李 澎， 王建農， 侯金才， 付建華， 劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091)

山楂葉原花青素多聚體對人臍靜脈內皮細胞鈣活化的影響*

李 澎△， 王建農， 侯金才， 付建華△， 劉建勛

(中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院，北京 100091)

目的： 探討山楂葉原花青素多聚體(PPC)對血管內皮細胞鈣濃度的影響及其機理，以期闡明其血管活性的機制。方法: 體外培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)。以Fura-2標記細胞內鈣離子，活細胞工作站連續(xù)測定細胞內鈣離子濃度30 min。結果: 12.5～50 mg/L PPC可以濃度依賴地升高HUVECs內鈣離子濃度，其作用方式與經典血管內皮細胞鈣激動劑ATP明顯不同。其中25和50 mg/L 的PPC效果與正常組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)。抑制胞內鈣釋放，對這一作用沒有影響；而去除胞外鈣離子、使用鈉鈣交換體抑制劑以及去除胞外鈉離子，均可顯著抑制，甚至取消PPC的作用。結論: PPC具有顯著的血管內皮細胞鈣活化作用，這可能是其調節(jié)血管內皮細胞功能的機制之一。這一作用可能是通過促進胞內鈉內流，激活鈉鈣交換體的逆向轉運，從而引起胞外鈣內流而達到的。

山楂葉； 原花青素； 血管內皮細胞； 細胞內鈣離子

游離鈣是人體細胞內極為重要的信號轉導信使。它的濃度升高，即所謂“鈣活化”，可以引起細胞內多種信號通路的激活或抑制，從而導致一系列的細胞功能和性狀的變化，進而影響、調控、參與機體的各種生理、病理活動。目前對于胞內游離鈣的研究，大多局限于可興奮性細胞，如心肌、平滑肌以及神經細胞等。在這些細胞上，負責調控胞內鈣離子濃度的主要是電壓依賴性鈣通道。而對于其它大量的非可興奮性細胞，則研究相對較少。

血管內皮細胞對于人體循環(huán)系統(tǒng)的調控具有關鍵的作用。研究表明，血管內皮細胞絕大多數(shù)的功能活動依賴于細胞內鈣離子濃度的升高，特別依賴于長時相的細胞內鈣離子升高。例如，血管內皮細胞大量、持久地分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)，以及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、乙酰膽堿、緩激肽等活性因子對血管內皮細胞調控功能的發(fā)揮，都需要胞內鈣離子長時相的升高[1-2]。

山楂葉是一種重要的活血化瘀中藥，具有“行氣化瘀、降濁消脂”的功效，廣泛應用于心血管疾病的治療之中。山楂葉的主要活性成分包括黃酮和原花青素(procyanidins)。原花青素是一類由兒茶素和表兒茶素不同聚體構成的一類混合物；一般1～5聚體稱為寡聚體，5聚體以上的稱為多聚體。它的藥理作用日益引起人們重視。山楂葉原花青素顯示出遠超山楂葉黃酮的作用強度，被認為是山楂葉提取物抗心肌缺血最主要的活性成分；葡萄酒中的原花青素被認為是抑制動脈粥樣硬化、減少心血管疾病發(fā)病最關鍵的物質之一[3-4]。此外，原花青素還具有抗炎、抗腫瘤、調節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、改善認知、治療老年癡呆等一系列廣泛的藥理作用，可以說是迄今發(fā)現(xiàn)的最重要的天然活性物質之一。

原花青素的藥理作用可以歸因于它的2個基本活性，即抗氧化和活化血管內皮細胞。對于前一個作用我們比較熟悉，已有大量的研究涉及。而對于后一個作用，目前的研究還不十分充分。事實上，原花青素可以激活血管內皮細胞的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，從而促進NO分泌，這一作用是獨立于它的抗氧化作用的；而NO是最重要的血管活性物質之一，介導舒張血管、抗凝血、抗炎癥等一系列作用，這些作用可以聯(lián)系到原花青素絕大多數(shù)的藥理活性[5]。研究顯示，原花青素對血管內皮細胞NOS的激活作用是通過經典通路達到的。去除孵育液中的鈣離子，則這一作用即被取消。這表明這一激活是外鈣依賴的，它需要長時相的胞內鈣離子升高和胞外鈣離子內流[5]。但是原花青素對血管內皮細胞胞內鈣影響的直接觀察還未見報道，而與之相應的機制，也未得到闡明。

我們在本研究中觀察了山楂葉原花青素多聚體(polymeric procyanidins，PPC)對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)鈣濃度的影響，并深入探討了其可能的機制。這一研究對闡明山楂葉原花青素藥理作用機制，揭示山楂葉活血化瘀本質，可能具有意義。

材 料 和 方 法

1 主要實驗材料及試劑

剖腹產健康嬰兒無菌臍帶購自海淀婦幼保健院；陽性藥ATP、EGTA和毒胡蘿卜素(Sigma)；PPC由西苑醫(yī)院實驗中心制備，純度>95%，方法參照文獻進行[6]；35 mm玻璃底激光共聚焦培養(yǎng)皿(杭州欣友生物技術有限公司)；I型膠原酶(Gibco)；胰酶(Amesco)；內皮細胞培養(yǎng)基及其添加物(Cascade)；Fura-2和F-127(Biotium)； NiCl2·6H2O(Arcos)；氯化膽堿(國藥集團)。

2 實驗方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng)與鑒定[7]將內皮細胞培養(yǎng)基添加物按1∶50的比例加入內皮細胞培養(yǎng)基，并加入青、鏈霉素(終濃度分別為100 U/L和100 μg/L)，配成完全內皮細胞培養(yǎng)基。

取剖腹產健康嬰兒無菌臍帶，約長20厘米。PBS 液洗凈血跡，從臍靜脈上端插入剪去針尖的12號針頭，以止血鉗固定。通過針頭向臍靜脈內注入PBS，沖洗3遍，洗凈殘血。以另一止血鉗夾閉臍靜脈下端，向臍靜脈內注入以DMEM 配置的0.1% I型膠原酶，取出針頭，夾閉臍靜脈上端。37 ℃消化15 min。收集臍靜脈內的消化液，并以PBS沖洗2～3遍，將流出液體與消化液合在一起，1 500 r/min離心10 min，取沉淀。

加入完全內皮細胞培養(yǎng)基，每條臍帶所得細胞約加5 mL。將細胞加入培養(yǎng)瓶內，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

當細胞生長達到80%融合時，進行傳代。PBS沖洗細胞，0.25%胰酶，37 ℃消化5 min，含5%血清的PBS終止消化。離心收集細胞，1∶3傳代。實驗使用第2～5代細胞。細胞按照1×107/L的密度接種于預先以1%明膠包被的激光共聚焦平皿上，培養(yǎng)24 h后，進行實驗。

細胞的鑒定采用免疫熒光法。將第2代HUVECs按照3×107/L的密度接種于預先以1%明膠包被的無菌玻片上。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3遍，以冰冷的95%乙醇固定1 h。棄去乙醇，以兔抗人血小板VIII因子抗體和FITC標記的羊抗兔IgG檢測，細胞核以DAPI染色。

2.2 實驗用液的配制 KB液(mmol/L)：NaCl 132,KCl 5.9,MgCl21.2,CaCl21.5,D-葡萄糖11.5,HEPES 11.5,L-精氨酸0.1，以NaOH調pH至7.4；無鈣KB液：KB液中不加CaCl2，代以1 mmol/L EGTA；無鈉KB液：KB液中不加NaCl，代以132 mmol/L 氯化膽堿。

2.3 HUVECs胞內鈣離子濃度的測定 棄去培養(yǎng)基，KB液洗3遍。向平皿中加入KB液2 mL，再將8 mmol/L Fura-2溶液(DMSO配制)與20% F127溶液(DMSO配制)按1∶1混合后，按1∶2 000的比例加入。37 ℃孵育30 min。

棄去孵育液體，以實驗用孵育液(根據(jù)不同需要，使用KB液、無鈣KB液、或無鈉KB液等)洗3遍。之后培養(yǎng)皿加入2 mL孵育液，置于IX-81活細胞工作站(Olympus)下，設定溫度為37 ℃，選擇一個視野(×200)，而后一直固定此視野進行觀察。以340 nm和380 nm為激發(fā)波長，曝光時間均為500 ms，500 nm為發(fā)射波長，進行掃描，設定頻率為1 s-1。以In Vivo軟件進行測量分析，測定電生理相互獨立的單個細胞內熒光強度的變化，共測定30 min。鈣離子濃度以340 nm和380 nm激發(fā)的熒光強度(扣除背景后)的比值表示。一般每次實驗測量視野下電生理相互獨立的3個細胞的鈣濃度，實驗重復3次。以觀測時段各觀測點的熒光強度比值之和除以觀測點的總數(shù)，計算該觀測時段的平均熒光強度比值。

2.4 加藥方式 ATP以水溶解，其余藥物均以DMSO溶解。觀測一段時間，記錄鈣濃度的基線后，加入藥物于細胞孵育液，正常組細胞給予等體積的藥物溶媒(水或DMSO)。

3 統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間差異采用單因素方差或多因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗，組內前后比較采用配對t檢驗。

結 果

1 HUVECs的鑒定

胞核呈藍色；抗人血小板VIII因子陽性的細胞，胞漿發(fā)出綠色熒光,陽性率在95%以上,見圖1。

Figure 1.The identification of cultured HUVECs(×100). A: the image of cultured HUVECs in the third passage， showing a paving stone-like feature. B: the FITC immunofluorescence image for detecting the platelet-related factor VIII on HUVECs of the third passage.

2 Fura-2染色

胞內Fura-2熒光信號強烈,背景無著色，信噪比良好,見圖2。

Figure 2.The images of the HUVECs labeled with Fura-2 (×200). The yellow, blue, and pink circles indicate the observation areas, which are electrophysiologically independent single cells. The yellow triangle indicates the background.

3 PPC顯著升高HUVECs胞內鈣離子濃度

正常對照組HUVECs胞內鈣離子濃度保持穩(wěn)定，在加入溶媒前后沒有顯著的變化。陽性藥ATP(100 μmol/L)加入后，立即引起胞內鈣離子的顯著升高，持續(xù)約幾十秒，根據(jù)文獻，此過程由細胞內質網鈣釋放引起；之后胞內鈣緩慢地下降，出現(xiàn)一個長達數(shù)十分鐘的平臺期，此過程為胞外鈣離子內流所致(圖3)。這一結果與文獻報道[1-2]的一致，表明本實驗的方法是可靠的。

PPC引起的鈣活化過程與ATP不同。加藥后胞內鈣水平先保持不變，約8 min后，緩慢上高，至加藥后15 min左右達峰，此后一直維持在此水平，呈現(xiàn)一個平臺期。12.5～50 mg/L 的PPC劑量依賴地升高細胞內鈣濃度；其中25和50 mg/L 組與正常組比較，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01),見圖4。

Figure 3.The traces of calcium concentration changes in the single cell treated with ATP at 100 μmol/L.

4 PPC的鈣活化作用依賴于外鈣內流

無論以無鈣KB液孵育細胞，還是在加藥后胞內鈣升高到達平臺期后，加入1 mmol/L EGTA(鈣離子的螯合劑，用以去除細胞外液中的鈣離子)，均可以顯著抑制HUVECs胞內鈣離子濃度的升高，見圖5、6。

5 PPC的鈣活化作用不依賴于內鈣釋放

使用細胞內質網鈣-ATP酶的抑制劑毒胡蘿卜素(4 μmol/L)，預先作用1 h,PPC的藥效沒有受到明顯的影響，見圖7。

Figure 4.The effect of hawthorn leaf polymeric procyanidins (PPC) in the changes of calcium concentrations of the HUVECs. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of intracellular calcium concentrations elicited by the PPC treatments. The delta average ratio (F340/F380) was acquired by subtracting the average ratio before the drug treatment from that after the drug treatment. The differences between groups were examined with one-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. ** P<0.01 vs normal group.

Figure 5.The PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs was abolished in calcium-free incubation solution. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the PPC-induced changes of intracellular calcium concentrations. The inter-group differences were examined with two-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. *P<0.05 vs with calcium.

Figure 6.The PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs was inhibited by EGTA. EGTA at 1 mmol/L was added into the incubation solution after the intracellular calcium concentration elevated to the plateau. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the comparison of the average intracellular calcium concentration in the plateau to that after the addition of EGTA. The differences between calcium concentrations of the plateau and that after EGTA treatments were examined with two-way ANOVA followed by paired t test. Mean±SD. n=9. **P<0.01 vs plateau.

Figure 7.Thapsigargin (TG) had no effect on the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. The cells were pretreated with 4 mmol/L TG for 1 h before the treatments of PPC. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of intracellular calcium concentrations after the treatments of PPC with or without TG pretreatments. Mean±SD. n=9.

6 PPC誘導HUVECs胞外鈣內流的作用與鈉鈣交換體的逆轉運有關

使用3種鈣庫操控性鈣通道(store-operated calcium channels，SOC)抑制劑(50 μmol/L 2-APB、1 mmol/L LaCl3和1 mmol/L GdCl3)、1種環(huán)核苷酸門控鈣通道的抑制劑(500 μmol/L diltiazem-HCl)以及1種鈉鈣交換體的抑制劑(4 mmol/L NiCl2)對HUVECs鈣內流進行抑制。只有NiCl2能夠顯著抑制PPC介導的胞內鈣濃度升高，見圖8。

7 PPC誘導的外鈣內流與鈉內流有關

一般在鈉鈣交換體出現(xiàn)逆轉運之前，胞內應該先出現(xiàn)一個鈉超載的過程。我們在證明PPC誘導內皮細胞外鈣內流與鈉鈣交換體出現(xiàn)逆轉運有關后，又接著探討了這一作用是否與鈉內流增加有關。我們以氯化膽堿代替孵育液中的氯化鈉(等摩爾替換)，以去除細胞外液的鈉離子，從而阻斷鈉內流。結果顯示，在無外鈉的情況下，PPC的作用完全消失，見圖9。

討 論

血管內皮細胞上存在著一套與電壓依賴性鈣通道大為不同的胞內鈣調控體系，目前認為主要有SOC調控系統(tǒng)、鈉-鈣交換體系統(tǒng)、環(huán)核苷酸門控鈣通道等[1-2]。

SOC調控系統(tǒng)主要由兩部分構成，一是細胞內質網上的鈣通道，另一個是胞膜上的SOC。在刺激因素的作用下，內質網上的鈣通道開放，導致鈣離子釋放入胞漿，使胞內的游離鈣一過性升高。若無后續(xù)的胞外鈣離子內流，胞內超出正常水平的鈣離子將由內質網上的鈣-ATP酶重新攝取回去，胞內游離鈣水平重新恢復正常。如果內質網鈣離子的釋放進行得足夠強烈，使內質網的鈣儲存被清空，則導致胞膜上的SOC被激活，胞外鈣大量內流，使胞內游離鈣水平持續(xù)升高，可長達幾十分鐘。ATP就是通過SOC調控系統(tǒng)起作用的。它是迄今為止研究最清楚的血管內皮細胞鈣激動劑[1-2]。而使用毒胡蘿卜素抑制內質網上的鈣-ATP酶，就可以預先清空內質網的鈣存儲，從而阻斷胞內鈣的釋放[1-2]。

Figure 8.NiCl2 inhibited the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. NiCl2 at 4 mmol/L was added into the incubation solution after the intracellular calcium concentration reached to the plateau. A: the traces in calcium concentration changes in the single cell; B: the decreases in intracellular calcium concentrations from the plateau after the addition of NiCl2.The differences between groups were examined with one-way ANOVA followed by LSD test. Mean±SD. n=9. ** P<0.01 vs normal.

Figure 9.Deletion of sodium from the incubation solution abolished the PPC-induced calcium mobilization in the HUVECs. The deletion was acquired by replacing sodium chloride with choline chloride of equal moles. A: the traces of calcium concentration changes in the single cell; B: the changes of calcium concentrations after the PPC additions. Mean±SD. n=9.

鈉-鈣交換體系統(tǒng)主要依賴胞膜上鈉-鈣交換體的逆向轉運。正常情況下，鈉-鈣交換體向胞外排出1個鈣離子，同時向胞內泵入3個鈉離子，此即順向轉運。但是在胞內鈉超載、pH值下降等情況下，鈉-鈣交換體會向胞外排出鈉離子，向胞內泵入鈣離子，即發(fā)生逆向轉運。這一過程也會導致胞內鈣離子濃度長時間升高，但不一定需要內質網的鈣釋放；而胞內鈉濃度的升高卻往往是必須的[8]。

環(huán)核苷酸門控鈣通道位于胞膜上，主要由cAMP等第二信使激活，也可介導胞外鈣內流，導致胞內鈣的長時間升高[9]。

從本實驗的結果看，PPC顯示出與ATP截然不同的動力學特征，它不引起胞內鈣的瞬間升高，作用相對緩慢；這提示兩者可能具有不同的作用機制。這也為我們后續(xù)的實驗所證實，即PPC引起的血管內皮細胞鈣活化不依賴于細胞內鈣釋放和SOC途徑，而是通過激活鈉鈣交換體，引起外鈣內流而達到的。

以往對細胞外鈣內流的研究多關注于SOC通道。近年來的研究顯示，鈉-鈣交換體是一個很有前途的潛在靶點。鈉-鈣交換體主要表達于細胞膜上。它由大約970個氨基酸構成，分為9個跨膜片段和一個胞漿環(huán)狀結構。根據(jù)不同的組織分布，鈉-鈣交換體可分為3型；鈉-鈣交換體1是普遍型，廣泛分布于全身各種組織、器官；而鈉-鈣交換體2和3則主要分布于腦和骨骼肌。

鈉-鈣交換體在神經細胞、心肌細胞等可興奮細胞中，得到了較多的研究。在腦、心肌等缺血再灌注損傷中，鈉-鈣交換體異?；罨?，逆向轉運顯著增強；而敲除鈉-鈣交換體基因、抑制其表達、逆向轉運功能，則可以顯著降低細胞的鈣超載，從而減輕損傷，提示了其在發(fā)病中起關鍵作用[10]。

在血管內皮細胞等非興奮性細胞中，目前鈉-鈣交換體的研究相對較少。有研究表明，血管內皮細胞也顯示出鈉-鈣交換體活性，分布于其上的為1型鈉-鈣交換體。抑制或敲除鈉-鈣交換體，則顯著抑制VEGF誘導的人臍靜脈內皮細胞鈣內流、ERK1/2磷酸化，以及細胞的增殖、遷移和管型分化[11]；同樣，抑制或敲除鈉-鈣交換體，也可以阻斷凝血酶以及胰酶活化受體激動劑誘導的血管內皮細胞的增殖、遷移和管型分化[12]。這些研究都提示，鈉-鈣交換體很可能參與了多種血管活性因子、藥物對內皮細胞的調控，在血管新生、炎癥等一系列病生理過程中扮演重要角色。而我們的研究結果，也為這一推斷增添了一個最新的注腳。當然，本實驗所展示的，PPC促進內皮細胞鈣活化的作用，是一個生理作用，對細胞、機體不起損害作用，相反還促進NO的產生，起到保健、治療的作用。

至于鈉-鈣交換體是否為PPC的直接作用環(huán)節(jié)。從本實驗的結果來看，應該不是。PPC的直接作用環(huán)節(jié)應該還在其上游，即鈉內流。這一結果也可以解釋為何在加入PPC后，細胞內鈣離子沒有像加入ATP那樣立即升高，而是經歷了一個較長的潛伏期。這一潛伏期可能就是胞外鈉內流，鈉超載的過程。

鈉內流增加可以通過激活內向鈉通道，也可以通過抑制胞膜鈉-鉀ATP酶而達到。究竟PPC作用于哪個環(huán)節(jié)，還需要進一步的研究。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of hawthorn leaf polymeric procyanidins on calcium mobilization in human umbilical vein endothelial cells

LI Peng, WANG Jian-nong, HOU Jin-cai, FU Jian-hua, LIU Jian-xun

(XiyuanHospital,ChinaAcademyofTraditionalChineseMedicalSciences,Beijing100091,China.E-mail:pengli1972cn@126.com；jianhuaffcn@263.net)

AIM: To observe the effects of hawthorn leaf polymeric procyanidins (PPC) on calcium mobilization of vascular endothelial cells, and to study the underlying mechanism. METHODS: Free calcium in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was labeled with Fura-2. HUVECs were treated with ATP, a positive control drug, and PPC at concentrations of 12.5， 25 and 50 mg/L..The intracellular calcium concentrations were measured with a living cell microscope for 30 min. RESULTS: PPC concentration-dependently increased the intracellular calcium concentration of HUVECs. The intracellular calcium concentrations in 25 and 50 mg/L PPC groups were significantly higher than that in normal group (P<0.01). The dynamic manner of calcium concentration elevations elicited by PPC was a slow increase which happened after a latency time of several minutes, lasted for several minutes, and reached a plateau finally. This manner was quite different from that elicited by ATP, a typical SOC operator, hinting different mechanisms between them. Inhibiting the intracellular calcium release did not influence the effects of PPC; however, deleting extracellular calcium, inhibiting the reverse mode of Na+-Ca2+exchange, or deleting extracellular sodium, restrained or even abolished the effects of PPC.CONCLUSION: PPC elicits calcium mobilization in vascular endothelial cells, which may be one of the mechanisms of the vascular modulatory activity of hawthorn procyanidins. This effect may be achieved through inducing the influx of sodium and then activating the reverse mode of Na+-Ca2+exchange.

Hawthorn leaf; Procyanidins; Vascular endothelial cells; Intracellular calcium ion

1000- 4718(2017)03- 0392- 07

2016- 08- 31

2017- 02- 20

國家自然科學基金資助項目(No. 81274196)； 北京自然科學基金資助項目(No. 7092089)

△通訊作者 李澎 Tel： 010-62835610； E-mail： pengli1972cn@126.com; 付建華 Tel： 010-62879814； E-mail： jianhuaffcn@263.net

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.002