宮 璐，白俊其，蘇 賀，張 鵬，肖水明，李西文，黃志海＊＊，徐 江＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

側(cè)柏葉煮散飲片煎煮質(zhì)量評價＊

宮 璐1，白俊其1，蘇 賀1，張 鵬2，肖水明2，李西文2，黃志海1＊＊，徐 江2＊＊

（1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院/中國中醫(yī)科學(xué)院廣東分院 廣州 510006；2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：對比側(cè)柏葉煮散飲片與市售原飲片煎煮質(zhì)量。方法：應(yīng)用ITS2序列作為DNA條形碼對側(cè)柏葉進(jìn)行分子鑒定，采用化學(xué)指紋圖譜表征藥材化學(xué)組成，評價市售飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的相似度，測定指標(biāo)成分槲皮苷的含量，標(biāo)定指紋圖譜共有峰。同時，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法，比較市售飲片及精準(zhǔn)煮散飲片的煎煮效率，對煮散體系進(jìn)行綜合評價。結(jié)果：ITS2序列對側(cè)柏葉藥材可實現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定。與原飲片比較，煮散飲片煎煮效率有所增加，且指紋圖譜相似度有所提高，但按標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法，煮散飲片出膏率增加20%左右，指標(biāo)性成分槲皮苷的含量未有顯著增長，其余化學(xué)成分的煎出率也沒有明顯變化。結(jié)論：精準(zhǔn)煮散飲片在一定程度上有利于提高側(cè)柏葉的煎煮效率及藥材均一性。

中藥精準(zhǔn)煮散飲片 DNA條形碼 側(cè)柏葉 均一性 指紋圖譜

中藥“煮散”一詞始載于唐·孫思邈《備急千金藥方》，其使用歷史可追溯至先秦時期[1，2]。古人將藥材用重器搗碎、刀具切銼成小碎片或粗顆粒后再進(jìn)行煎煮，使煎煮時“藥力盡出”。煮散于唐末至五代十國得以快速發(fā)展；至宋代，已盛行，得到了廣泛的推廣與應(yīng)用；后因粗末導(dǎo)致的“辨藥之難”以及生產(chǎn)發(fā)展、藥材供應(yīng)增多，逐漸被飲片所代替。經(jīng)過數(shù)百年的發(fā)展，逐步形成了現(xiàn)在通行的常規(guī)飲片形制和加工體系。

中藥材是中國傳統(tǒng)的特產(chǎn)資源，隨著人們對身體健康及保健有越來越高的需求，中藥材的需求量不斷上升。然而，如今中藥資源卻在逐漸減少，有的品種資源嚴(yán)重匱乏，在巨大的利益驅(qū)動下中藥材的摻假、混雜現(xiàn)象逐漸增多，中藥材質(zhì)量得不到保障。加之歷史和地區(qū)習(xí)俗等多種原因，歷代草本和各地方標(biāo)準(zhǔn)對很多中藥材的基源植物記載均不相同，存在嚴(yán)重的“一名多藥”、“同名異物”現(xiàn)象，造成如今中藥材市場混亂的現(xiàn)象。

中藥材質(zhì)量的保證是臨床用藥安全、有效、穩(wěn)定的前提，而中藥材質(zhì)量控制是一項復(fù)雜而艱巨的工程。隨著DNA分子鑒定技術(shù)及指紋圖譜技術(shù)的普遍應(yīng)用，“辨藥之難”已不再成為阻礙[3]。根據(jù)當(dāng)前中藥材市場的情況，我們提出了“精準(zhǔn)煮散飲片”的理論體系，基于傳統(tǒng)煮散用藥方式，生產(chǎn)批內(nèi)質(zhì)量均一的中藥粗顆粒或粗末飲片，形成質(zhì)量信息準(zhǔn)確識別溯源，使中醫(yī)臨床療效評價“有跡可循，有證可依”，結(jié)果更為可靠[4]，同時可達(dá)到節(jié)約資源的目的。

本研究以常用中藥側(cè)柏葉為例，對精準(zhǔn)煮散飲片用藥形式進(jìn)行探索研究。對比傳統(tǒng)切片與煮散飲片的含量均一性、煎煮效率，同時以DNA分子鑒定技術(shù)為鑒別手段，研究側(cè)柏葉質(zhì)量控制方法，以期揭示中藥材煮散飲片應(yīng)用的合理性和優(yōu)勢。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

2469型高效液相色譜儀系統(tǒng)（美國Waters公司）；Empower 色譜工作站；BT125D型電子分析天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）；HTP-312電子天平；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；5430R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；中藥材粉碎機(jī)；R1002B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；ProFlex型 PCR儀（美國Life Technologies公司）；Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）；GelDoc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；1-14 小型離心機(jī)（德國Sigma公司）；MX-RL-E型混合儀（大龍興創(chuàng)儀器有限公司）。

1.2 試藥

槲皮苷（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，生產(chǎn)批號：20140315）； DP305植物組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）；DL 2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；Glodview（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；Tris-HCl（上海麥克林生化科技有限公司，生產(chǎn)批號：T818979）；Tris（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：V900483）；β-巰基乙醇（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：M6250）；瓊脂（美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：V900500）；引物由上海美吉生物科技有限公司合成，2×Taq PCR Mix酶（北京艾德萊生物科技有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純；水為超純水；其余均為分析純。

側(cè)柏葉（康美藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地：廣東，批號：0300421、160512161、160803911），經(jīng)廣東省中醫(yī)院黃志海主任中藥師鑒定均為2015年版《中國藥典》（一部）側(cè)柏葉項下收載品種。

2 實驗方法

2.1 DNA 分子條形碼鑒定

選取飲片樣本約40 mg，用組織研磨儀磨碎，采用植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組總DNA。ITS2序列擴(kuò)增采用正向引物ITS2F： 5‘-ATGCGATACTTGGTG TGAAT-3’，反向引物：ITS3R： 5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序與文獻(xiàn)一致[6]。產(chǎn)物采用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，將電泳條帶清晰、明亮、單一的PCR產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行雙向測序。所得序列采用Codon Code Alinger 6.02軟件進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量區(qū)并采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S 和28S區(qū)段，獲得完整的ITS2序列。利用軟件MEGA 6.06分析比對，分析ITS2序列特點[5]。

2.2 原飲片與煮散飲片出膏率比較

取側(cè)柏葉原飲片（批號：160300421），粉碎，過篩，取5-10目（2-4 mm）、10-24目（0.8-2 mm）、24-65目（0.25-0.8 mm）等不同粒徑范圍的煮散飲片。

稱取原飲片及不同規(guī)格煮散飲片各100 g，采用標(biāo)準(zhǔn)湯劑的方法[7]進(jìn)行煎煮。所得提取液減壓旋蒸至100 mL，即濃縮為相當(dāng)于側(cè)柏葉飲片1 g·mL-1的溶液。蒸發(fā)皿烘干至恒重，精密量取25 mL溶液，蒸干，105℃保持3 h，稱重，計算得干浸膏重量和藥材出膏率。

2.3 HPLC檢測方法

2.3.1 色譜條件的建立

色譜柱：ODS-3 C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：0.1%的甲酸（A）與乙腈（B），梯度洗脫：0-10 min，95% A；10-20 min，95%-90% A；20-35 min，90%-86% A；35-40 min，86%-85% A；40-50 min，85-80% A；50-60 min，80%-79% A；60-80 min，79-75% A；檢測波長：256、286 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液的制備

精密稱取槲皮苷對照品適量，加超純水濃度為10、20、30、40、60 μg·mL-1槲皮素系列標(biāo)準(zhǔn)液，置于冰箱中4℃保存，備用。精密量取適量飲片提取液，用水稀釋成相當(dāng)于側(cè)柏葉飲片0.02 g·mL-1的供試品溶液。

2.3.3 考察線性關(guān)系

按照“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析。以對照品峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，計算回歸方程，考察槲皮苷在上述色譜條件下的線性關(guān)系。

2.4 原飲片與煮散飲片均一性比較

圖1 側(cè)柏葉市售原飲片及精準(zhǔn)煮散飲片形態(tài)

表1 傳統(tǒng)市售飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率（±s，n=3）

表1 傳統(tǒng)市售飲片與精準(zhǔn)煮散飲片出膏率（±s，n=3）

注：與原飲片比較，*P＜ 0.05；“+”：澄清或有糊化現(xiàn)象；“-”：無糊化現(xiàn)象。

飲片規(guī)格出膏率/%澄清度糊化度市售原飲片16.49±0.33 + -5-10目（2-4 mm）17.79±0.05 + -10-24目（0.8-2 mm）21.03±0.12* + -24-65目（0.25-0.8 mm）21.60±0.16* + +

飲片共分為3組：A組為原飲片組，分別取3個批次側(cè)柏葉飲片（S1：0300421，S2： 160512161，S3：160803911）各50 g；B組為混合原飲片組（S4-S6），取等份量的上述3個批次側(cè)柏葉飲片，充分混合，均勻攤平，畫格分為9份，隨機(jī)選取3份，從每份中分別稱取50 g；C組為煮散飲片組（S7-S9），取等份量的上述3個批次側(cè)柏葉飲片，混合，粉碎后過篩，取10-65目粒徑范圍煮散飲片，均勻攤平，畫格分為9份，隨機(jī)選取3份，從每份中分別稱取50 g。上述9份樣品分別按標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法進(jìn)行提取。合并提取液，定容至500 mL，即為相當(dāng)于飲片0.1 g·mL-1的藥液。精密量取藥液并用水稀釋5倍，采用0.22 μm濾膜過濾，取10 μL進(jìn)樣。

2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩兩比較時，采用獨(dú)立樣本t檢驗。選取顯著性水準(zhǔn)α = 0.05，組間差異判斷以P＜ 0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 ITS2序列分析

應(yīng)用MEGA6.06分析側(cè)柏葉3條ITS2序列特征，發(fā)現(xiàn)無種內(nèi)變異位點。側(cè)柏葉序列長度為220 bp，A、C、 G、T的堿基含量分別為15.91%、30.00%、35.00%、19.09%，GC含量達(dá)65.00%。以條形碼、二維碼的方式展示主導(dǎo)單倍型序列特征[8]，由圖2可見，左側(cè)為DNA序列轉(zhuǎn)換而成的彩色條形碼圖片，右側(cè)二維碼圖片為QRcode的編碼方式進(jìn)行編碼，掃描可讀取序列信息。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索（https：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）結(jié)果顯示各樣品相似性最高的為側(cè)柏Platycladus orientalis，與其最相似序列的相似度為100%。

3.2 不同規(guī)格飲片出膏率考察

對出膏率考察結(jié)果表明，與原飲片比較，粉碎后不同粒徑煮散飲片的出膏率均有增加；不同粒徑的出膏率略有差異，其中10-24目、24-65目出膏率較高，實驗結(jié)果見表1。

3.3 色譜條件考察

將對照品溶液及供試品溶液按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)該色譜條件下槲皮苷分離度良好，對照品及提取液色譜圖見圖3。以對照品峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=27257X-11125 (R2= 0.999)，表明槲皮苷在10-60 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 飲片均一性評價

以槲皮苷為考察指標(biāo)，測定其在原飲片混合前后及煮散飲片的含量（表2）。由表2可知，3個批次間飲片的槲皮素含量差異較大，混合后原飲片及煮散飲片后均一度有所提高，而指標(biāo)成分煎出率升高不明顯。

3.5 指紋圖譜相似度評價

按照“2.3.1”項下含量測定方法，對側(cè)柏葉飲片水提液進(jìn)行指紋圖譜的測定，經(jīng)檢測，286 nm處水提液檢出成分最多，因此采用286 nm處色譜圖進(jìn)行指紋圖譜的比較分析（圖4）。采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004A版），生成指紋圖譜共有模式，計算樣品的相似度。結(jié)果顯示，不同市售飲片的指紋圖譜相似度有一定差異，混合后指紋圖譜相似度提高（表3、表4、表5）。

圖2 側(cè)柏葉ITS2主導(dǎo)單倍型序列

3.6 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

本次研究中槲皮苷含量最高，且是2015版《中國藥典》（一部）側(cè)柏葉項下含量測定所規(guī)定的指標(biāo)性成分，因此確定以槲皮苷為參照峰（峰20）。其余各峰的峰面積與槲皮苷峰面積比值定義為相對峰面積。經(jīng)相似度軟件匹配后發(fā)現(xiàn)286 nm處共有峰有23個（表6）。

4 討論

現(xiàn)代研究表明，側(cè)柏葉的主要成分是揮發(fā)油，黃酮、鞣質(zhì)等[9]，2015版《中國藥典》（一部）以黃酮類成分槲皮苷為含量測定的指標(biāo)成分[10]，經(jīng)檢測該成分是側(cè)柏葉水提液中含量最高的成分。因此，本研究以槲皮苷為含量均一性測定的指標(biāo)成分。

本研究采用3D色譜對側(cè)柏葉指紋圖譜條件進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)側(cè)柏葉成分復(fù)雜，但大部分成分含量較低。對比后發(fā)現(xiàn)，藥材水提液286 nm處檢出成分最多，因此采用286 nm處色譜圖進(jìn)行指紋圖譜的比較，比對后可發(fā)現(xiàn)23個共有峰。該方法可最大限度的檢出側(cè)柏葉水提液成分，為該藥質(zhì)量控制提供有效的方法。由于中藥成分復(fù)雜，有效成分種類繁多，采用一個吸收波長項下的指紋圖譜可能并不全面，可采用多個吸收波長指紋圖譜進(jìn)行對比研究，建立更為嚴(yán)格全面的質(zhì)量控制方法。

圖3 槲皮苷對照品（A）、側(cè)柏葉水提液（B）256 nm處色譜圖

本研究采用中藥側(cè)柏葉對精準(zhǔn)飲片用藥形式進(jìn)行探索，結(jié)果顯示，所取市售3個批次樣本的批間差異較大；經(jīng)混合處理后，批間差異明顯減??；經(jīng)粉碎處理成煮散飲片后，批間差異與直接混合后相似。對比煮散飲片及市售飲片發(fā)現(xiàn)，煮散飲片的出膏率有所增加，指紋圖譜相似度有所提高，說明精準(zhǔn)煮散飲片在一定程度上有利于提高側(cè)柏葉的煎煮效率及藥材均一性。按標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮法，指標(biāo)性成分槲皮苷的含量未有顯著增多，其余化學(xué)成分的煎出率也沒有太大變化。這可能與側(cè)柏葉原飲片本身粒度較小有關(guān)，說明原飲片與煮散飲片煎煮效率基本一致。

表2 原飲片與精準(zhǔn)煮散飲片提取液中槲皮苷含量（n= 3）

圖4 市售傳統(tǒng)飲片及混合后精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

表3 市售傳統(tǒng)飲片指紋圖譜相似度

表4 混合后的傳統(tǒng)飲片指紋圖譜相似度

表5 混合后的精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度

表6 286 nm處共有峰相對峰面積比較

1 孫思邈. 備急千金要方. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2011：128-156.

2 徐海波. 中藥煮散源流考. 河北中醫(yī)藥學(xué)報,1999,4：11-13.

3 陳士林,宋經(jīng)元. 本草基因組學(xué). 中國中藥雜志,2016, 40(21)：3881-3889.

4 陳士林,黃志海,丘小惠,等. 中藥精準(zhǔn)煮散飲片. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,9：1430-1440.

5 黃娟,李西文,徐文,等. 耳草屬嶺南藥材DNA分子鑒定研究. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2016,18(8)：1401-1407.

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7 陳士林,劉安,李琦,等. 中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略. 中國中藥雜志,2016,40(8)：1367-1375.

8 辛天怡,李西文,姚輝,等. 中藥材二維DNA條形碼流通監(jiān)管體系研究. 中國科學(xué)：生命科學(xué),2015, 45(7)：695-702.

9 張衛(wèi)明,單承鶯,馬世宏. 側(cè)柏葉化學(xué)成分及生理活性研究進(jìn)展.中華中醫(yī)藥學(xué)會、山東省千佛山醫(yī)院.2014年中華中醫(yī)藥學(xué)會藥膳分會年會論文集. 中華中醫(yī)藥學(xué)會、山東省千佛山醫(yī)院,2014：7.

10 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(一部). 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015：216.

Quality Evaluation of the Decoctions of Platycladus cacumen Between the Precise Powder Decoction Pieces and Traditional Chinese Medical (TCM) Slices

Gong Lu1, Bai Junqi1, Su He1, Zhang Peng2, Xiao Shuiming2, Li Xiwen2, Huang Zhihai1, Xu Jiang2
(1. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine / Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences / China Academy of Chinese Medical Sciences Guangdong Branch, Guangzhou 510006, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

This study aimed at comparing the precise powder decoction pieces and market raw TCM slices ofP. cacumenover the decocting quality. ITS2 sequence was adopted as a DNA barcode to identifyP. cacumen. The chemical composition of the medicinal materials was characterized by HPLC fingerprints for the evaluation of the similarity of precise powder decoction pieces and market TCM slices. The concentrations of quercitrin were determined using UPLC， and the characteristic common peaks were identified. In addition， the extraction efficiency between the market TCM slices and the precise powder decoction pieces was also compared by standard decoction method. It was found thatP. cacumenwas accurately identified by ITS2 sequences. HPLC fingerprints showed that the extraction efficiency and similarity of the precise powder decoction pieces increased compared with the market TCM slices. However， the extraction yield rate of the precise powder decoction pieces was improved by 20% increased in accordance with the standard decoction method， while the contents of the index component， quercitrin， presented rare increase and the decocting rates of the other chemical components little change in the study. In conclusion， it was indicated that precise powder decoction pieces improved the extraction efficiency and uniformity in comparison with TCM slices.

Precise powder decoction pieces， DNA barcode，Platycladus cacumen， uniformity， chromatography fingerprints

10.11842/wst.2017.01.016

R283

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-12-22

修回日期：2017-01-05

＊ 廣東省中醫(yī)院專項（2015KT1817）：嶺南中草藥DNA條形碼分子鑒定和生態(tài)適宜性研究，負(fù)責(zé)人：黃志海；中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康服務(wù)專項（ZZ0908067）：200種嶺南中草藥DNA條形碼研究，負(fù)責(zé)人：黃志海。

＊＊ 通訊作者：黃志海，碩士，主任中藥師，主要研究方向：中藥資源與中藥鑒定研究；徐江，博士，助理研究員，主要研究方向：中藥分子生物學(xué)研究。