吳天思 崔陽陽 孫偉偉 趙瑞華 徐彩

·論著·

活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠子宮內(nèi)膜容受性的影響研究

吳天思 崔陽陽 孫偉偉 趙瑞華 徐彩

目的 探討子宮內(nèi)膜異位癥對子宮內(nèi)膜容受性的影響機制以及活血消異方對子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠子宮內(nèi)膜容受性的作用。方法 通過“皮下+腹腔”同系異體子宮內(nèi)膜注射的方法建立子宮內(nèi)膜異位癥妊娠功能低下小鼠模型，假手術(shù)予等量0.9%氯化鈉溶液注射。建模成功后，隨機分為中藥組和模型組，中藥組予活血消異方干預(yù)治療，模型組和假手術(shù)組予等量0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)灌胃。連續(xù)治療3個周期后，3組分別與不育雄鼠合籠，次日清晨8∶00觀察陰栓，見栓者定為假孕第1天，于假孕第4天晚上10∶30取材，運用Western blot法檢測小鼠子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表達(dá)。結(jié)果 模型組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF的蛋白表達(dá)量較模型組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但均低于假手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論 子宮內(nèi)膜異位癥對子宮內(nèi)膜容受性存在不良影響。活血消異方能夠顯著提高小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜著床因子整合素αvβ3和LIF的蛋白表達(dá)量，從而改善子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠子宮內(nèi)膜容受性。

子宮內(nèi)膜異位癥；子宮內(nèi)膜容受性；活血消異方；整合素αvβ3；LIF

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)簡稱內(nèi)異癥，是指活性的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植于子宮腔以外的部位浸潤性生長，引起慢性盆腔痛、不孕、月經(jīng)失調(diào)等一系列臨床表現(xiàn)的一種雌激素依賴性疾病。內(nèi)異癥對妊娠各個環(huán)節(jié)如排卵、受精、著床等造成干擾，從而導(dǎo)致不孕[1]。其中，胚胎著床也被稱為植入，是指胚泡通過定位、黏附種植于子宮內(nèi)膜的過程，是妊娠的重要環(huán)節(jié)[2]。正常的子宮內(nèi)膜只在一個短暫且關(guān)鍵的時期即“著床窗口期(implantation window)”允許胚泡著床[3]，子宮內(nèi)膜容受性即是指子宮內(nèi)膜在“著床窗口期”對胚泡植入時的接受能力。子宮內(nèi)膜容受性的建立對胚胎的成功植入起到了決定性的作用[4]。近年來，越來越多的文獻(xiàn)報道，內(nèi)異癥不孕患者著床窗口期在位內(nèi)膜存在一系列超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞因子和基因的異常改變，加之EM不孕患者行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的高移植率和低妊娠率，推測內(nèi)異癥可對子宮內(nèi)膜容受性產(chǎn)生不良影響[5]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，通過建立子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型，探討內(nèi)異癥對子宮內(nèi)膜容受性的影響以及活血消異方對EM模型小鼠子宮內(nèi)膜容受性的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康昆明雌性小鼠100只，7周齡，體重(25±3)g。昆明雄性小鼠30只，7周齡。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所提供，合格證號：SCXK(京)2014-0004。

1.2 藥物及試劑 活血消異方由柴胡、制香附、丹參、赤芍藥、莪術(shù)、皂刺等藥物組成，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院煎藥室提供。以上生藥加10倍量水，反復(fù)煎煮3次，每次1 h，合并煎液、過濾，放置24 h，濃縮。藥物濃度為1.8 g生藥/ml，藥液4℃冰箱保存。Mouse整合素αvβ3抗體(NB600-1342，Novus Biologicals)，Rabbit LIF抗體(ab113262，Abcam)，Beta actin(TA-09，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。其他實驗試劑及藥物均由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院制劑室提供。

1.3 實驗儀器 美國伯樂高壓電泳儀，美國Thermo迷你振蕩器，中國湘儀高速冷凍離心機，美國Fluka勻漿器。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型的建立及分組:造模前連續(xù)1周進(jìn)行小鼠陰道脫落細(xì)胞涂片檢查[1]，動情周期正常的小鼠作為受體小鼠。余作為供體小鼠，連續(xù)3 d皮下注射苯甲酸雌二醇0.02 mg(1 mg/ml)。造模時將供體小鼠常規(guī)消毒后脫頸處死，沿腹中線打開腹腔，將雙側(cè)子宮取出，置于盛有0.9%氯化鈉溶液的培養(yǎng)皿中，然后采用“滾針法”將內(nèi)膜擠壓分離出，剪成1 mm×1 mm的碎片，待接種。用0.9%水合氯醛將供體小鼠腹腔注射麻醉，乙醇消毒后，將0.2 ml含4～8片1 mm3碎片的懸液，注射于小鼠的腹腔及皮下[7,8]。假手術(shù)組予同樣方法注射等量0.9%氯化鈉溶液?？瞻捉M不予任何處理。造完模后，連續(xù)5 d小鼠腹腔注射青霉素1萬U。為促進(jìn)內(nèi)膜生長，以5 d為1個周期，連續(xù)3個周期注射0.02 ml(1 mg/ml)苯甲酸雌二醇于小鼠皮下。建模2周后，隨機分為中藥組和模型組。

1.4.2 給藥方法:中藥組予活血消異方，以15 μg·kg-1·d-1灌胃(每只小鼠每次灌胃量為(0.2 ml/10 g)，連續(xù) 3個周期(5 d為1周期)；模型組、假手術(shù)組依據(jù)體重予等量0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC)灌胃。

1.5 采集標(biāo)本 將3組雌鼠分別以2∶1與輸精管結(jié)扎的不育雄鼠合籠，次日清晨8點觀察陰栓，見陰栓者視為交配成功，即為假孕鼠，定為假孕第1天。將假孕第4天的假孕鼠于晚上10∶30脫頸處死，取出雙側(cè)子宮，放置在凍存管中，置于-80℃冰箱里保存，待檢測。

1.6 Western blot法檢測子宮內(nèi)膜整合素αvβ3、LIF的蛋白表達(dá)量 將組織勻漿并提取蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，配制濃度為12%分離膠和5%濃縮膠。根據(jù)24 μg/孔蛋白量進(jìn)行上樣，以SDS-PAGE電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫封閉2 h，分別加入1∶50稀釋的整合素αvβ3一抗和1∶500稀釋的LIF一抗，4℃過夜。次日洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫輕搖2 h，ECL試劑顯影，用Labworks軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 整合素αvβ3表達(dá)情況 模型組種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)；中藥組種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3蛋白表達(dá)量較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但低于假手術(shù)組(P<0.01)。見表1，圖1、2。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖1 3組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3蛋白電泳圖

2.2LIF表達(dá)情況 模型組種植窗口期子宮內(nèi)膜LIF的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)；中藥組種植窗口期子宮內(nèi)膜LIF蛋白表達(dá)量較模型組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但低于假手術(shù)組(P<0.01)。見圖3、4，表2。

圖2 3組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3蛋白表達(dá)比較

圖3 3組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜LIF蛋白電泳圖

組別LIF/β?actin中藥組 0．267±0．03?#模型組 0．179±0．08?假手術(shù)組0．380±0．07

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

子宮內(nèi)膜容受性的形成機制極其復(fù)雜，受許多因素調(diào)控。一般而言，卵巢分泌的雌孕激素啟動下游分子合成，在胚泡的影響下，子宮內(nèi)膜局部的細(xì)胞因子、生長因子的自分泌、旁分泌機制啟動充當(dāng)中介因素，觸發(fā)黏附分子的表達(dá)直接參與子宮內(nèi)膜由非黏附狀態(tài)到黏附狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[9]。在著床窗口期，上述因子共同參與，相互作用，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的形成，使子宮內(nèi)膜在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)生一系列改變，以利于胚泡與子宮內(nèi)膜的識別和成功植入。整合素是一類由α、β兩亞單位構(gòu)成的細(xì)胞表面粘附分子，有粘附和信號傳遞兩大基本功能[10]。研究發(fā)現(xiàn)，種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3表達(dá)異常往往導(dǎo)致著床失敗，且經(jīng)治療改善整合素αvβ3表達(dá)后可獲得較好的妊娠結(jié)局[11]。因此，整合素αvβ3作為子宮內(nèi)膜容受性建立的衡量標(biāo)志已被國內(nèi)外廣大學(xué)者認(rèn)可，其高表達(dá)對促進(jìn)容受態(tài)子宮內(nèi)膜的建立具有重要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜內(nèi)異癥模型小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，提示子宮內(nèi)膜異位癥可導(dǎo)致整合素αvβ3在著床窗口期子宮內(nèi)膜的異常表達(dá)，進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床。著床窗口期LIF在子宮內(nèi)膜的表達(dá)是判斷內(nèi)膜對胚泡是否具有容受性或胚泡能否著床的重要標(biāo)志之一[12]。研究發(fā)現(xiàn)，LIF在不明原因所致不孕的患者著床窗口期子宮內(nèi)膜表達(dá)較正常女性顯著下

圖4 3組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜LIF蛋白表達(dá)比較

降，表明LIF表達(dá)減弱或缺失可能是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降胚胎著床失敗的原因之一[13,14]。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜內(nèi)異癥模型小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜LIF的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低(P<0.01)，提示子宮內(nèi)膜異位癥可能通過影響著床窗口期LIF在子宮內(nèi)膜的正常表達(dá)，從而降低了子宮內(nèi)膜對胚泡的容受性。

中醫(yī)認(rèn)為瘀血阻滯是子宮內(nèi)膜異位癥的根本病機，病位主要在胞宮和沖任，瘀血是產(chǎn)生內(nèi)異癥一系列臨床證候的關(guān)鍵因素[15]，故活血化瘀是內(nèi)異癥的主要治療原則。前期研究結(jié)果顯示，活血消異方不僅可以縮小病灶，緩解疼痛，預(yù)防內(nèi)異癥保守術(shù)后復(fù)發(fā)，對合并不孕的患者也有明顯的助孕作用?；钛惙街饕刹窈?、制香附、丹參、赤芍藥、莪術(shù)、皂角刺等藥味組成，具有疏肝理氣，活血化瘀，通絡(luò)散結(jié)的功效。方中柴胡、香附疏肝行氣解郁。丹參、赤芍活血祛瘀，調(diào)經(jīng)止痛。莪術(shù)、皂角刺破血行氣，消癥止痛。觀全方通過活血化瘀，調(diào)暢氣機，達(dá)到化瘀消癥，行滯止痛，通絡(luò)助孕的功效。本研究中，經(jīng)活血消異方干預(yù)的中藥組小鼠種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF的表達(dá)較模型組均顯著升高(P<0.05)，提示活血消異方可以顯著提高種植窗口期子宮內(nèi)膜整合素αvβ3和LIF的活性表達(dá)，從而提高子宮內(nèi)膜對胚泡的接受能力，這可能是活血消異方改善子宮內(nèi)膜容受性的可能機制之一。

本研究可以看出子宮內(nèi)膜異位癥對子宮內(nèi)膜容受性存在不良影響，子宮內(nèi)膜異位癥可能通過降低著床相關(guān)因子整合素αvβ3和LIF在著床窗口期子宮內(nèi)膜的表達(dá)降低子宮內(nèi)膜對胚胎的容受性?；钛惙娇梢陨险{(diào)整合素αvβ3和LIF在著床窗口期的表達(dá)，糾正子宮內(nèi)膜異位癥對子宮內(nèi)膜的不良影響，改善子宮內(nèi)膜容受性。但是由于子宮內(nèi)膜容受性的建立過程非常復(fù)雜，涉及到眾多細(xì)胞因子和基因的共同參與調(diào)控，本研究僅選取了整合素αvβ3和LIF兩方面進(jìn)行了初步研究，未能對更多的調(diào)控因子加以研究以相互印證，有待在以后的研究中進(jìn)一步完善。

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Effects of Huoxuexiaoyi recipe on endometrial receptivity in mice models with endometriosis

WUTiansi,CUIYangyang,SUNWeiwei,etal.

DepartmentofGynecology,Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChieseMedicalSciences,Beijing100053,China

Objective To investigate the effects of Huoxuexiaoyi recipe on endometrial receptivity in mice models with endometriosis,and to explore its action mechanism.Methods The animal models with endometriosis pregnancy hypofunction were established in mice through the method of abdominal cavity+subcutaneous injections, and the mice in sham-operation group were injected with same volume of 0.9% sodium chloride solution. After the success of modeling,the mice were randomly divided into traditional Chinese medicine group (TCM group) and model group.The mice in TCM group were treated by Huoxuexiaoyi recipe,however,the mice in model group and sham-operation group were given same volume of 0.5% CMC by gavage.After three menstrual cycles, the mice in the three groups were put in the cage with infertile male mice (2∶1), then the vaginal plug was observed at 8∶00 am in the next day (D1). The detection specimens were taken at 10∶30 pm on D4 after false pregnant,and the expression levels of endometrial integrin-αvβ3 and leukaemia inhibitory factor (LIF) were detected by Western Blot.Results The expression levels of endometrial integrin-αvβ3 and LIF at implantation window phase in model group were significantly decreased,as compared with those in sham-operation group (P<0.05).Howevertheexpressionlevelsofendometrialintegrin-αvβ3andLIFatimplantationwindowphaseinTCMgroupweresignificantlyincreased,ascomparedwiththoseinmodelgroup(P<0.05),butwhichweresignificantlylowerthanthoseinsham-operationgroup(P<0.05).Conclusion The endometriosis has adverse effects on endometrial receptivity. Huoxuexiaoyi recipe can significantly increase the expression levels of endometrial integrin αvβ3 and LIF at implantation window phase so as to improve endometrial receptivity in mice with endometriosis.

endometriosis; endometrium receptivity;Huoxuexiaoyi recipe;integrinαvβ3;leukaemia inhibitory factor

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.07.001

項目來源：國家自然科學(xué)基金(編號：81173297)

100053 北京市,中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科(吳天思、崔陽陽、孫偉偉、趙瑞華);北京中醫(yī)藥大學(xué)(徐彩)

趙瑞華，100053 北京市,中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院婦科；

E-mail:rhzh801@sohu.com

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A

1002-7386(2017)07-0965-04

2016-08-27)