān)[19]。焦慮行為產(chǎn)生下，小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)和時(shí)間均明顯多于封閉臂，而抗焦慮藥能明顯逆轉(zhuǎn)此狀況，使動(dòng)物進(jìn)入開放臂的次數(shù)和時(shí)間增加。通過計(jì)算動(dòng)物在開臂停留時(shí)間百分比和開臂進(jìn)入次數(shù)百分比以評(píng)價(jià)抗焦慮抑郁藥的作用，兩者均升高表示該藥物具有抗焦慮樣作用[20]。

慢性束縛應(yīng)激21 d后，OFT實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠總運(yùn)動(dòng)時(shí)間和總運(yùn)動(dòng)距離均顯著減少，表明小鼠活動(dòng)遲緩，自主活動(dòng)性降低；其直立次數(shù)減少說明小鼠對于外界的探索意識(shí)降低。EPM實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠開臂/在臂進(jìn)入次數(shù)百分比，開臂/在臂滯留時(shí)間百分比和總在臂運(yùn)動(dòng)距離均明顯降低，表明小鼠的探索性和活動(dòng)性降低，表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為。在給予慢性束縛應(yīng)激小鼠21 d藥物處理后，PEA 2.5～10 mg/kg顯著逆轉(zhuǎn)了慢性束縛應(yīng)激所造成的小鼠自主活動(dòng)和探索性降低現(xiàn)象，說明PEA可能對抑郁癥的運(yùn)動(dòng)遲緩和焦慮癥的探索性降低等行為均具有改善作用，存在潛在的抗焦慮和抗抑郁作用。

學(xué)習(xí)記憶是人類大腦的主要功能，其形成是一個(gè)復(fù)雜認(rèn)知過程，主要涉及神經(jīng)生理機(jī)制及生化機(jī)制兩方面，包括獲得、鞏固、保持和再現(xiàn)4個(gè)階段[21]。水迷宮的主要機(jī)制是通過動(dòng)物努力逃避水環(huán)境而激發(fā)其學(xué)習(xí)和記憶能力[17, 22]，通過訓(xùn)練次數(shù)增加，小鼠對固定位置(隱蔽平臺(tái))產(chǎn)生記憶力得到鞏固，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知。越來越多的研究表明，長期應(yīng)激將會(huì)損壞動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[23-24]。水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組小鼠水迷宮尋臺(tái)潛伏期明顯增加，固定時(shí)間內(nèi)的運(yùn)動(dòng)距離也增加，表明慢性束縛應(yīng)激使小鼠學(xué)習(xí)興趣降低，學(xué)習(xí)記憶能力受損，空間認(rèn)知能力也明顯下降，可能與慢性束縛應(yīng)激引起的小鼠反應(yīng)遲鈍，學(xué)習(xí)記憶能力下降有關(guān)，與文獻(xiàn)相符[24]。PEA 5、10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg組小鼠水迷宮尋臺(tái)潛伏期顯著縮短，說明5～10 mg/kg PEA對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定改善作用；PEA 10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg組小鼠水中運(yùn)動(dòng)距離明顯減少，說明PEA 10 mg/kg可以改善小鼠空間認(rèn)知能力。本研究中PEA對應(yīng)激小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善是由于其對小鼠焦慮抑郁行為的改善作用抑或由于其它機(jī)制的作用，為此本課題組也初步探討了其對海馬膽堿系統(tǒng)的影響。

HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的樞紐，維持著機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。精神神經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥多伴隨HPA軸功能亢進(jìn)[25]。HPA軸由下丘腦、垂體和腎上腺3個(gè)部分構(gòu)成整個(gè)反饋系統(tǒng)，三者相輔相成。HPA軸是應(yīng)激反應(yīng)的中樞，機(jī)體在接受長期的應(yīng)激下，HPA軸不斷激活，通過作用于腎上腺皮質(zhì)，誘發(fā)糖皮質(zhì)激素過度分泌。HPA軸持久的機(jī)能亢進(jìn)可以嚴(yán)重影響人體腎上腺的功能和結(jié)構(gòu)[26]。有報(bào)道長期的應(yīng)激引起促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、ACTH和糖皮質(zhì)激素釋放[27]，形態(tài)學(xué)觀察表現(xiàn)為小鼠腎上腺皮質(zhì)增生，髓質(zhì)萎縮，故檢測過程中可以出現(xiàn)腎上腺指數(shù)的顯著增加，這與HPA軸機(jī)能亢進(jìn)密切相關(guān)。

慢性束縛應(yīng)激21 d后，與空白對照組相比，慢性束縛應(yīng)激模型小鼠血清ACTH和CORT水平顯著增高，腎上腺指數(shù)也增加，提示模型組小鼠存在HPA軸功能亢進(jìn)；與應(yīng)激模型組比較，PEA 2.5～10 mg/kg和氟西汀10 mg/kg顯著降低小鼠血清ACTH水平，PEA 5、10 mg/kg顯著降低小鼠血清CORT水平和小鼠腎上腺指數(shù)。這些結(jié)果提示PEA可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激誘導(dǎo)的腎上腺增生、ACTH和CORT分泌異常增加，緩解應(yīng)激引發(fā)的小鼠焦慮抑郁樣癥狀，其效應(yīng)與陽性對照藥氟西汀無明顯區(qū)別。

5-HT為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，目前普遍認(rèn)為其腦內(nèi)含量異常是抑郁癥主要發(fā)病機(jī)制之一。5-HT假說認(rèn)為抑郁癥是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中5-HT釋放減少，突觸間隙含量下降所致，并且直接參與調(diào)節(jié)精神與情緒變化[28]。越來越多的研究表明，5-HT含量耗竭后，在動(dòng)物受到應(yīng)激之后，其抑郁、焦慮等癥狀表現(xiàn)更加明顯，認(rèn)知和空間記憶能力也顯著下降，抗抑郁藥物治療后，伴隨中樞內(nèi)5-HT含量的增加其抑郁癥狀亦明顯改善[26, 29]。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符，在慢性束縛應(yīng)激21 d后，小鼠海馬5-HT含量顯著下降。在經(jīng)過陽性對照藥氟西汀(5-HT再攝取抑制劑，通過抑制5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體、增加突觸間隙中5-HT含量發(fā)揮抗抑郁作用)10 mg/kg及PEA 10 mg/kg處理后其海馬5-HT含量明顯升高，但PEA 10 mg/kg對海馬5-HT的增高程度低于等劑量的氟西汀，且PEA 2.5、5 mg/kg組對小鼠海馬5-HT含量無明顯影響，說明PEA對中樞5-HT的調(diào)節(jié)效應(yīng)弱于5-HT再攝取抑制劑氟西汀。以上結(jié)果提示PEA抗焦慮抑郁樣作用的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPA軸功能和5-HT含量有關(guān)，且存在一定的量效關(guān)系，但對單胺類遞質(zhì)5-HT的作用可能不是其主要機(jī)制。

在腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)中，分布廣泛的乙酰膽堿與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，其主要功能是維持意識(shí)的清醒[30]，乙酰膽堿酯酶參與乙酰膽堿的分解，膽堿酯酶的含量和腦內(nèi)膽堿能纖維分布復(fù)雜性決定了中樞膽堿能系統(tǒng)在影響認(rèn)知功能方面的重要性[31-32]。Mineur等[23]研究證實(shí)膽堿能信號(hào)還參與焦慮和情緒相關(guān)行為。Müller等[33]通過藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)分析表明，臨床上常用的抗抑郁藥氟西汀為人類血清和紅細(xì)胞膜的膽堿酯酶抑制劑，Machado等[29]也證實(shí)，嗅球切除抑郁模型小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為同時(shí)伴隨海馬乙酰膽堿酯酶活性的增加，而氟西汀慢性應(yīng)用可以逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。本研究中對海馬乙酰膽堿酯酶的檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，慢性束縛應(yīng)激模型小鼠AChE活性顯著增加，說明慢性束縛應(yīng)激可以通過提高AChE活性以增加ACh的水解，從而降低ACh水平而使小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。與模型組比較，僅PEA 10 mg/kg及氟西汀10 mg/kg可以降低小鼠海馬AChE活性，PEA 2.5、5 mg/kg對小鼠AChE活性均無明顯影響。因?yàn)橐阴Ｄ憠A的生物學(xué)功能與乙酰膽堿酯酶、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶水平、膽堿能受體亞型的結(jié)合能力和突觸前后乙酰膽堿受體數(shù)目均直接相關(guān)，所以單一指標(biāo)檢測無法完全評(píng)估藥物對中樞乙酰膽堿系統(tǒng)的影響，僅初步推測中樞膽堿系統(tǒng)也可能參與了PEA的抗焦慮抑郁樣作用，確切結(jié)論尚需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，PEA 2.5～10 mg/kg可以改善慢性束縛應(yīng)激小鼠抑郁及焦慮樣行為，且存在一定的量效關(guān)系，其作用機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)亢進(jìn)的HPA軸功能及增高中樞5-HT含量，參與中樞膽堿系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects ofN-palmitoylethanolamide on anxiety- and depression-like behaviors in mice induced by chronic restraint stress

LI Miao-miao1, WANG Dan1, BI Wen-peng1, SONG Ling-yun2, YU Hai-ling1

(1CollegeofMedicine,2CollegeofPharmacy,YanbianUniversity,Yanji133002,China.E-mail:hlyu@ybu.edu.cn)

AIM: To study the effects ofN-palmitoylethanolamide (PEA) on the anxiety- and depression-like behaviors of the mouse model induced by restraint stress, and to explore the possible mechanism of anxiolytic and antidepressant effects of PEA.METHODS: The mice were intragastrically treated with 2.5, 5 and 10 mg/kg of PEA for 21 consecutive days once daily. Thirty min after intragastric administration, the mice (except the normal control group) were placed in the glass tube to accept 4-h chronic restraint stress for 21 d. After the last administration, the mice were submitted to the forced stress test and the open field test (OFT) to observe the effects of PEA on the depression-like behaviors. The cumulative immobility time was recorded during the 4-min interval in the forced swimming test (FST) or during the 5-min interval in the tail suspension test (TST). The elevated plus maze (EPM) test was used to investigate the effect of PEA on the mouse anxiety-like behaviors, and the water maze method was used to investigate the learning and memory abi-lities, spatial orientation and cognitive function of mice. After the behavior tests, the serum was collected and the hippocampus was removed. The serum contents of adrenocorticotropic hormone (ACTH), cortisol (CORT) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the hippocampus were detected by ELISA. The changes of acetylcholinesterase (AChE) activity in the hippocampal homogenate was measured by spectrophotometry. RESULTS: Compared with model group, in the FST or TST, the immobility time in the mice treated with PEA at 2.5～10 mg/kg and fluoxetine was significantly reduced. In the OFT, the total locomotion distance and total movement time were increased significantly in the mice, but only 10 mg/kg PEA and fluoxetine increased the numbers of rearing. In the EPM test, the percentage of the time spent in open arms, the entries into open arms and the total locomotion distance in 4 arms in the mice were significantly increased. In water maze test, PEA at 5 and 10 mg/kg and fluoxetine significantly shortened the latency to find the security zone in the mice, and PEA at 10 mg/kg and fluoxetine obviously shorten the swimming distance. Compared with model group, PEA at 10 mg/kg and fluoxetine reduced the mouse serum levels of ACTH and CORT, and the adrenal index, increased the 5-HT content and decreased the AChE activity in the hippocampus. CONCLUSION: PEA produces antagonistic effects on an-xiety- and depression-like behaviors in the mice induced by restraint stress. Its specific mechanism may be related to the re-gulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis function by increasing the 5-HT level in hippocampus, thus participating in the regulation of central cholinergic system.

N-palmitoylethanolamide; Restraint stress; Anxiety; Depression

1000- 4718(2017)03- 0435- 09

2016- 10- 29

2016- 12- 22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81460217)

△通訊作者 Tel: 0433-2435153； E-mail: hlyu@ybu.edu.cn

R363; R749

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.009