胡雁南，薛 祥，張 浩，郞希龍

·基礎(chǔ)研究·

重編程心肌細(xì)胞治療大鼠心動(dòng)過(guò)緩

胡雁南，薛 祥，張 浩，郞希龍

目的 將Tbx18基因?qū)敫]房結(jié)損毀模型的大鼠左室心尖部，探索治療緩慢型心律失常疾病的新方法。方法取24只成年的Sprague Dawley雄性大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=12)和對(duì)照組(n=12)，實(shí)驗(yàn)組注入Tbx18起搏基因，對(duì)照組植入等量綠色螢光蛋白(GFP)，觀察其心率變化及對(duì)兒茶酚胺的反應(yīng)性。對(duì)移植部位的心肌行Western blot及免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的自主心律明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。且移植組的自主心律起源于基因注入部位。注射異丙腎上腺素后，移植組心律明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，移植部位心肌組織行Western blot及免疫熒光檢測(cè)提示:實(shí)驗(yàn)組Tbx18蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。結(jié)論 將Tbx18基因植入竇房結(jié)損毀模型的大鼠左室心尖部，可以顯著提高大鼠的心率，且對(duì)異丙腎上腺素具有良好的反應(yīng)性。

Tbx18基因;生物起搏器;基因治療;心動(dòng)過(guò)緩

緩慢型心律失常疾病是一類嚴(yán)重的心臟傳導(dǎo)疾病，目前主流的治療方法是植入電子起搏器，然而其中約有5%的患者因各種并發(fā)癥需進(jìn)一步治療，如:心律失常、氣胸、血?dú)庑?、感染、出血等?］。此外，當(dāng)電子起搏器的電池耗盡，就可能引起患者的心臟驟停并需手術(shù)更換電池。為解決這些問(wèn)題，一種新型的起搏方式—生物心臟起搏器應(yīng)運(yùn)而生。與電子心臟起搏器相比，生物心臟起搏器無(wú)需電池、電極、導(dǎo)線等，并具有更好的自主反應(yīng)性［2］。近期有研究表明過(guò)表達(dá)人的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Tbx18可以使正常的心肌細(xì)胞重編程為起搏樣細(xì)胞［3］，然而由于缺乏長(zhǎng)期的觀察且利用腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間較短，限制了其臨床應(yīng)用。本文擬研究將利用慢病毒為載體，將Lenti.Tbx18.注入到大鼠竇房結(jié)損毀模型的左室心尖部，探索治療緩慢型心律失常疾病的新方法。

1 材料和方法

1.1 竇性心動(dòng)過(guò)緩模型建立 選取24只成年雄性大鼠，購(gòu)自第二軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重約130 g。將大鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)enti.hTbx18實(shí)驗(yàn)組(n=12)和Lenti.EGFP對(duì)照組(n=12)，將大鼠放入麻醉倉(cāng)中，吸入異氟烷5 L/min約2 min，待其麻醉后，迅速將其置于麻醉臺(tái)上，將舌拉出顯露會(huì)厭，經(jīng)會(huì)厭迅速插入氣管插管，將大鼠仰臥位固定于操作臺(tái)上，四肢膠帶固定，將異氟烷流量降至為2 L/min，備皮，脫毛，75%酒精消毒，肢體導(dǎo)聯(lián)體表心電圖監(jiān)測(cè)并記錄ECG。自左側(cè)第六肋間進(jìn)胸，暴露心臟，顯露竇房結(jié)。使用電燒器燒灼竇房結(jié)及周?chē)M織。同時(shí)心外膜縫合臨時(shí)起搏導(dǎo)線，連接臨時(shí)起搏器。直至心電圖顯示房性“P”波消失、寬大的QRS，房室分離出現(xiàn)，使用臨時(shí)起搏器調(diào)起搏心率120 bpm予以保護(hù)，肢體導(dǎo)聯(lián)體表心電圖監(jiān)測(cè)并記錄ECG。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)及操作過(guò)程均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》，并經(jīng)長(zhǎng)海醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(CHEC－2015－0012)。

1.2 病毒注射 Tbx18重組慢病毒購(gòu)自和元生物技術(shù)有限公司，滴度約2.09×108TU/ml。使用10μl微量注射器及30 G的注射針頭，與心室面成30～45°夾角進(jìn)針約4 mm，于左室心尖部無(wú)血管區(qū)行病毒注射，回抽無(wú)血后將病毒液直接注入左心室心尖部，注射后，于左室心肌表面加壓止血約5min，防止病毒液的溢出。心外膜縫合起搏導(dǎo)線連接起搏器，起搏頻率為120 bpm，記錄該點(diǎn)起搏的興奮點(diǎn)在體表心電圖中QRS波群的方向及形態(tài)，用以對(duì)比分析病毒注射后出現(xiàn)室性自主節(jié)律的起搏點(diǎn)是否來(lái)源于病毒注射的部位，同時(shí)在注射點(diǎn)處心外膜采用5－0 Prolene線進(jìn)行標(biāo)記。

1.3 心電圖檢查 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組于1周，2周，3周，4周，6周，8周，隨機(jī)各取6只大鼠行心電圖檢查，將大鼠放入麻醉倉(cāng)中，吸入麻醉約2min，將電極插入大鼠的雙上肢及左下肢皮下，根據(jù)體表ECG各導(dǎo)聯(lián)QRS波形態(tài)，與心外膜起搏標(biāo)測(cè)記錄的心電圖相比，判斷該室性心律是否來(lái)源于病毒注射部位。

1.4 神經(jīng)遞質(zhì)反應(yīng)性(異丙腎上腺素) 第4周兩組各取6只大鼠，經(jīng)尾靜脈按1μg/(kg·min)注射異丙腎上腺素5 min，觀察兩組大鼠的心率變化，并比較組間差異。

1.5 Western blot及免疫熒光 2個(gè)月后腹腔注射苯巴比妥處死動(dòng)物，取細(xì)胞移植部位心肌標(biāo)本行Western blot檢測(cè)，一抗為鼠抗人hTbx18(Abcam公司，1∶50)，二抗為羊抗鼠IgG(Santa Cruz，1∶200)。術(shù)后8周處死動(dòng)物，取注射部心肌位并制成5μm的冰凍切片，丙酮固定，行免疫熒光染色檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均采用SPSS19統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。數(shù)據(jù)先使用K－S法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，使用Levene＇s方法進(jìn)行方差性檢驗(yàn)，兩組之間的均數(shù)比較使用t檢驗(yàn)，各組內(nèi)多個(gè)組間比較采用two－way ANOVA進(jìn)行重復(fù)測(cè)量。P＜0.05，認(rèn)為兩組數(shù)據(jù)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 竇房結(jié)損毀模型的建立 正常大鼠生理狀體下的心率＞160 bpm。圖1為燒灼竇房結(jié)建立竇房結(jié)毀損模型。當(dāng)大鼠竇房結(jié)毀損模型建立后，體表心電圖可見(jiàn)原先P波消失，變?yōu)椴灰?guī)則P波，心室率減慢約為80 bpm，持續(xù)觀察30 min未恢復(fù)認(rèn)為建模成功，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生死亡事件，見(jiàn)圖2。

圖1 手術(shù)法建立竇房結(jié)損毀模型

圖2 正常心電圖和損毀后心電圖

2.2 心電圖檢查 在病毒注射前，兩組動(dòng)物心率無(wú)明顯差異，(66±3.8)bpm vs(64.0±3.9)bpm，(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組心率在1周時(shí)達(dá)到頂峰，后維持6周，兩組數(shù)據(jù)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。在第8周實(shí)驗(yàn)組心率開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)但仍高于對(duì)照組，數(shù)據(jù)分別為1周后心率為(168.5±14) bpm vs(64.0±5.9)bpm，2周后心率為(170.4±16) bpm vs(76.3±6.3)bpm，3周后心率為(188.6±18.2)bpm vs(54.1±4.2)bpm，4周后心率為(189.1±21.2) bpm vs(71.8±6.6)bpm，6周后心率為(175±17.0) bpm vs(73±4.0)bpm，8周后心率為(68.3±5.0)bpm vs (66±3.8)bpm。第4周實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物心電圖QRS波方向和形態(tài)被證實(shí)與心外膜起搏時(shí)QRS波方向和形態(tài)相同，提示自主心律起源于病毒注射部位。見(jiàn)圖4。

圖3 6周大鼠心率變化結(jié)果

圖4 4周后大鼠的室性心率

2.3 兒茶酚胺反應(yīng)性 第4周各取6只大鼠行兒茶酚胺反應(yīng)性研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠尾靜脈注射異丙腎上腺素1μg/(kg·min)持續(xù)時(shí)間5 min，大鼠心率基礎(chǔ)值由(174.2±11.4)bpm增至(230.1±15.4) bpm。對(duì)照組中大鼠心率基礎(chǔ)值為(64.0±3.9)bpm，使用異丙腎上腺素后心率增加為(74.5±2.6)bpm，兩組差別具有統(tǒng)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見(jiàn)圖5。

圖5 3周時(shí)注射異丙腎上腺素后大鼠心率變化

2.4 Western blot及免疫熒光 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組病毒注射部位行Western blot檢測(cè)目的蛋白Tbx18的表達(dá)，其結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組中Tbx18蛋白表達(dá)量顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6。為了進(jìn)一步的明確實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞Tbx18蛋白表達(dá)情況，通過(guò)抗Tbx18免疫熒光染色，其結(jié)果顯示:hT-bx18細(xì)胞膜(綠色熒光)在實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)。見(jiàn)圖7。

圖6 大鼠心肌細(xì)胞的Western blot檢測(cè)

圖7 大鼠心肌細(xì)胞的抗hTbx18免疫熒光染色(×40)

3 討論

Tbx18在發(fā)育中的動(dòng)物心臟的原始心外膜、室間隔、瓣膜、上腔靜脈及竇房結(jié)中都有表達(dá)，竇房結(jié)胚胎組織的發(fā)育需要Tbx18，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Tbx18轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞成功構(gòu)建心臟生物起搏器，轉(zhuǎn)染起搏基因后的心肌細(xì)胞不僅具有竇房結(jié)樣細(xì)胞的起搏功能，且具有很低起搏器使用率，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)心外膜灼燒可造成竇房結(jié)透壁性不可逆損傷，從而造成心律減慢，竇性停搏等心律失常，而轉(zhuǎn)染了Tbx18的心室肌細(xì)胞，不僅具有良好的自主節(jié)律性，并且其起搏位點(diǎn)來(lái)源于Tbx18病毒注射部位。生物起搏器不僅具有更好的自主反應(yīng)性且對(duì)兒茶酚胺高度敏感，這些優(yōu)勢(shì)使得生物起搏器走進(jìn)臨床服務(wù)患者成為可能。以往的基因法構(gòu)建生物起搏器主要方式是通過(guò)增加離子通道的數(shù)目以達(dá)到更多地內(nèi)向電流而發(fā)揮起搏作用［4－8］，而筆者采用了一種更直接、高效的方法——將起搏基因直接導(dǎo)入心肌細(xì)胞，使其成為類竇房結(jié)樣細(xì)胞而發(fā)揮起搏功能［3］，目前的研究不僅證實(shí)了Tbx18可將心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為竇房結(jié)樣細(xì)胞，而且還證實(shí)了這種轉(zhuǎn)化具有良好的自主反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生物起搏器電活動(dòng)的活躍期是病毒注射后第1周，第8周后病毒轉(zhuǎn)染組的心率也降低，可能原因是由于異源性蛋白表達(dá)，可引起了自身免疫反應(yīng)，導(dǎo)致了表達(dá)Tbx18的心肌細(xì)胞受到了清除。以往的基因治療方法大多是通過(guò)腺病毒作為載體導(dǎo)入心肌細(xì)胞或干細(xì)胞，然而腺病毒的表達(dá)時(shí)限較短且不能整合到宿主的染色體中，無(wú)法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定持久的表達(dá)。理想的起搏器，無(wú)論是電子起搏器還是生物起搏器都應(yīng)當(dāng)具有良好的自主調(diào)節(jié)和自主反應(yīng)性［9－10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用慢病毒使起搏基因整合到宿主細(xì)胞的染色體中以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期持久的表達(dá)，使其表達(dá)時(shí)限提高到8周，使其為臨床應(yīng)用邁進(jìn)一大步。

然而本實(shí)驗(yàn)仍有不足之處:首先，表達(dá)時(shí)限問(wèn)題一直是制約生物起搏器發(fā)展的主要問(wèn)題，也是生物起搏器代替電子起搏器關(guān)鍵。由于小動(dòng)物心律較快，與大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相比，大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更貼近臨床。而暫時(shí)性起搏也具有一定的臨床意義，例如臨床上因起搏器發(fā)生感染的患者，常需要移除起搏器，使用抗生素抗感染治療，待感染控制后，才能再次重新安裝電子起搏器，這期間可以使用臨時(shí)起搏器作為過(guò)渡［11］。所以下一步研究的關(guān)鍵是如何提高基因的表達(dá)時(shí)限問(wèn)題。其次是注入起搏基因后大鼠的心率雖然較前有所提升但仍低于正常心率，所以下一步研究方向是否可以聯(lián)合兩種起搏基因注入心肌細(xì)胞以達(dá)到更好的起搏效果。最后利用大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其起搏效果及相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況，為臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

［1］ Eberhardt F，Bode F，Bonnemeier H，etal.Long term complications in single and dual chamber pacing are influenced by surgical experience and patientmorbidity［J］.Heart，2005，91(4):500－506.

［2］ Chauveau S，Brink PR，Cohen IS.Stem cellebased biological pacemakers from proof of principle to therapy:a review［J］.Cytotherapy，2014，16(7):873－880.

［3］ Kapoor N，Liang W，Marban E，et al.Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18［J］.Nat Biotechnol，2013，31(1):54－62.

［4］ Plotnikov AN，Bucchi A，Shlapakova I，etal.HCN212－channel biological pacemakersmanifesting ventricular tachyarrhythmiasare responsive to treatment with I(f)blockade［J］.Heart Rhythm，2008，5(2):282－288.

［5］ Boink GJ，Duan L，Nearing BD，etal.HCN2/SkM1 gene transfer into canine left bundle branch induces stable，autonomically responsive biological pacing at physiological heart rates［J］.JAm Coll Cardiol，2013，61(11):1192－1201.

［6］ Lu W，Yaoming N，Boli R，et al.mHCN4 genetically modified canine mesenchymal stem cells provide biological pacemaking function in complete dogs with atrioventricular block［J］.Pacing Clin Electrophysiol，2013，36(9):1138－1149.

［7］ Zhou YF，Yang XJ，Li HX，et al.Genetically－engineered mesenchymal stem cells transfected with human HCN1 gene to create cardiac pacemaker cells［J］.J Int Med Res，2013，41(5):1570－1576.

［8］ Boink GJ，Nearing BD，Shlapakova IN，et al.Ca(2+)－stimulated adenylyl cyclase AC1 generates efficient biological pacing as single gene therapy and in combination with HCN2［J］.Circulation，2012，126(5):528－536.

［9］ Occhetta E，Bortnik M，Marino P.Usefulness of hemodynamic sensors for physiologiccardiac pacing in heart failure patients［J］.Cardiol Res Pract，2011，2011:925653.

［10］ Brubaker PH1，Kitzman DW.Chronotropic incompetence:Causes，consequences，andmanagement［J］.Circulation，2011，123 (9):1010－1020.

［11］ Sohail MR，Uslan DZ，Khan AH，etal.Managementand outcome of permanent pacemaker and implantable cardioverter－defibrillator infections［J］.JAm Coll Cardiol，2007，49(18):1851－1859.

Reprogrammed cardiom yocytes in treatment of bradycardia in rats

Hu Yan－nan，Xue Xiang，Zhang Hao，Lang Xi－long
Department of cardiothoracic surgery，Changhai Hospital，Second Military Medical University，Shanghai200433，China

Lang Xi－long，Email:langx1666@sohu.com

Objective To explore a new approach to treatment for bradycardia by transplanting Tbx18 gene to the apex of the LV in ratsmodel of sinoatrial node damage.M ethods Twenty－four ratswere randomed into test group and control group.Rats in test group were injected with Tbx18 and those in control group were injected with GFP，the heart rhythm of each group and catecholamine－responsive were observed.Western blot and immunofluorescence were tested for themyocardium of the injection site.Results The heart rates in test group were faster than control group and the rhythm originated from the injection site.The rhythm in test group was faster than control group after isoprenaline injected.Western blot and immunofluorescence studies showed that the expression of Tbx18 in test groupare was higher than control group.Conclusion Transplanting Tbx18 gene to apex of the LV can increase the rhythm of bradycardia in rats and this increase rhythm is sensitive to isoprenaline.

Tbx18 gene;Biological pacemaker;Gene therapy;Bradycardia

2016-09-26)

2016-10-24)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271707)

200082上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院胸心外科

郎希龍，E－mail:langx1666@sohu.com