潘孫雷， 林 輝， 駱杭琪， 高飛丹， 孟立平， 周昌鉆， 蔣承建， 池菊芳， 郭航遠1,△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000； 2紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

葉酸通過下調(diào)ERK1/2信號通路抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移*

潘孫雷1, 2， 林 輝1, 2， 駱杭琪2， 高飛丹2， 孟立平2， 周昌鉆2， 蔣承建2， 池菊芳2， 郭航遠1,2△

(1溫州醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000；2紹興市人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 紹興 312000)

目的： 探討葉酸(folic acid, FA)對血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和遷移的影響及其機制。方法: 取SD大鼠的主動脈，采用組織貼塊法培養(yǎng)VSMCs，隨機分組進行實驗。采用CCK-8和EdU法檢測葉酸對VSMCs活力和增殖能力的影響。采用劃痕實驗和Transwell法檢測葉酸對VSMCs遷移和侵襲的影響。采用Western blot法檢測細胞增殖核抗原(PCNA)蛋白表達以及血小板源性生長因子受體(PDGFR)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)蛋白的磷酸化水平。結(jié)果: 葉酸抑制血小板源性生長因子(PDGF)誘導(dǎo)的VSMCs的活力，并呈濃度依賴性(P<0.05)。葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs的遷移，并呈濃度依賴性(P<0.05)。葉酸降低PCNA表達和PDGFR磷酸化水平，并抑制PDGF激活的ERK1/2信號通路。結(jié)論: 葉酸降低PDGF誘導(dǎo)的VSMCs PCNA和p-PDGFR蛋白水平，下調(diào)ERK1/2信號通路，從而抑制VSMCs的增殖和遷移。

葉酸； 血管平滑肌細胞； 細胞增殖； 細胞遷移； ERK1/2信號通路

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是血管壁的主要細胞類型，發(fā)揮著維持血管正常生理功能的作用。血管平滑肌的異常增殖和遷移在心血管疾病如動脈粥樣硬化和冠脈介入后再狹窄的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[1]。已有研究表明，在血管損傷修復(fù)過程中，多種細胞因子和生長因子會促進平滑肌細胞的增殖遷移，比如血小板源生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)-BB[2]。增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)蛋白是細胞增殖的重要標(biāo)志之一，其表達水平的高低反映細胞的增殖活性。PDGF-BB通過與PDGF受體(PDGFR)結(jié)合后激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[包括磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/Akt、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)和p38絲裂源活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)通路]促進細胞增殖[3]。有研究報道ERK信號通路參與PDGF誘導(dǎo)的平滑細胞增殖遷移[4]。

葉酸(folic acid, FA)是一種廣泛存在蔬菜水果中的微量元素，參與DNA的甲基化和DNA合成，具有抗氧化、清除自由基、抗炎等作用。研究發(fā)現(xiàn)葉酸對心血管疾病具有良好的防治作用[5]。Huo等[6]報道中國患者在降壓治療的同時補充葉酸能顯著降低首次卒中的發(fā)作風(fēng)險。但目前葉酸對心血管疾病的防治機制尚不清楚。本實驗探討葉酸對血管平滑肌細胞增殖遷移的影響及其機制。

材 料 和 方 法

1 動物

6周齡SPF級SD大鼠，雌雄不限，體重150～180 g。由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，許可證號為SCXK(滬)2012-0002。

2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰蛋白酶-EDTA、青霉素和鏈霉素、DAPI購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清購自Gibco；Transwell侵襲小室購自BD Biosciences；PDGF-BB購自Sigma；EdU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8試劑盒和PD98059購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗PCNA、p-PDGFR、PDGFR、p-ERK1/2、ERK1/2和GAPDH抗體購自Abcam。

3 主要方法

3.1 大鼠原代血管平滑肌細胞提取及鑒定 采用改良的組織貼塊法[7]培育大鼠胸主動脈VSMCs，用形態(tài)學(xué)觀察和細胞免疫熒光檢測α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)鑒定VSMCs，通過α-SMA與DAPI核染之間的關(guān)系鑒定VSMCs的純度。取第3～7代細胞用于實驗。

3.2 實驗分組 取大鼠主動脈，用改良的組織塊法分離VSMCs。用10% 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。取第3～7代細胞進行實驗。待細胞生長匯合至70%～80%后，將10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基換成無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞同步化后再進行干預(yù)實驗。實驗分組分為5組，分別為對照組(不作任何干預(yù))、PDGF組(僅加入PDGF-BB 20 μg/L干預(yù))和不同葉酸濃度組[分別加入不同葉酸濃度(1、10、50 μmol/L)預(yù)處理24 h，再加入PDGF-BB(20 μg/L)與不同葉酸濃度共同干預(yù)24 h]。另外，設(shè)置ERK1/2信號通路抑制組(30 μmol/L PD98059[8]預(yù)處理24 h，再加入PDGF-BB 20 μg/L)，即PD98059組，驗證葉酸對ERK1/2信號通路的影響。

3.3 CCK-8檢測法檢測VSMCs 活力 取第3代對數(shù)期VSMCs制成細胞懸液接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL(細胞數(shù)為每孔5×103個)， 在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h后換成無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步化后再加入各組干預(yù)因子進行實驗。每組重復(fù)3個復(fù)孔，2個空白對照組，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值，以吸光度值代表VSMCs的活力水平。

3.4 EdU實驗檢測VSMCs的增殖能力 取第3代對數(shù)期VSMCs制成細胞懸液接種于96孔板，每孔加入細胞懸液100 μL(細胞數(shù)為每孔5×103個)， 在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h后換成無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步化后再加入各組干預(yù)因子培養(yǎng)24 h后加入EdU孵育2 h標(biāo)記增殖細胞，用4%的多聚甲醛固定細胞，Apollo染色液染色后進行DNA染色，用熒光顯微鏡觀察細胞增殖情況并拍照。

3.5 劃痕實驗檢測VSMCs的遷移能力 取第3代對數(shù)期VSMCs制成細胞懸液。以每孔5×105個細胞接種于6孔板中。待細胞生長至匯合70%～80%后，用無菌的100 μL移液槍頭以垂直6孔板底面沿中軸輕劃出一條直線，用PBS緩沖液漂洗3次，洗去劃痕造成的細胞碎片。用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，使細胞同步化并同時加入 1.8 mmol /L 羥基脲作用 12 h抑制細胞增殖。在0 h和24 h分別用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞遷移情況并拍照。

3.6 Transwell法檢測VSMCs的侵襲能力 取第3代對數(shù)期VSMCs制成細胞懸液。加入100 μL無血清培養(yǎng)的1×109/L的細胞懸浮液加于Transwell小室上室中，下室加入500 μL的含10%胎牛血清的DMEM，每組設(shè)置3個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿透的細胞，PBS緩沖液輕洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取平均值，放大倍數(shù)為100倍。

3.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達水平 收集各組細胞裂解蛋白加樣，120 V電泳至溴酚藍到凝膠底部時停止。250 mA電轉(zhuǎn)膜2 h，將膜放入5%脫脂奶粉的TBST中封閉30 min。加Ⅰ抗，于搖床上4 ℃孵育過夜，TBST洗滌 10 min、3次。加Ⅱ抗，于搖床上室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min。用ECL液曝光、顯影。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)攝像，對所得圖像進行灰度值分析，以GAPDH為內(nèi)參照。用Quantity One軟件定量分析。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs活力和增殖能力以及增殖標(biāo)志蛋白PCNA的表達

CCK-8實驗和EdU實驗檢測各組VSMCs活力和增殖能力，結(jié)果圖1所示。PDGF組顯示PDGF促進VSMCs活力和增殖能力增加，葉酸可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs活力和增殖能力(P<0.05)，并呈濃度依賴性。各組PCNA蛋白的表達水平如圖2所示，PDGF組的PCNA蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，不同濃度葉酸均抑制PDGF誘導(dǎo)的PCNA蛋白表達(P<0.05)，并呈濃度依賴性。

Figure 1.The effects of folic acid on VSMCs viability and proliferation were measured by CCK-8 assay and EdU cell proliferation assay (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PDGF group.

2 葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs遷移

劃痕實驗檢測各組VSMCs遷移結(jié)果如圖3所示，PDGF組顯示PDGF促進VSMCs遷移，葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs遷移(P<0.05)，并呈濃度依賴性。Transwell法檢測結(jié)果顯示，對照組、PDGF組以及葉酸1 μmol/L、10 μmol/L和50 μmol/L組的侵襲細胞數(shù)分別為48±5、385±11、273±8、186±7和126±5，PDGF組的細胞侵襲能力明顯高于對照組，而不同濃度葉酸組的細胞侵襲能力明顯低于PDGF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

3 葉酸抑制PDGF激活的ERK1/2信號通路

如圖4所示，PDGF組p-PDGFR的蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)，不同濃度葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的p-PDGFR蛋白水平升高(P<0.05)，并呈濃度依賴性。PDGF組p-ERK1/2的蛋白水平明顯高于對照組(P<0.05)，說明PDGF激活ERK1/2信號通路。不同濃度葉酸抑制PDGF誘導(dǎo)的p-ERK1/2蛋白水平升高(P<0.05)，并呈濃度依賴性，提示葉酸抑制PDGF激活的ERK1/2信號通路。

Figure 2.The effect of folic acid on the protein expression of PCNA in the VSMCs was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PDGF group.

4 葉酸通過下調(diào)ERK1/2 抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs活力和增殖遷移能力

為了證實ERK1/2信號通路參與PDGF誘導(dǎo)VSMCs活力和增殖遷移能力，本研究加入ERK1/2通路抑制劑PD98059[8]，驗證PD98059對PDGF誘導(dǎo)VSMCs活力和增殖遷移能力的作用，結(jié)果如圖5顯示。PD98059抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs活力和增殖遷移能力(P<0.05)。

討 論

本研究結(jié)果顯示PDGF能促進VSMCs活力、增殖遷移能力和PCNA蛋白的表達，并發(fā)現(xiàn)葉酸能抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMCs活力、增殖遷移能力和PCNA、PDGFR蛋白的表達，并進一步提示具有量效關(guān)系，PDGF激活ERK1/2信號通路，而葉酸抑制PDGF-BB激活的ERK1/2信號通路。ERK1/2信號通路抑制劑PD98059同樣抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs活力、增殖遷移能力和PCNA、PDGFR蛋白的表達。這些結(jié)果表明葉酸的這種效應(yīng)是通過下調(diào)ERK1/2信號通路實現(xiàn)的。

Figure 3.The effects of folic acid on the migration (A) and invasion (B) of the VSMCs were examined by wound healing assay and Transwell assay (×100). Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PDGF group.

Figure 4.The effects of folic acid on the phosphorylation of PDGFR and ERK1/2 in the VSMCs were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PDGF group.

Figure 5.The effect of folic acid on ERK1/2 signaling pathway verified by ERK1/2 inhibitor PD98059 was determined. A: the viability of the VSMCs was measured by CCK-8 assay; B: the proliferation ability of the VSMCs was examined by EdU cell proli-feration assay (×100); C: the migration ability of the VSMCs was examined by wound healing assay (×100); D: the invasion ability of the VSMCs was examined by transwell assay (×100); E: the protein levels of PCNA, p-PDGFR and p-ERK1/2 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. * P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs PDGF group.

葉酸與其活性代謝物質(zhì)5-甲基四氫葉酸是人類必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在核苷酸的合成和甲基化反應(yīng)中扮演重要角色[9]。流行病學(xué)研究表明補充葉酸能降低心血管疾病不良事件的發(fā)生風(fēng)險[10]。外源性補充葉酸可抑制氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮功能，延緩動脈粥樣硬化的進展，有助于冠心病的防治。高劑量葉酸預(yù)處理改善缺血心肌功能，并減輕缺血再灌注損傷[11]。Cheng等[12]報道葉酸通過抑制ERK1/2/NOX4/ROS信號通路減輕由低氧所致的血管內(nèi)皮細胞損傷。何志勇等[13]報道葉酸通過減少內(nèi)皮細胞表達Bax及Bcl-2，下調(diào)Bax/Bcl-2比值，拮抗同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡，發(fā)揮心血管保護作用。與這些研究結(jié)果相結(jié)合，本研究結(jié)果表明葉酸通過抑制血管平滑肌增殖遷移發(fā)揮血管保護作用。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族的一員。ERK信號通路由有絲分裂原刺激激活并在調(diào)節(jié)細胞增殖和分化中具有重要地位。PDGF與PDGFR結(jié)合啟動多種生物學(xué)效應(yīng)通過激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路促進血管平滑肌增殖遷移和膠原合成[14]。湯娜娜等[15]報道缺氧時生成增多的活性氧通過活化ERK1/2信號通路，促進肺動脈平滑肌細胞增殖。Luo等[16]報道血漿升高的S-腺苷同型半胱氨酸通過激活ERK1/2信號通路誘導(dǎo)血管平滑肌增殖遷移，促進動脈粥樣硬化形成。Kingsley等[4]報道在平滑肌細胞中，ERK1/2通路參與PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖遷移。越來越多的研究表明，抑制ERK1/2信號通路可以抑制VSMCs的增殖遷移。Chen等[8]報道dihydroaustrasulfone alcohol抑制ERK1/2信號通路抑制VSMCs的增殖遷移。Shi等[17]報道Liraglutide通過抑制ERK1/2信號通路減弱高糖誘導(dǎo)的VSMCs的增殖遷移。本研究結(jié)果顯示葉酸阻斷PDGFR的磷酸化，隨后抑制由PDGFR介導(dǎo)的ERK1/2信號通路。因此，本研究提示葉酸可能是抑制PDGFR磷酸化從而抑制PDGFR調(diào)節(jié)的ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，來抑制血管疾病中異常的血管平滑肌的增殖遷移。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Folic acid inhibits proliferation and migration of vascular smooth muscle cells by down-regulating ERK1/2 signaling pathway

PAN Sun-lei1, 2, LIN Hui1, 2, LUO Hang-qi2, GAO Fei-dan2, MENG Li-ping2, ZHOU Chang-zuan2, JIANG Cheng-jian2, CHI Ju-fang2, GUO Hang-yuan1, 2

(1TheFirstClinicalMedicalCollege,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;2DepartmentofCardiology,ShaoxingPeople’sHospital,Shaoxing312000,China.E-mail:ghangyuan@hotmail.com)

AIM: To elucidate the effect of folic acid (FA) on the proliferation and migration of vascular smooth muscle cells (VSMCs) and the related mechanism. METHODS: VSMCs were derived from SD rats and culturedinvitro. The cells were randomly divided and treated as indicated. CCK-8 assay and EdU cell proliferation assay were employed to assess the viability and proliferation ability of the VSMCs. Wound healing assay and Transwell chamber assay were used to assess migration ability of the VSMCs. The protein level of proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and the phosphorylation of platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in the VSMCs were determined by Western blot. RESULTS: FA inhibited PDGF-induced VSMC viability and proliferation in a dose-dependent manner (P<0.05). FA inhibited PDGF-induced VSMC migration in a dose-dependent manner (P<0.05). FA down-regulated PCNA and p-PDGFR protein levels and blocked PDGF-activated ERK1/2 signaling pathway. CONCLUSION: FA inhibits VSMC proliferation and migration via down-regulating the expression of PCNA and the level of p-PDGFR, and blocking ERK1/2 signal transduction pathway.

Folic acid; Vascular smooth muscle cells; Cell proliferation; Cell migration; ERK1/2 signaling pathway

1000- 4718(2017)03- 0405- 06

2016- 11- 10

2016- 12- 21

浙江省科技廳公益項目(No. 2016C33227)

△通訊作者 Tel: 0575-88228888; E-mail: ghangyuan@hotmail.com

R363.2; R543.3+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.004