摘要：為了探究細(xì)菌對錳的適應(yīng)機制，從松桃的錳冶煉區(qū)寨英鎮(zhèn)采集的土樣中分離得到7株耐錳能力達(dá)到1800mg/L的細(xì)菌，其中S7和S16兩株菌對錳的耐受能力高達(dá)2200mg/L。形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA 基因測序等分析結(jié)果表明，這些菌分屬于根癌土壤桿菌、沙福芽孢桿菌、根瘤菌屬和氧化節(jié)桿菌。在錳脅迫條件下，測定菌株S7的生長曲線、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性和電導(dǎo)率。結(jié)果表明：在無錳條件下，細(xì)菌的生長速度很快，14～18小時后就進(jìn)入穩(wěn)定期，在錳脅迫條件下，菌株的生長速度明顯減慢，S7菌株的SOD、CAT酶活性在10～18小時時升高，但電導(dǎo)率變化不大。推測耐錳細(xì)菌可能通過上調(diào)氧化還原酶的活性適應(yīng)錳脅迫。這對揭示細(xì)菌耐受錳的生理機制和錳污染的微生物修復(fù)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：錳抗性細(xì)菌；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；錳適應(yīng)

中圖分類號：Q93-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）03-0023-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.03.004

Abstract：In order to explore the mechanism of the adaptation of bacteria to manganese，seven strains of bacteria were isolated from the soil samples collected from a manganese smelting area in Zhaiying town of Songtao County，Guizhou ProvinceThese bacteria could survive in medium with Mn2+ concentration of more than 1800mg/L，with two strainsS7 and S16 tolerance of Mn2+ concentration up to 2200mg/LThese strains were classified into Agrobacterium tumefaciens，Bacillus safensis，Rhizobium spand Arthrobacter oxydans based on the morphology，physiology，biochemical characters and 16S rDNA gene sequencesUnder the condition of manganese stress，the growth curves，the activities of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT） and the conductivity of strain S7 were determinedThe results showed that strain S7 bacteria grew very fast under no Mn stress conditions and reached steady growth period after 14 to 18 hoursThe growth of S7 was clearly slowed down under the Mn stress conditionsThe enzyme activities of SOD and CAT reached their peaks after 1018 hours while the conductivity was unchangedIt is speculated that manganeseresistant bacteria may adapt to manganese stress by upregulating the activity of oxidoreductaseThis would provide the theoretical basis for revealing the physiological mechanism of bacteria tolerance to manganese stress and microbial remediation of manganese pollution

Key words：manganeseresistant bacteria；superoxide dismutase；catalase；manganese adaptation

貴州省松桃苗族自治縣的錳礦資源豐富，是我國三大錳礦基地之一，與相鄰的湖南花垣、重慶秀山形成我國有名的“錳三角”[1]。隨著錳礦的開采、冶煉，化肥制造和醫(yī)藥生產(chǎn)以及工業(yè)廢水排放等日益增多，水體和土壤中的錳含量日趨增多[2-4]，“錳三角”地區(qū)地下水的錳含量達(dá)到832±034mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國標(biāo)飲用水標(biāo)準(zhǔn)01mg/L[《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》（GB5749-2006）]，超標(biāo)率高達(dá)798%。由于重金屬的不可降解性，土壤中的重金屬通過地下水和食物鏈可長期威脅人類和野生動物的安全，因此錳是礦區(qū)周邊廣泛存在的環(huán)境污染物[5]。每一種重金屬只要超過了環(huán)境容量限度，都是有害的甚至是有毒的[6]。錳是生物體必需的微量元素之一，可作為多種酶的輔因子，為脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等代謝所需要[7-8]，但當(dāng)水中錳含量超過01mg/L時就會對人體造成危害，食用錳超標(biāo)的水和食物可導(dǎo)致生物機體慢性中毒，造成肝臟、肺等內(nèi)臟器官的損傷[9-11]。生物除錳技術(shù)中的微生物修復(fù)技術(shù)具有操作簡單、速度快、吸附容量大并且處理低濃度重金屬的效果好，愈來愈受到研究者的關(guān)注[12]。本文從礦區(qū)分離耐錳菌，研究菌株對錳脅迫的應(yīng)答和適應(yīng)機制，以期為土壤和水體錳污染的細(xì)菌修復(fù)技術(shù)奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

11實驗材料

錳污染土樣采自松桃縣寨英鎮(zhèn)錳冶煉區(qū)。除去土壤表面的動植殘渣，按四分法[13]采集0～20cm深度的土樣，樣品保存于自封袋，帶回實驗室進(jìn)行細(xì)菌分離。

培養(yǎng)基：試驗用MnCl2·4H2O為國產(chǎn)分析純試劑，配制505Mm/L的MnCl2·4H2O母液，過濾除菌。PYCM培養(yǎng)基：胰蛋白胨08g，酵母浸出粉02g，K2HPO401g，MgSO4·7H2O02g，NaNO302g，CaCl201g，（NH4）2CO301g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH68～70，10×105 Pa滅菌15min。固體培養(yǎng)基加入瓊脂 2%。

12試驗方法

121耐錳細(xì)菌的分離及純化稱取1g土壤樣品加入到250mL三角瓶中，加入9mL無菌水用磁力攪拌珠振蕩5～10min，土壤顆粒均勻分散于無菌水，靜置15min，吸取80μL上清液涂布于PYCM（Mn2+：200mg/L）平板上，28℃倒置培養(yǎng)。挑選菌落形態(tài)有差異，菌落特征典型、長勢較好的菌落，平板劃線法分離純化2～3次。挑取單菌落于PYCM液體培養(yǎng)基中，28℃，180 rpm培養(yǎng)24～48h，15%甘油保種。逐漸增加培養(yǎng)基中重金屬的濃度（700mg/L、800mg/L、1000mg/L直至2200mg/L），將初篩到的細(xì)菌接種于高濃度的錳鹽培養(yǎng)基中，28℃，倒置培養(yǎng)，編號并保存高耐受菌株。

122耐錳細(xì)菌的生理生化檢驗 將各菌株劃線法接種于PYCM培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2d。觀察細(xì)菌菌落的形狀大小、顏色、表面是否隆起和透明度。挑取針眼大小的單菌落于載玻片進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡觀察細(xì)菌菌體的形態(tài)。對細(xì)菌進(jìn)行淀粉水解、糖發(fā)酵、M-R、V-P、過氧化氫酶試驗、分化的檸檬酸鹽試驗、吲哚試驗和明膠液化等生理生化試驗。各項生理生化試驗的判斷參照生化鑒定管的顏色變化說明書和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

123耐錳細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對分離到的7株高耐受細(xì)菌的16S rDNA基因進(jìn)行PCR 擴增。擴增反應(yīng)體系（20μL）：2×Taq PCR Mix 10μL；基因組DNA15μL；上下游引物（10μmol/L）各05μL；無菌水75μL。擴增條件94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s；55℃ 30s； 72℃ 1min；30循環(huán)，72℃ 10min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物由英濰捷基公司（上海）測序。以鞘氨醇桿菌屬[15]為外群，用 MEGA5軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（NeighborJoining tree），系統(tǒng)發(fā)育樹可靠性檢測的自舉值設(shè)定為1000次。

124高耐受細(xì)菌對錳鹽的生理適應(yīng)選取一株高耐受細(xì)菌進(jìn)行錳鹽適應(yīng)性研究。將菌株培養(yǎng)至對數(shù)期作為種子液。在150mL/250mL PYCM液體培養(yǎng)基中接種對數(shù)期的種子液75mL，加入MnCl2·4H2O母液，使Mn2+的終濃度為250mg/L、500mg/L，28℃、180rpm培養(yǎng)，以未加Mn2+組為對照。檢測生長曲線、CAT、SOD酶活及電導(dǎo)率等指標(biāo)。其中SOD酶活性測定采用黃嘌呤氧化酶法測定，氧化氫酶酶活性測定采用鉬酸銨法，試劑均由南京建成生物工程研究所提供；電導(dǎo)率的測定則取細(xì)菌菌液各1mL放入燒杯中，加入20mL去離子水，25℃下靜置10h。再將試管放入100℃沸水中恒溫水浴15min，待其冷卻至25℃時，恒溫測定煮沸液電導(dǎo)率。電解質(zhì)相對滲透率（%）=（處理液電導(dǎo)率值/煮沸液電導(dǎo)率值）×100%。

2結(jié)果與分析

21錳耐受細(xì)菌的生理生化特性鑒定

用平板劃線法分離得到7株細(xì)菌，耐受能力達(dá)到1800mg/L，編號分別為S1、S2、S7、S15、S16、S20和S23，其中S7和S16耐受錳的濃度高達(dá)2200mg/L。生理生化鑒定結(jié)果見表1。由表可知，菌株S7呈革蘭氏染色陽性棒狀桿菌，接觸酶陽性，硝酸鹽還原陽性，能分解H2S、水解明膠，能利用葡萄糖氧化發(fā)酵，水解淀粉能力弱，與芽孢桿菌屬的生理生化特性相符；S15菌株菌落呈圓形，菌落突起，經(jīng)革蘭氏染色后菌體呈紅色桿狀，水解淀粉的能力弱，能利用賴氨酸、鳥氨酸作為氮源，符合根瘤菌屬的生理生化特性；S20呈革蘭氏陽性球菌，接觸酶陽性，葡萄糖、乳糖發(fā)酵不產(chǎn)酸，能水解明膠，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征及其生理生化特征，初步將S20菌株鑒定為節(jié)桿菌屬；S1、S2、S16和S23菌落呈乳白色圓形、突起、邊緣整齊、表面光滑，均為革蘭氏陰性桿菌，可利用葡萄糖作為碳源，水解淀粉能力弱，部分種需要添加氨基酸，根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征及其生理生化特征，初步將這四株菌鑒定為土壤桿菌屬。

22錳耐受細(xì)菌的分子系統(tǒng)學(xué)鑒定

提取各菌株的基因組DNA為模板，采用通用引物擴增16S rDNA基因序列， 得到約1400bp的片段（圖1），經(jīng)測序，S1、S2、S16和S23的目的序列與根癌土壤桿菌（HM_756197）的相似性最高，為99%；S7與沙福芽孢桿菌（NR_041794）的相似性達(dá)99%，S15與根瘤菌（NR_043985）的相似性為98%；S20與氧化節(jié)桿菌（NR_026236）的相似性達(dá)99%。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了S1、S2、S7、S15 、S16、S20和S23的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

23高耐受細(xì)菌的生理響應(yīng)

231生長曲線菌株S7于250mg/L和500mg/L錳濃度的條件下培養(yǎng)，測定生長曲線（圖3）。對照組細(xì)菌的生長速度很快，5h后進(jìn)入對數(shù)生長期，14～18h后就進(jìn)入平臺期。在錳濃度為250mg/L和500mg/L的條件下，細(xì)菌的生長明顯減慢。從圖中可以看出250mg/L的細(xì)菌生長量約為對照組的一半，500mg/L的條件下細(xì)菌的生長更慢。

232電導(dǎo)率的變化250mg/L和500mg/L的錳脅迫細(xì)菌，其電導(dǎo)率基本無差異。表明該株細(xì)菌能適應(yīng)低濃度錳的環(huán)境，細(xì)菌的細(xì)胞膜沒有受損。

233超氧化物歧化酶活性Mn2+對細(xì)菌S7的SOD活性的影響都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，不同濃度的重金屬錳的影響程度相似。在有錳脅迫的條件下，培養(yǎng)10h后，SOD活性開始上升，14h達(dá)到峰值，之后下降。在0～10h，細(xì)菌S7的SOD酶活性比率約為1左右，說明低濃度錳可促進(jìn)SOD發(fā)揮活性。

234過氧化氫酶活性Mn2+對細(xì)菌S7的CAT活性的影響都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖6），當(dāng)Mn2+脅迫14h時，CAT活性相對于對照組其比率明顯增加，到14h達(dá)到峰值后開始下降。在有錳條件下，低濃度錳促進(jìn)細(xì)菌S7的SOD發(fā)揮酶活性，SOD把氧自由基還原成H2O2，當(dāng)環(huán)境中H2O2含量增加時，則會刺激菌體分泌更多的CAT。則菌株S7的CAT活性比對照組的高，其與對照組的比率約在1左右。

3結(jié)論與討論

近年來，國內(nèi)外科研工作者開展了抗錳微生物的篩選與利用的科研工作，在微生物除錳研究中，多種細(xì)菌已被發(fā)現(xiàn)對錳離子有較好的耐受性和去除能力。從北京昌平錳礦舊址分離到1株錳氧化蠟樣芽孢桿菌CP133，其能在錳含量為10mmol/L環(huán)境中生長[16]；在陜西南寶錳礦尾礦土樣中分離得到的抗錳刺疣鏈霉菌，其抗錳最高質(zhì)量濃度達(dá)40mg/L [17]；從天津市西青區(qū)錳污染土壤中分離到的錳氧化菌Bacillus spMKS-1，其最低抑制濃度為20mmol/L [18]；從黑龍江省紅旗農(nóng)場富含高鐵高錳污染物的地下水井分離得到1株能夠氧化鐵錳的蠟狀芽孢桿菌，能在錳含量為200mg/L的環(huán)境中生長 [19]。本研究從松桃縣錳冶煉區(qū)分離得到7株耐錳細(xì)菌，它們的耐受錳濃度均能達(dá)到1800mg/L，其中S7和S16的耐受能力高達(dá)2200mg/L，顯著高于前文所述的耐受錳濃度，但低于Aminobacter spH1（錳耐受濃度高達(dá)50mmol/L）[20]。依據(jù)細(xì)菌16S rDNA分子鑒定，并結(jié)合細(xì)菌的菌落形態(tài)、革蘭氏染色和生理生化特征最終確定細(xì)菌的種屬名，其中S1、S2、S16和S23和鑒定為根癌土壤桿菌，S15為根瘤菌，S7為沙福芽孢桿菌，S20為氧化節(jié)桿菌。耐錳細(xì)菌由污染的土壤和水體中分離得到，細(xì)菌的耐受能力差異很大，從污染嚴(yán)重地區(qū)分離得到的細(xì)菌耐受能力普遍偏高。本文分離的細(xì)菌對錳的耐受性高于沙雷氏菌KM01、刺疣鏈霉菌、Bacillus spMKS-1和狀芽孢桿菌P1等菌株，這對擴充優(yōu)良抗性的細(xì)菌及對錳污染的微生物修復(fù)提供基礎(chǔ)及重要作用。

生命體在受到重金屬或高溫等不利環(huán)境脅迫時，會產(chǎn)生活性氧自由基，如過氧化氫、超氧化物和羥基自由基，誘導(dǎo)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[21-23]。本研究通過檢查細(xì)菌生長能力、SOD、CAT酶的活性變化來反映細(xì)菌對于重金屬環(huán)境的一種適應(yīng)性，從生理上揭示其耐受的機理。通過對高耐受錳的S7菌株的生理應(yīng)答研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌在沒有錳的環(huán)境中生長快，8h后就進(jìn)入穩(wěn)定期，在錳濃度為250mg/L條件下的生長量約0mg/L時的一半，500mg/L條件下細(xì)菌的生長速度更慢；說明高濃度的錳不利于細(xì)菌的生長；細(xì)菌在受到250mg/L錳脅迫時，電導(dǎo)率變化不大，提示細(xì)胞膜的通透性基本無變化，說明低濃度的錳脅迫對細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷不大，細(xì)胞膜能夠屏蔽外界對細(xì)菌生長的不利因素；細(xì)菌的SOD和CAT活性在錳脅迫14h達(dá)到峰值，說明細(xì)菌受錳脅迫后，細(xì)菌的氧化還原酶活性上調(diào)，并且可以提高細(xì)菌對錳脅迫的適應(yīng)性并存活下來。研究表明，SOD可以提高微生物受到的氧化應(yīng)激刺激，在重金屬脅迫中發(fā)揮重要的保護作用[24-25]。氧自由基可與DNA堿基或者脫氧核糖骨架等細(xì)胞成分相互作用，形成8-OH-dG致使堿基突變或DNA鏈斷裂，并且可氧化脂質(zhì)或蛋白質(zhì)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響細(xì)胞的生存[26]。細(xì)菌中SOD和CAT活性升高有利于清除氧自由基，SOD能清除，將其還原成H2O2，而CAT則能有效地把H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，降低氧自由基的毒性，減小Mn2+的毒害作用，增強細(xì)菌對Mn2+的耐受性和適應(yīng)性。菌株S7在高濃度的錳鹽脅迫時，能夠生存，并形成S形的生長曲線，間接證明，細(xì)菌中的CAT和SOD升高對細(xì)菌起到了保護作用。

從松桃縣的錳冶煉區(qū)寨英鎮(zhèn)采集的土樣中分離得到7株高耐錳細(xì)菌，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征，生理生化特性和分子系統(tǒng)學(xué)分析，S7菌株鑒定為沙福芽孢桿菌，S15為根瘤菌屬細(xì)菌，S20為氧化節(jié)桿菌，S1、S2、S16和S23鑒定為根癌土壤桿菌。對高耐受菌株S7進(jìn)行錳鹽脅迫，發(fā)現(xiàn)在無錳條件下，細(xì)菌的生長速度很快，在有錳條件下，生長相對較慢，細(xì)菌在錳濃度250mg/L條件下的生長量約為無錳條件的一半；菌體受錳脅迫后，細(xì)胞通過SOD、CAT酶活性的改變，維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。

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