黨澤方，譚紅勝，付文衛(wèi)＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

LC-MS技術在藤黃屬植物化學成分研究中的應用＊

黨澤方1，2，譚紅勝1，2，付文衛(wèi)1，2＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學中藥學院上海201203；2.中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)上海高校工程研究中心上海201203）

藤黃屬植物有著重要的經濟及藥用價值，一直以來都作為食品和民間藥物被廣泛使用，隨著現(xiàn)代分析技術的發(fā)展，越來越多的植物化學研究也應用于藤黃屬植物，其中，液相色譜-質譜聯(lián)用（LC-MS）技術以其快速、精確等特點，被越來越多的研究者用于藤黃屬植物的化學研究。本文根據已發(fā)表文獻，通過總結LC-MS技術在藤黃屬植物化學成分的定性研究、輔助發(fā)現(xiàn)新化合物，以及定量研究等方面的應用進展，闡述LC-MS技術在藤黃屬植物化學研究中的研究現(xiàn)狀，為今后藤黃屬植物化學研究工作提供一定參考。

藤黃屬植物LC-MS定性研究定量研究植物代謝組學

藤黃屬植物（Garcinia Linn.）約有450種，產于熱帶亞洲、非洲南部及波利尼西亞西部。其中，分布于中國的有21種，產自臺灣南部、福建、廣東、海南、廣西南部、云南南部和西南部至西部、西藏東南部、貴州南部及湖南西南部[1]。該屬植物中的主要活性物質包括■酮類（xanthones）、多環(huán)多異戊烯基間苯三酚類化合物（Polycyclic Polyprenylated Acylphloroglucinols，PPAPs）、雙黃酮類（biflavonoids）等化合物[2]。

LC-MS聯(lián)用技術是繼GC-MS聯(lián)用技術之后又一新興的分離檢測技術，近年來發(fā)展極為迅速，在生命科學、環(huán)境科學、法醫(yī)學、商檢等領域得到了廣泛應用。LC-MS技術在具有液相色譜對復雜樣品的分離能力的同時又具有質譜高靈敏度、高選擇性和提供相對分子質量和碎片結構等優(yōu)點，被廣泛應用于復雜樣品的分析。LC-MS接口裝置可以分為電噴霧（Electrospray Ionization，ESI）、大氣壓化學電離（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，APCI）和大氣壓光電離（Atmospheric Pressure Photoionization，APPI）等；根據質量分析器的不同又分為單級四極桿質譜（Quadrupole Mass Spectrometry，QMS）、三級四極桿質譜（Triple Quadrupole Mass Spectrometry，TQMS）、離子阱質譜（Ion Trap Mass Spectrometry，ITMS）、飛行時間質譜（Time of Flight，TOF）及傅立葉變換質譜（Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance，F(xiàn)TICR）等；此外，為了得到更多結構信息，LC-MS的質譜部分經常采用串聯(lián)質譜技術，例如Q-TOF、TOF-TOF、Q-Trap、IT-TOF等[3，4]。本文綜合近幾年發(fā)表的運用LC-MS技術研究藤黃屬植物相關文獻，對在LC-MS技術應用于藤黃屬植物化合物鑒定中發(fā)現(xiàn)的新思路、新方法加以闡述，對今后藤黃屬植物的化學研究提供一定的指導。

1 運用LC-MS定性鑒別藤黃屬植物中的化合物

1.1 定性分析藤黃屬植物中成分

藤黃屬植物中含有■酮類（xanthones）、多環(huán)多異戊烯基間苯三酚類化合物（PPAPs）類化學成分，其質譜的裂解規(guī)律并不相同。通過不同的裂解規(guī)律和特征碎片，往往可以對這兩類化合物進行鑒別。另外，QTOF往往提供了準確的分子量信息，進行可以獲得相應化合物的分子式，可以用于已知化合物的快速鑒定。因此，LC-MS技術經常作為藤黃屬植物化合物的定性研究常用手段。此外還有研究者利用LC-MS技術分析藤黃屬植物中活性化合物在體內的代謝物，分析其在體內的藥物代謝動力學特征。

Zhou Y等[5]應用HPLC-ESI-QTOF-MS/MS/MS從版納藤黃中分析鑒定出15種多異戊烯基取代的■酮類化合物，本研究中MS/MS用來分析分子離子及其產生的碎片離子，而三級質譜則用來進一步分析碎片離子，由此可發(fā)現(xiàn)■酮骨架的逆狄爾斯-阿爾德重排和與其相關的碎片離子，從而可以區(qū)分A環(huán)或B環(huán)含異戊二烯結構的位置異構體。JiX H等[6]利用液相-光二極管陣列（Liquid Chromatography-Photodiode Array，LC-PDA）檢測器對莽吉柿中6種■酮類化合物（3-isomangostin，8-desoxygartanin，gartanin，α-mangostin，9-hydroxycalabaxanthone，β-mangostin）進行定量檢測，并進一步利用LC-TOF-MS將6種■酮類化合物標準品峰與莽吉柿中對應的6種化合物進行比較，確認莽吉柿中所含的6種化合物與標準品相同，從而得出一種對莽吉柿中這6種■酮類化合物的定量檢測方法。Thomas Michel等[7]將離心分配色譜（Centrifugal Partition Chromatography，CPC）與HPLC-DAD-MS在線連接，此方法可以在離心分配色譜將植物粗提物分餾的同時，利用HPLC-DAD得到各個組分的指紋圖譜信息并通過MS得到各組分中化合物的結構信息，作者采用這種串聯(lián)方法從莽吉柿乙醇提取物中得到33mg純度98%的α-mangostin和6 mg純度98.5%的γmangostin，此外，還從莽吉柿醇提物中得到其他16種■酮，其中10種通過紫外圖譜和質譜數(shù)據進行了結構確定。周安等[8]采用HPLC-PDA-ESI/MSn聯(lián)用技術分離并檢測出藤黃藥材中的16種化合物，并且根據色譜保留時間、PDA光譜圖、MS獲得的準分子離子峰及碰撞誘導裂解（Collision-induced Dissociation，CID）技術獲得碎片峰信息，結合文獻鑒定了其中10種化合物的可能結構，該研究還采用HPLC-ESI/MS研究新藤黃酸和藤黃酸在正離子檢測方式下的一級質譜和多級質譜，歸納其碎裂規(guī)律。Han SY等[9]采用UPLC-MS/MS測定莽吉柿中活性成分α-Mangostin在小鼠體內的代謝成分，以此來推測α-Mangostin在體內的ADME特征，為α-Mangostin的臨床前研究提供重要的基礎。

Zhou Y等[10]采用UPLC-QTOF-Precursor Ion Discovery（PID）從9種藤黃屬植物的29個樣品中快速鑒定9種含有特征碎片m/z177.02產物離子的PPAPs，包含兩類同分異構體，其中一類包括6種PPAPs（分子質量602.360 7），另外一類包括3種PPAPs（分子質量670.423 3）。Zhang H等[11]利用UPLC-IM-MSE和UPLC-IM-MS/MS從嶺南山竹子中檢測出140種PPAPs，該研究根據兩個PPAPs診斷離子m/z165.018 2和m/z177.018 2快速掃描分析得到140種PPAPs，其中10種利用保留時間，一級質譜和二級質譜數(shù)據進行鑒定，7對高分辨質譜不能區(qū)分的共洗脫同分異構體利用UPLC-IM-MS被區(qū)分開，這種策略也為其他復雜成分樣品的快速共洗脫同分異構體提供了解決方法。

1.2 結合代謝組學方法分析藤黃屬植物中的化學成分

代謝組是指某一細胞、組織或機體在一定的生理或環(huán)境條件下所有低分子量的代謝產物（基因表達產物），植物代謝組學則是通過整體分析的方法對植物代謝物組同時進行無偏定性和定量分析[12]。Fiehn[12]把廣泛應用于植物的代謝組學研究策略分為4個層次，即代謝物靶標分析、代謝物譜分析、代謝物組分析和代謝指紋分析。植物代謝組學高通量檢測分析植物中的代謝物成分必然產生大量的數(shù)據，需要采用生物信息學方法從中獲取有意義的信息。目前常用的數(shù)據分析方法有主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA）、層次聚類分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）、自組織映射網絡（Self-organizing Map，SOM）等非監(jiān)督方法，以及偏最小二乘法-判別（Partial Least Squares-Discrimination，PLS-DA）、k-最近鄰法、神經網絡（NeuralNetwork，NN）等監(jiān)督方法[13]。

Timo D S等[14]利用UPLC-ESI-TOFMS分析食物保健品Garcinia buchananii三個部位根、樹皮、葉的代謝物成分，結合PCA和OPLS-DA發(fā)現(xiàn)，GB-1、morelloflavone和volkensiflavone等黃酮類化合物主要在葉、根中■酮類化合物含量最高，manniflavanone等黃酮類化合物在樹皮中含量較高。Morelloflavone、volkensiflavone和garcicowin C表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，可能為Garcinia buchananii抗氧化成分。Li P等[15]利用UPLC-QTOF-MS和MSE從嶺南山竹子的葉、枝和果實中鑒定出40種雙黃酮、■酮和苯甲酮類化合物，并結合熱圖（Heatmap）分析和PCA分析發(fā)現(xiàn)三個部位間化學成分存在較大差異，■酮類化合物在枝中含量最高，細胞毒實驗和抗氧化實驗結果也顯示枝提取物活性最強，這提示■酮類化合物可能是嶺南山竹子中主要的活性成分，該研究還利用OPLS-DA結合S-plots分析，發(fā)現(xiàn)12種標志化合物，其中10種為■酮類化合物和2種雙黃酮類化合物。

表1 四級質譜法與飛行時間質譜法定量分析比較

2 利用LC-MS技術輔助發(fā)現(xiàn)藤黃屬植物中的新化合物

由于藤黃屬xanthones和PPAPs兩類化合物有其特征的質譜裂解規(guī)律和特征碎片，因而常用來指導化學成分的分離工作。以LC-MS為導向的提取分離工作，可以有效的避免傳統(tǒng)方法的盲目性，能夠快速有效的發(fā)現(xiàn)可能的新化合物，提高提取分離工作效率。

Yang J等[16]采用LC-MS/MS從藤黃樹脂中分析檢測出34種籠狀■酮類化合物，并推測18種可能是新化合物，本研究包含三個部分：①根據已知的籠狀■酮結構和生物合成知識來預測藤黃樹脂中可能的未知籠狀■酮結構；②根據已知的藤黃籠狀■酮類化合物的診斷碎片離子（Diagnostic Fragment Ions，DFIs）進行結構分類；③運用多種質譜掃描模式對藤黃樹脂中的目標和非目標籠狀■酮進行檢測和表征。

Zhang H等[11]利用PPAPs質譜特征離子峰，對嶺南山竹子中PPAPs成分進行快速篩選，根據保留時間、分子碰撞截面積（Collision Cross-Section，CCS）、精確的母離子和子離子質量和二級質譜數(shù)據，發(fā)現(xiàn)129種未見報道的潛在新PPAPs化合物，運用此方法可以快速篩選藤黃屬植物中的PPAPs化合物，發(fā)現(xiàn)其中潛在的新型結構。

Li P等[17]利用UPLC-QTOF-MSE技術對金絲李種子乙醇提取物硅膠柱分段的9個部分分別進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中31個峰可能包含新的苯甲酮類衍生物，通過SciFinder數(shù)據庫檢索排除其中19個峰，其余12個峰經過綜合分析，推斷出6個基本的結構單位，而后通過Sephadex LH-20和制備HPLC等手段，從相應粗提物部分得到5個新的苯甲酮類化合物，其結構通過NMR、 MS、IR和ECD光譜得以確定。

3 LC-MS技術應用于定量檢測藤黃屬植物化學成分

質譜檢出的離子流強度與離子數(shù)目成正比是質譜定量的基本原理，通過離子流強度的測量可進行定量分析。LC-MS數(shù)據采集形式主要有：總離子流（Total Ion Current，TIC）、選擇離子監(jiān)測（Select Ion Monitoring，SIM）、選擇反應監(jiān)測（Selected Reaction Monitoring，SRM）和多反應監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）等，也可以從TIC中提取待測離子的離子流，即提取離子流（Extraction Ion Current，EIC）進行定量。質譜定量分析可采用內標法和外標法，因內標法可減少儀器誤差，因此質譜定量分析常采用內標法。四級桿質譜法和飛行時間質譜法是兩種最常用的定量質譜法，表1是兩種方法的比較。藤黃屬植物的質譜定量研究主要集中于兩種結構相似的化合物的定量測定，或者定量測定不同藤黃屬植物中某類化學成分的含量。

Bharate JB等[18]從印度藤黃果實中提取出一對同分異構體garcinol和isogarcinol，采用LC/ESI-MS/MS的MRM模式對兩種化合物進行定量分析，garcinol的定量限和檢測限分別為0.06 ng·mL-1和0.021 ng·mL-1，isogarcinol定量限和檢測限分別為0.05 ng·mL-1和0.017 ng·mL-1，而后作者對印度藤黃果實不同溶劑提取物中的garcinol和isogarcinol進行定量分析，定量結果良好。Chattopadhyay SK等[19]利用已知方法從印度藤黃果皮中提取純度98%的xanthochymol和isoxanthochymol，采用LC-MS/MS的MRM模式對兩種化合物進行定量分析，xanthochymol在5-125 ng·mL-1線性良好（R2=0.997 3），檢測限為1 ng·mL-1，isoxanthochymol在4-50 ng·mL-1線性良好（R2= 0.997 8），檢測限為0.5 ng·mL-1。此外，該研究還對印度藤黃和藤黃果不同部位兩種化合物含量進行測定定量結果良好，結果表示本方法可作為xanthochymol和isoxanthochymol快速精確的定量方法。

Pandey R等[20]利用UPLC-QqQLIT-MS/MS的MRM模式對11種不同藤黃屬植物葉中26種活性成分進行定量測定，該研究中26種活性化合物標準品經HPLC測定純度均在95%以上，化合物結構經MS和NMR進行確認，26種化合物標準曲線線性良好（R2＞0.999）,日間和日內精密度RSD≤1.93%，回收率范圍是95.45%-104.43%，且RSD≤1.89%，研究中作者還根據定量數(shù)據結合PCA和HCA對11種藤黃屬植物的活性化合物含量進行比較，結果顯示11種植物存在顯著的生物差異。

Zhou Y等[21]利用UPLC-Q-TOF定量測定了來自10種藤黃屬植物的32個樣品中的16種PPAPs，16種PPAPs都為作者實驗室以往分離提取所得，經HPLCDAD和UPLC-MS測定純度均在95%以上，該實驗中16種PPAPs檢測限為2.7-21.4 ng·mL-1，日間和日內精密度RSD≤3.7%，回收率89%-107%（RSD≤9.0%），實驗結果表明本研究方法適用于藤黃屬植物中PPAPs的精確定量測定。

4 總結與展望

藤黃屬植物一直以來作為民間用藥和食物保健品被廣泛用于中外各國，很多種從藤黃屬植物中提取分離的化合物因其抗氧化、抗腫瘤及免疫活性收到越來越多研究者的關注。而隨著LC-MS技術的不斷進步發(fā)展，專注于藤黃屬植物的研究者也將這一技術從不同方面應用于藤黃屬植物化合物的定性、定量及新化合物發(fā)現(xiàn)的研究工作中，從本文所引文獻中可以發(fā)現(xiàn)近幾年來，LC-MS技術應用于藤黃屬植物的研究深度和廣度在大大增加，各種新思路新方法不斷涌現(xiàn)。相信隨著LC-MS技術的不斷發(fā)展，LC-MS與其他技術手段聯(lián)合應用的開發(fā)，LC-MS技術應用于藤黃屬植物的研究工作必將更加廣泛更加深入。

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TheApplication of LC-MSTechnique to the Chem icalCom ponentAnalysisof Garcinia Linn.

Dang Zefang1,2,Tan Hongsheng1,2,FuWenwei1,2
(1.SchoolofPharmacy,ShanghaiUniversity ofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China; 2.Engineering Research CenterofShanghaiCollegesforTCM New Drug Discovery,Shanghai201203,China)

Various species of Garcinia Linn.have been widely used as food and folk medicines,for their significant economic and pharmaceutical values.As the development ofmodern analysis technology,many phytochemistrymethods were applied in the research of Garcinia Linn.,in which especially the liquid chromatography coupled with mass spectrometry(LC-MS),was increasingly used in chemical study for its rapid and accurate analysis.In this article,based on the published articles,the LC-MSmethodsused in the study of Garcinia Linn.,including the qualitative analysis,new compounds discovery and quantitative analysis were reviewed,and it would provide some information for the study of Garcinia Linn.in the future.

Garcinia Linn.,liquid chromatography coupled with mass spectrometry,qualitative analysis,quantitative analysis,plantmetabolomics

10.11842/wst.2017.02.012

R93

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2017-02-20

修回日期：2017-02-20

＊上海中醫(yī)藥大學預算內項目（2013JW08）：單花山竹子抗腫瘤活性成分研究，負責人：付文衛(wèi)；中藥學一流學科創(chuàng)新基金（ZYX-CXYJ-012）：單花山竹子、大苞藤黃以及大果藤黃抗腫瘤有效部位的化學成分及作用機制研究，負責人：付文衛(wèi)。

＊＊通訊作者：付文衛(wèi)，副研究員，碩士研究生導師，主要研究方向：中藥活性成分研究。