許宇彪 楊建榮 李碧錦 何二松 林昌榮 莫凱迪

·論著·

人類miR-425靶基因預(yù)測及生物信息學(xué)特征分析

許宇彪 楊建榮 李碧錦 何二松 林昌榮 莫凱迪

目的 采用生物信息學(xué)工具分析人類miR-425(has-miR-425)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、靶基因功能和蛋白-蛋白互作，為研究其在細(xì)胞調(diào)控過程中的作用提供理論依據(jù)。方法 應(yīng)用miRBase、UCSC Genome Browser等數(shù)據(jù)庫，分析has-miR-425在不同物種的序列情況，以及在基因組上下游10kb以內(nèi)的CpG島分布情況、轉(zhuǎn)錄起始位置(TSS)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置(TFBS)等；選擇TargetScan、PicTar、MiRanda三種計算方法預(yù)測has-miR-425的靶基因，取三個預(yù)測結(jié)果的交集靶基因分別進(jìn)行注釋描述和富集分析。采用STRING軟件對交集靶基因進(jìn)行蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果 has-miR-425序列在人、大鼠、獼猴、黑猩猩之間呈現(xiàn)高度保守性；has-miR-425可能具有獨立的啟動子。共預(yù)測到319個潛在的靶基因，這些靶基因主要參與蛋白去磷酸化、細(xì)胞氮化合物反應(yīng)、氮化合物反應(yīng)等生物學(xué)過程；主要分子功能為酶結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、金屬離子結(jié)合等；主要細(xì)胞組成為：膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜有界細(xì)胞器、細(xì)胞核等。蛋白-蛋白互作分析顯示靶基因中PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關(guān)聯(lián)度最高。結(jié)論 通過對has-miR-425轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、靶基因的分析，為has-miR-425在細(xì)胞調(diào)控中的功能與調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

miR-425；轉(zhuǎn)錄調(diào)控；靶基因預(yù)測；生物信息學(xué)

miRNA是一類存在于真核生物體內(nèi)長度為19～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶基因的mRNA3’端非編碼區(qū)完全或不完全互補(bǔ)配對，進(jìn)而降解靶基因mRNA或抑制mRNA翻譯，實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控作用[1,2]。miRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、凋亡、致癌、抑癌、激素分泌等多種生物學(xué)過程，具有廣泛的生物學(xué)活性[3]。人類miR-425(has-miR-425)定位于染色體上的1p13.3，廣泛表達(dá)于人體多個組織，在肝臟、肺、免疫系統(tǒng)、胃腸道、心臟等組織表達(dá)量相對較高，參與多種生物學(xué)過程并與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4]。has-miR-425部分靶基因已鑒定，但這些靶基因調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)功能尚不完全清楚。本文應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法對has-miR-425的功能和靶基因進(jìn)行系統(tǒng)分析整理，為后續(xù)深入研究提供理論指導(dǎo)和實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 miR-425轉(zhuǎn)錄情況分析 應(yīng)用NCBI Mapviewer、UCSC Genome Browser等在線工具，分析miR-425在基因組上下游10 kb以內(nèi)的CpG島分布情況；應(yīng)用UCSC Genome Browser、Promoterscan等在線工具，分析miR-425在基因組上游10 kb以內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄起始位置(TSS)及可能的polyA信號位置；應(yīng)用PromoterScan、CBRC的TFSEARCH數(shù)據(jù)庫等在線工具，分析miR-425在基因組上游10 kb以內(nèi)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置(TFBS)；應(yīng)用NCBI Mapviewer、miRbase等在線分析工具，分析miRNA所在區(qū)域的EST數(shù)據(jù)。

1.2 miR-425潛在靶基因預(yù)測 選擇miRbase(http://www.mirbase.org/)查找miRNA序列，選擇miRWalk (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/genepub.html)網(wǎng)址，該網(wǎng)站整合了TargetScan、PicTarl、miRanda等數(shù)據(jù)庫，選中TargetScan、PicTarl、miRanda三種數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測miR-425的潛在靶基因，得出的結(jié)果即為3種數(shù)據(jù)庫得出的交集。

1.3 靶基因功能分析 將miR-425的交集靶基因提交Gene Ontology (http://geneontology.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能富集分類和GO注釋描述，分別提取基因的GO生物學(xué)過程(Biological Process)、分子功能(Molecular Function)和細(xì)胞組成(Cellular Component)。

1.4 蛋白-蛋白互作分析 將miR-425的交集靶基因提交輸入在線分析工具STRING 10.0 (http://www.string-db.org/)進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI) 網(wǎng)絡(luò)分析，分析基因?qū)?yīng)蛋白之間的相互作用關(guān)系，并計算蛋白間的連接系數(shù)(r)和繪制網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape 3.2軟件進(jìn)行交集靶基因的分析，采用BINGO插件進(jìn)行GO注釋的顯著性分析，并繪制基因間作用圖。通過Fisher精確檢驗計算P值，以P<0.05為顯著性閾值，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1miR-425在不同物種序列的保守性比較 經(jīng)miRBase數(shù)據(jù)庫分別檢索人、大鼠、獼猴、黑猩猩和馬不同物種成熟microRNA序列，發(fā)現(xiàn)人、大鼠、獼猴、黑猩猩的保守序列相同，而馬的保守序列與上述物種不同，說明miR-425物種間有一定的差異。見表1。

表1 不同物種miR-425序列比較

2.2hsa-miR-425轉(zhuǎn)錄規(guī)律預(yù)測 利用NCBIMapviewer、UCSCGenomeBrowser等在線工具，分析hsa-miR-425上下游10kb內(nèi)序列特征，結(jié)果顯示，其有可能的TSS及眾多TFBS，其上游存在約2 900bp的CpG島，因此推測hsa-miR-425有可能擁有獨立的轉(zhuǎn)錄單元。見表2。

表2 hsa-miR-425啟動子預(yù)測結(jié)果(-10 kb～+10 kb)

注： -無； +有

2.3 靶基因功能注釋TargetScan、PicTarl、miRanda三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測hsa-miR-425的潛在靶基因，取這些靶基因的交集，共得到319個靶基因，將這些交集靶基因放入在GeneOntology網(wǎng)站進(jìn)行功能注釋分析。GO功能注釋顯示這些潛在靶基因主要參與蛋白去磷酸化、細(xì)胞氮化合物反應(yīng)、氮化合物反應(yīng)、神經(jīng)元分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)調(diào)控等生物學(xué)過程；主要分子功能為酶結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、金屬離子結(jié)合等；細(xì)胞組成為：膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)膜有界細(xì)胞器、細(xì)胞核。見表3。

2.4 蛋白-蛋白互作分析 將319個hsa-miR-425交集靶基因放入STRING網(wǎng)站進(jìn)行蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，共得到153個節(jié)點及77條相互關(guān)系連接線，其中PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關(guān)聯(lián)度最高。見圖1、2,表4。

3 討論

miRNA是近年來分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最重要的發(fā)現(xiàn)之一，它在機(jī)體發(fā)育和疾病狀態(tài)下功能也越來越引人關(guān)注。研究已證實，miRNA調(diào)控著人類近1/3基因的功能，幾乎參與一切重要生命活動[5]。但由于miRNA種類和數(shù)量較多，且其表達(dá)具有顯著的時序性和組織特異性，即在發(fā)育疾病的不同階段或在不同組織細(xì)胞中具有特異性表達(dá)的特征，僅有少數(shù)miRNA的生物學(xué)功能得到闡明，因而通過生物信息學(xué)對miRNA進(jìn)行分析快速準(zhǔn)確地預(yù)測靶基因，正確認(rèn)識靶基因之間的相互作用對研究miRNA的生物學(xué)功能有十分重要的意義。

miR-425已被報道與多種基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控相關(guān)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可以通過激活NF-κB誘導(dǎo)miR-425表達(dá)上調(diào)，負(fù)性調(diào)控PTEN進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡作用，且miR-425啟動子上B結(jié)合位點是IL-1β誘導(dǎo)miR-425轉(zhuǎn)錄激活必需的[7]。在采用芯片技術(shù)比較4對高轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞患者的癌組織樣本與其相對應(yīng)的正常組織之間的差異miRNAs時，發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，高轉(zhuǎn)移肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)miR-425表達(dá)上調(diào)[8]。還有研究使用芯片技術(shù)篩選與喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)特征密切相關(guān)的差異表達(dá)miRNA，結(jié)果從喉癌的miRNA表達(dá)譜中篩選出的轉(zhuǎn)移相關(guān)差異表達(dá)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-425是差異表達(dá)倍數(shù)較高的miRNA，提示miR-425有可能成為評估喉癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險的新型分子標(biāo)志[9]。He等[10]在裸鼠肝癌細(xì)胞移植瘤模型中研究證實，CTNNA3能通過抑制Akt信號通路，進(jìn)而降低細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9，增加細(xì)胞周期抑制劑p21(Cip1/Waf1)的表達(dá)而達(dá)到抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲而起到抑癌作用，而miR-425z則可與CTNNA3 3'非翻譯區(qū)直接結(jié)合并抑制其表達(dá)而起到促癌作用，因而miR-425/CTNNA3軸對肝癌的病理機(jī)制的闡明和肝細(xì)胞癌的治療策略的制定具有潛在的價值。

表3 基因功能注釋和信號通路分析

表4 hsa-miR-425靶基因的蛋白-蛋白互作分析

圖1miR-425預(yù)測靶基因功能的層次網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點大小代表基因數(shù)量多少，顏色深淺代表P值大小，顏色越深，P值越小)

圖2miR-425預(yù)測靶基因蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(每個點代表一個蛋白，連接線代表蛋白間有互作聯(lián)系，連接線越多，互作關(guān)系越強(qiáng))

本研究發(fā)現(xiàn)人類miR-425序列在人、大鼠、獼猴、黑猩猩之間具有高度保守性，提示其可能具有較為強(qiáng)大的生物信息學(xué)功能。進(jìn)一步分析hsa-miR-425上下游10kb內(nèi)序列特征，結(jié)果顯示，其有可能的TSS及眾多TFBS，其上游存在約2 900bp的CpG島，這些結(jié)果有助于理解miR-425在調(diào)控細(xì)胞功能的可能機(jī)制。本研究采用TargetScan、PicTarl、miRanda三種計算方法預(yù)測miRNA作用的靶基因，并取靶基因的交集進(jìn)行GO功能注釋，從多層次多角度對hsa-miR-425的預(yù)測基因進(jìn)行描述，揭示了hsa-miR-425靶基因參與的細(xì)胞的主要生物學(xué)過程、分子功能和在細(xì)胞組成的作用，為了解這些靶基因的作用提供了參考依據(jù)。最后我們采用蛋白-蛋白互作分析探索hsa-miR-425靶基因?qū)?yīng)蛋白的作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)PAFAH1B1與DYNC1I2、MAP2K6與ZAK之間的關(guān)聯(lián)度最高，提示這些靶基因在hsa-miR-425的細(xì)胞調(diào)控過程中可能發(fā)揮較大的作用。

總之，本研究結(jié)果揭示hsa-miR-425的序列保守性，生物學(xué)功能和靶基因的功能，為全面了解hsa-miR-425的生物學(xué)作用提供了重要的生物信息學(xué)基礎(chǔ)。然而，由于各種在線工具、數(shù)據(jù)庫等具有一定的局限性，本研究結(jié)果還需要對這些生物學(xué)信息預(yù)測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的實驗設(shè)計和驗證，以期更準(zhǔn)確的闡明hsa-miR-425的功能，為其在疾病的診斷、治療和預(yù)后提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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5LiX,NieJ,MeiQ,etal.MicroRNAs:Novelimmunotherapeutictargetsincolorectalcarcinoma.WorldJGastroenterol,2016,22:5317-5331.

6AvciCB,HarmanE,DodurgaY,etal.Therapeuticpotentialofananti-diabeticdrug,metformin:alterationofmiRNAexpressioninprostatecancercells.AsianPacJCancerPrev,2013,14:765-768.

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Target gene prediction and bioinformatics characteristics analysis of human miR-425

XUYubiao,YANGJianrong,LIBijin,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,JiangbinHospitalofGuangxiZhuangNationalityAutonomousRegion,Nanning530021,China

Objective To investigate the transcriptional regulation,target gene function and protein-protein interaction of the human miR-425 (has-miR-425) by bioinformatics tools in order to provide theoretical basis for researching its role in cell regulation and control.Methods The has-miR-425 sequences in different species,the distribution of CpG island within 10 KB upstream and downstream in genome,the transcription start sites (TSS) and transcription factor binding position (TFBS) were analyzed by using miRBase,UCSC Genome Browser database.The three calculation methods of targetscan,pictar and miRanda were adopted to predict the target gene of has-miR-425.The intersectional target genes of the three prediction results were analyzed by annotation description and enrichment analysis.The STRING software was used to analyze the intersectional target genes,protein-protein interaction.Results The has-miR-425 sequences were highly conserved among human,rat,rhesus monkey and chimpanzee,and has-miR-425 might have independent promoter.The 319 potential target genes were forecasted,and these target genes were mainly involved in the biological processes such as protein dephosphorylation,cellular response to nitrogen compound and response to nitrogen compound.The molecular functions mainly included enzyme binding,transferase activity,metal ion binding and so on,however, the main cell components were membrane-bounded organelle,intracellular membrane-bounded organelle and nucleus. The protein-protein interaction analysis showed that the correlation degree between PAFAH1B1 and DYNC1I2 and between MAP2K6 and ZAK was the highest.Conclusion The research resullts provide an important theoretical basis for the researches about function and regulation mechanism of has-miR-425 in cell regulation and control through the analysis of has-miR-425 transcriptional regulatory elements and target genes.

miR-425; transcriptional control; target gene prediction; bioinformatics

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.004

項目來源：廣西醫(yī)藥衛(wèi)生自籌經(jīng)費計劃課題(編號：Z2015076)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(編號：桂科攻12239015)

530021 南寧市，廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院普通外科

楊建榮,530021 南寧市，廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院普通外科；

E-mail：1637340358@qq.com

R 349.83

A

1002-7386(2017)07-0977-04

2016-10-17)