王學惠， 劉慧兵， 趙國安

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β聯(lián)合卡托普利對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關基因表達的影響*

王學惠， 劉慧兵， 趙國安△

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，河南 衛(wèi)輝 453100)

目的： 探討神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β(neuregulin-1, NRG-1β)與卡托普利單用及聯(lián)合應用對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡及相關基因表達的影響。方法：將青年雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組、心衰組、NRG-1β干預組、卡托普利干預組和聯(lián)合用藥組。采用腹主動脈-腔靜脈穿刺造瘺法制備心衰模型。通過血流動力學和血漿BNP水平評價大鼠心功能，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡指數(shù)；Western blot檢測各組大鼠左心室心肌p-Akt、Bax和Bcl-2的蛋白水平。結果：與心衰組比較，NRG-1β組、卡托普利組及聯(lián)合用藥組左心室舒張末壓、心肌凋亡指數(shù)明顯降低，±dp/dtmax明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Bax 蛋白表達明顯降低，p-Akt和Bcl-2蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而與NRG-1β組和卡托普利組相比，聯(lián)合用藥組效果更加顯著(P<0.05)。結論：神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β與卡托普利單用及聯(lián)合應用均可有效改善心功能、抑制心肌細胞凋亡，聯(lián)合用藥的療效優(yōu)于單獨用藥。

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β； 卡托普利； 心力衰竭； 細胞凋亡

心力衰竭(heart failure, HF)是由于心功能明顯受損導致的臨床綜合征，是多種心血管疾病的共同轉歸，預后差，被稱為心臟的惡性腫瘤，5年的生存率不足50%[1]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 1(neuregulin-1，NRG-1)是血管內(nèi)皮來源的生長因子，在心臟由心內(nèi)膜和心臟微血管內(nèi)皮細胞合成和分泌，與其受體ErbB在細胞中形成NRG-1/ErbB信號系統(tǒng)，調(diào)控心臟的胚胎發(fā)育、生長調(diào)控，并與心臟肥大、心衰發(fā)生乃至預后密切相關[2]。據(jù)報道，外源性NRG-1激活NRG-1/ErbB信號系統(tǒng)治療心衰能明顯改善心衰模型動物及心衰患者的心功能，是近年來新的有前途的藥物[3-6]?？ㄍ衅绽?captopril，CAP)作為血管緊張素轉化酶抑制劑治療心衰已得到大量循證醫(yī)學的證據(jù)，它能抑制左室重構、改善心功能，明顯改善心衰患者預后，其中很重要機制之一是通過抑制細胞的凋亡[7]。NRG-1聯(lián)合卡托普利治療心衰是否能加強抗心衰的效應進一步改善預后及其機制，目前不明。本研究以容量超負荷心衰大鼠為模型，通過外源性給予NRG-1β及卡托普利在體干預，觀察兩者對大鼠心功能及心肌細胞凋亡的影響，探討兩者聯(lián)合治療的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 材料

NRG-1β購于Prospec-Tany TechnoGene；TUNEL檢測試劑盒購于Roche；卡托普利由Bristol-Myers Squibb惠贈；腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)ELISA檢測試劑盒購于Assay Pro；抗p-Akt單克隆抗體、抗Bcl-2 和Bax鼠單抗以及辣根酶標記山羊抗鼠IgG購于Santa Cruz。BL-420生物機能系統(tǒng)購于成都泰盟生物技術有限公司。

2 實驗動物及分組

普通青年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重160～180 g，由西安交通大學實驗動物中心提供，均予正常飲食、自由飲水。90只實驗動物隨機分成5組，假手術組(sham組)10只、HF組20只、NRG-1β組20只、CAP組20只、聯(lián)合用藥組(NRG-1β+CAP組)20只。HF組、NRG-1β組、CAP組、聯(lián)合用藥組均采用主動脈-腔靜脈穿刺造瘺手術(aortocasval fistula，ACF)法制備容量超負荷心衰模型，sham組只穿刺不造瘺。NRG-1β組ACF術后8周，大鼠尾靜脈注射NRG-1β(10 μg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d, 之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12周；CAP組ACF術后第2天開始給予卡托普利灌胃(13.5 mg·kg-1·d-1)，8周后經(jīng)大鼠尾靜脈注射同等量的生理鹽水，連續(xù)7 d，之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12周；聯(lián)合用藥組ACF術后第2天開始給予卡托普利灌胃(13.5mg·kg-1·d-1)，8周后經(jīng)大鼠尾靜脈注射NRG-1β(10 μg·kg-1·d-1)，連續(xù)7 d, 之后繼續(xù)飼養(yǎng)至12周。

3 方法

3.1 容量超負荷心衰動物模型的建立 水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉。腹部正中切口，打開腹腔，暴露下腔靜脈和腹主動脈。先在距左、右髂動脈分支上方3 mm處腹動脈前壁上做U形縫合，夾閉腹主動脈，持18G留置針頭在縫合口處沿前壁向上刺入腹主動脈，繼續(xù)向上、向右行至腹腔動-靜脈聯(lián)合壁，并刺破進入下腔靜脈，拔出穿刺針，收緊U形縫合口縫線并打結，縫合腹壁。假手術組穿刺腹主動脈后不進入下腔靜脈造瘺，其余步驟與手術組相同。

3.2 血流動力學的測定 麻醉同前，分離右側頸動脈，插管，導管通過壓力傳感器與泰盟BL-420F多導生理監(jiān)護儀連接，待波形穩(wěn)定后繼續(xù)逆行插入左心室，記錄左室收縮末壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)及左室內(nèi)壓最大上升、下降速率(±dp/dtmax)等指標。

3.3 心臟重量的測定 麻醉后立即開胸取出心臟，在預冷的0 ℃～4 ℃生理鹽水中洗去淤血，濾紙吸干水分，應用精密天平測定各組動物的心臟濕重，計算心重比。

3.4 血漿BNP的測定 麻醉后，從大鼠的腹主動脈抽出血液約2 mL，EDTA-K2抗凝，常溫靜置30～60 min后，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用BNP ELISA檢測試劑盒，按說明書操作。

3.5 心肌細胞凋亡率的檢測 左室心肌組織常規(guī)行石蠟包埋，切片，片厚4 μm，采用脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)標記大鼠左心室肌凋亡細胞核中的DNA3’-OH末端，DAB顯色。凋亡心肌細胞TUNEL陽性表現(xiàn)為胞核呈深棕黃色，心肌細胞輪廓完整。心肌細胞凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)的測定：每組動物5張切片，每張切片取5個高倍視野計數(shù)凋亡細胞核數(shù)，計算凋亡細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)，取其平均值為細胞凋亡指數(shù)。

3.6 p-Akt、Bax和Bcl-2蛋白的定量檢測 取米粒大小的左室心肌組織在冰上研磨、裂解后用酶標儀測蛋白濃度，根據(jù)所測得蛋白濃度上樣總蛋白質量為50 μg，經(jīng)SDS-PAGE分離后，采用電印跡轉移法將蛋白質轉至PVDF膜，麗春紅S染色，用質量濃度為5%的脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h后，分別加入抗p-Akt單克隆抗體、抗Bax、Bcl-2和GAPDH 抗體，4 ℃孵育過夜，室溫下TBST溶液洗膜后加入兔(鼠)Ⅱ抗孵育2 h，用TBST溶液洗膜后與ECL試劑反應，膠片曝光，掃描膠片，用UVlDOC軟件進行條帶灰度分析，以p-Akt、Bax、Bcl-2與GAPDH條帶的積分吸光度(IA)比值來評定的3種蛋白質的表達水平。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析, 計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 血流動力學指標的比較

同sham組相比，HF組大鼠LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均明顯減低(P<0.05)，LVEDP顯著升高(P<0.05)，提示HF組大鼠的收縮及舒張功能均明顯下降。NRG-1β治療后，大鼠LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均較HF組明顯升高(P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.05)，提示NRG-1β能明顯改善心衰大鼠的心功能。CAP治療后CAP組取得與NRG-1β組相似的治療效果。聯(lián)合用藥后，NRG-1β+CAP組與NRG-1β組、CAP組相比，LVESP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP顯著降低(P<0.05)，提示心功能進一步改善。而NRG-1β組與CAP組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1。

Figure 1.The hemodynamic indexes in various groups. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs HF group; $P<0.05 vs NRG-1β group; &P<0.05 vs CAP group.

2 各組大鼠心重/體重比的比較

與sham組相比，HF組大鼠的心重/體重比明顯增加(P<0.05)，提示ACF可通過容量超負荷引起心肌肥大。而NRG-1β或CAP治療后，心重/體重比與HF組比較，差異沒有統(tǒng)計學意義，但有降低的趨勢，提示NRG-1β或CAP在一定程度上能抑制左室肥大。NRG-1β+CAP組與HF組相比，心重/體重比明顯降低(P<0.05)，與NRG-1β組、CAP組相比差異顯著(P<0.05)，提示兩者聯(lián)合應用逆轉左室肥大效果顯著，優(yōu)于單一用藥，見表1。

3 各組大鼠血漿BNP的比較

與sham組相比，HF組大鼠的血漿BNP水平明顯升高(P<0.05)；而NRG-1β或CAP單獨治療后，血漿BNP水平明顯降低(P<0.05)。聯(lián)合用藥后，NRG-1β+CAP組與NRG-1β組、CAP組相比，血漿BNP水平明顯降低，而NRG組與CAP組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見表2。

表1 各組大鼠心重/體重比的比較

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group;$P<0.05vsNRG-1β group;&P<0.05vsCAP group.

4 各組大鼠心肌細胞凋亡染色及AI的比較

顯微鏡下觀察TUNEL染色切片，凋亡心肌細胞TUNEL陽性表現(xiàn)為胞核呈深棕黃色，心肌細胞輪廓完整。Sham組心肌偶可見散在 TUNEL陽性細胞, HF組與NRG-1β治療組均出現(xiàn)TUNEL陽性細胞, NRG-1β治療組的AI顯著低于HF組(P<0.05)，CAP組取得與NRG組相似的治療效果(P<0.05)。聯(lián)合用藥后，NRG-1β+CAP組與NRG-1β組、CAP組相比，AI進一步降低(P<0.05)，見圖2、表2。

表2 各組大鼠血漿BNP及凋亡指數(shù)的比較

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsHF group;$P<0.05vsNRG-1β group;&P<0.05vsCAP group.

Figure 2. TUNEL staining of the left ventriclein various groups (×400).

5 各組大鼠左室心肌組織 p-Akt、Bax和Bcl-2含量的比較

同sham組相比，HF組大鼠左室心肌組織的p-Akt和Bcl-2水平均明顯減低(P<0.05)，Bax顯著升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax明顯降低。NRG-1β治療后，NRG-1β組大鼠與HF組相比，p-Akt、Bcl-2和Bcl-2/Bax均明顯升高(P<0.05)，而Bax顯著降低(P<0.05)，提示NRG-1β對凋亡相關基因的表達有顯著的影響。CAP治療后的治療效果與NRG-1β組相似。聯(lián)合用藥后，NRG-1β+CAP組與NRG-1β組、CAP組相比，p-Akt、Bcl-2和Bcl-2/Bax均明顯升高(P<0.05)，Bax顯著降低(P<0.05)，提示聯(lián)合用藥組對凋亡相關基因的表達比單一干預組NRG-1β組或CAP組影響更大，而NRG-1β組與CAP組相比差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

討 論

本實驗采用ACF法制備容量超負荷大鼠心衰模型，NRG-1β與卡托普利單用及聯(lián)合用藥對心力衰竭大鼠進行干預，與sham組相比，HF組大鼠LVEDP、±dp/dtmax和血漿BNP水平均明顯降低，提示ACF法制備心衰模型的成功；HF組大鼠心重/體重比明顯增加，證實了ACF術后，大鼠心臟發(fā)生了肥大及結構重構；HF組左室心肌TUNEL染色顯示存在明顯的細胞凋亡。與HF組相比，NRG-1β組、CAP組及NRG-1β+CAP組大鼠LVEDP、±dp/dtmax和血漿BNP水平均明顯升高，心功能改善；心重/體重比明顯降低，大鼠心臟重構明顯逆轉；凋亡指數(shù)降低，提示明顯抑制心肌細胞的凋亡，說明NRG-1β與卡托普利在保護心功能、逆轉左室重構、抑制心肌細胞凋亡方面療效相似；NRG-1β+CAP組分別與NRG-1β組、CAP組相比，效果更加顯著，差異具有統(tǒng)計學意義，提示兩者具有協(xié)同作用，聯(lián)合應用能進一步抑制心肌細胞凋亡，逆轉左室重構效果最佳。

心肌細胞凋亡是心肌損害的重要形式，可引起心肌細胞數(shù)量減少，進而引起心肌收縮功能的下降，心力衰竭進行性惡化，心室壁變薄、心腔擴大。PI3K/Akt 信號通路是調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡的重要轉導途徑，是細胞存活和抗凋亡的關鍵性途徑。通過 Akt磷酸化，下調(diào)促凋亡或誘導抗凋亡的蛋白表達而抑制凋亡。Akt是 PI3K 下游最重要的靶酶，負責傳遞PI3K 的始動信息[8]。Bcl-2 家族蛋白是在細胞凋亡過程中起重要作用的一類蛋白質，調(diào)控細胞凋亡。研究表明，Bcl-2 與Bax 既可形成同二聚體，也可相互作用為二聚體。Bcl-2 和Bax 蛋白水平高低與凋亡調(diào)控直接相關；Bax增高，促進細胞凋亡；Bcl-2 增高，抑制細胞凋亡，細胞在受凋亡刺激后的生存能力由Bcl-2 與Bax 的比率決定，高水平的Bcl-2/Bax有助于細胞生存，過低則促進凋亡[9-11]。

Figure 3.Expression of p-Akt, Bax, Bcl-2 and Bcl-2/Bax in the left ventricle of rats in various groups. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs sham group; #P<0.05 vs HF group; $P<0.05 vs NRG-1β group; &P<0.05 vs CAP group.

近年來研究表明，NRG-1能促進心肌細胞存活、抗凋亡。Zhao等[12]認為NRG-1與其它促絲裂素不同，其促進新生和成年心肌細胞存活的機制，部分是由于抑制心肌細胞的凋亡。An等[13]報道NRG-1通過激活Akt依賴的途徑保護阿霉素誘導的心肌細胞的凋亡。Jie等[14]研究發(fā)現(xiàn)NRG-1抑制心肌細胞的凋亡是通過激活PI3K/Akt通路抑制線粒體轉換通透孔。Guo等[15]也報道NRG-1β改善心衰大鼠心功能及左室重構，與NRG-1β減輕線粒體的損傷、抗凋亡及抗氧化應激有關。本研究也發(fā)現(xiàn)NRG-1能降低Bax表達，增加Bcl-2的表達，增加Bcl-2/Bax的比值。其可能機制是增加p-Akt的表達，激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)節(jié)下游凋亡相關蛋白的表達。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)是人體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用， 心肌組織局部血管緊張素(angiotensin，Ang)Ⅱ能誘導心肌細胞肥大，促進心肌細胞的凋亡，體外研究也證實AngⅡ能誘導心肌細胞凋亡[16]?？ㄍ衅绽茄芫o張素轉換酶抑制劑，阻斷了循環(huán)和局部組織中AngⅡ的形成，減輕氧化應激，從而發(fā)揮抗凋亡作用[7]。本研究也發(fā)現(xiàn)卡托普利能上調(diào)p-Akt，激活PI3K通路，降低Bax表達，增加Bcl-2表達，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值，發(fā)揮抗凋亡的作用。而且與NRG-1β聯(lián)合應用，作用疊加，抑制心肌細胞凋亡作用明顯加強，心功能得到了進一步的改善，提示對p-Akt表達的影響可能是聯(lián)合用藥優(yōu)于單一用藥抗凋亡作用的分子機制之一。

綜上所述，NRG-1β與卡托普利聯(lián)合用藥較單一用藥更能有效改善心功能，抑制心肌細胞凋亡，延緩心力衰竭，為臨床治療慢性心力衰竭的聯(lián)合用藥提供了實驗依據(jù)。NRG-1與卡托普利在治療心力衰竭、抑制心肌細胞凋亡方面具有協(xié)同作用，其詳細分子機制十分復雜，有待進一步研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of neuregulin-1β combined with captopril on myocardial cell apoptosis and related gene expression in rats with chronic heart failure

WANG Xue-hui, LIU Hui-bing, ZHAO Guo-an

(DepartmentofCardiovascularMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofXinxiangUniversity,Weihui453100,China.E-mail:wangxuehui000@126.com)

AIM: To study the effect of neuregulin-1 (NRG-1β) or captopril alone and their combination on myocardial cell apoptosis and related gene expression in rats with chronic heart failure. METHODS: Young male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group, heart failure group, NRG-1β group, captopril group and combined treatment group. The volume overloaded heart failure model in the rats was established by aortocaval fistula. The cardiac function was evaluated by determining the changes of hemodynamics and plasma BNP level. The apoptotic index (AI) of myocardial cells was assayed by TUNEL. The protein levels of p-Akt, Bax and Bcl-2 in left ventricular tissue were detected by Western blot. RESULTS: The LVEDP, AI and the expression of Bax were significantly lower in NRG-1β group, captopril group and combined treatment group than those in heart failure group (P<0.05), while the values of ±dp/dtmaxand the protein levels of p-Akt and Bcl-2 were significantly higher in NRG-1β group, captopril group and combined treatment group than those in heart failure group (P<0.05). The effect of combined treatment group was more significant (P<0.05) than that in NRG-1β group and captopril group. CONCLUSION: Neuregulin-1β or captopril alone and the combination of them effectively improve the cardiac function and inhibit myocardial cell apoptosis in chronic heart failure rats. The therapeutic effect of combination of NRG-1β and captopril is better than that of NRG-1β or captopril alone.

Neuregulin-1β; Captopril; Chronic heart failure; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0417- 06

2016- 09- 18

2016- 11- 21

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(No. 142300410191)；河南省科技攻關計劃項目(No. 152102310114)

△通訊作者 Tel: 0373-4403122; E-mail： wangxuehui000@126.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.006