徐立群， 張榮華， 鄒 瑩， 潘靜潔， 鄔曉東， 于禮建， 梁 昆

(1廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣州腫瘤研究所，廣東 廣州 510095； 2暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632； 3廣州市胸科醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

參慈膠囊聯(lián)合順鉑通過PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉人肺腺癌順鉑耐藥的機制研究*

徐立群1△， 張榮華2， 鄒 瑩1， 潘靜潔3， 鄔曉東1， 于禮建1， 梁 昆1

(1廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，廣州腫瘤研究所，廣東 廣州 510095；2暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；3廣州市胸科醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

目的： 探討參慈膠囊聯(lián)合順鉑是否通過PI3K/AKT/mTOR信號通路逆轉接種人肺腺癌A549/DDP細胞的裸鼠體內的順鉑耐藥。方法: 建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型，隨機分為對照組、參慈膠囊組、順鉑組和參慈膠囊+順鉑組。對照組予生理鹽水，其余各組荷瘤裸鼠均用藥21 d，斷頸處死，取腫瘤組織，采用流式細胞術檢測細胞周期與細胞凋亡；采用FQ-PCR技術檢測A549/DDP肺癌組織PTEN、P-糖蛋白、PI3K、AKT和mTOR的mRNA表達情況。結果: 參慈膠囊組、順鉑組和參慈膠囊+順鉑組與對照組比較，對人肺腺癌A549/DDP細胞的增殖均有抑制作用，其中參慈膠囊+順鉑組較其它治療組能夠進一步將人肺腺癌A549/DDP細胞阻滯于G2/M期，促進細胞凋亡，增加PTEN的表達，抑制P-糖蛋白、PI3K、AKT和mTOR的表達。結論: 參慈膠囊可能通過阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進PTEN的表達，或者抑制P-糖蛋白介導的耐藥途徑，增強裸鼠體內人肺腺癌A549/DDP耐藥細胞對順鉑的敏感性。

肺癌； 參慈膠囊； 順鉑耐藥； PI3K/AKT/mTOR信號通路； PTEN； P-糖蛋白

化療在非小細胞肺癌(non-small-cell lung can-cer，NSCLC)的綜合治療中占據重要地位，但多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的產生仍是導致化療失敗的主要原因。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of repamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號通路與惡性腫瘤的侵襲、轉移及多藥耐藥有密切的關系[1-2]。參慈膠囊由名方仙魚湯化裁而來，臨床證實對NSCLC具有較好的療效，配合化療具有減毒增效的作用[3]。前期研究顯示參慈膠囊聯(lián)合順鉑(cisplatin, DDP)能夠通過調節(jié)DNA損傷修復系統(tǒng)，改善接種人肺腺癌A549/DDP細胞的裸鼠體內的順鉑耐藥狀態(tài)[4]。但PI3K/AKT/mTOR是否參與這一過程，目前尚缺乏實驗研究。本研究從PI3K/AKT/mTOR信號通路出發(fā)，探討參慈膠囊聯(lián)合DDP對接種人肺腺癌A549/DDP細胞的裸鼠體內順鉑耐藥的影響，以進一步分析參慈膠囊逆轉肺腺癌多藥耐藥的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗藥物 (1)參慈膠囊由黨參25 g、山慈菇10 g、田七片10 g、守宮5 g、山海螺30 g、仙鶴草15 g、貓爪草30 g等11味中藥組成，由廣州一方制藥集團提供免煎顆粒，經濃煎、水提、乙醇沉淀，并進一步濃縮而成。(2)DDP為江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司產品，由本院藥房提供。

1.2 實驗動物 BALB/c裸鼠50只，4～6周齡，雌雄各半，體重18～22 g，實驗動物合格證號為44007200010919，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，SPF級別。

1.3 細胞來源 人肺腺癌A549/DDP耐藥細胞由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.4 主要試劑和儀器 胰蛋白酶為Sigma產品；RT-PCR 試劑盒及 TRIzol 為TaKaRa產品；ABI 7500 Fast 熒光定量PCR儀為Life Technologies產品；FACScan型流式細胞儀為BD產品。

1.5 引物設計 引物序列根據GenBank人類各目的基因cDNA 序列，由廣州華銀醫(yī)學檢驗中心有限公司合成。引物設計如下。PTEN上游引物為5’-AACATGCAGGCTTCTGAGGG-3’，下游引物為5’-AAATCCACACACAAGCCACT-3’，擴增片段大小148 bp。 P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)上游引物為5’-TGCGATAGCAGGAGTGGTTG-3’,下游引物為5’-TCTGCAAGCTCTGGGCATAC-3’，擴增片段大小173 bp。PI3K上游引物為5’-ACCATGGTGCTTGTTAACGC-3’,下游引物為5’-GTGGGTTGTTGGTTGCTGAC-3’，擴增片段大小327 bp。AKT上游引物為5’-CATGCAGCACCGGTTCTTTG-3’，下游引物為5’-TCAGGTTCAGATGATCCATGCG-3’，擴增片段大小318 bp。mTOR上游引物為5’-TTTGGCCTGGTGAACACACT-3’,下游引物為5’-GACCATCGACATAACGGCCA-3’，擴增片段大小387 bp。 β-actin上游引物為5’-CTTCCTTCTTGGGTATGGAATCC-3’，下游引物為5’-GGAGCAATGATCTTGATCTTCATG-3’，擴增片段大小205 bp。

2 方法

2.1 造模 根據參考文獻[4]在無菌條件下取下荷瘤裸鼠瘤塊，切成約1 mm×1 mm×1 mm,通過穿刺針刺入裸鼠的右前腋下，進行造模。

2.2 分組與處理 根據參考文獻[4]將接種人肺腺癌細胞A549/DDP瘤塊的裸鼠，隨機分為對照組、參慈膠囊組、順鉑組和參慈膠囊+順鉑組，每組10只。對照組予以0.2 mL生理鹽水灌胃，其余各組分別予相應藥物干預，連續(xù)用藥21 d后脫頸處死，分離腫瘤組織，行病理鑒定后進行實驗指標檢測。

2.3 用流式細胞術檢測各組腫瘤組織細胞周期情況及細胞凋亡情況 取新鮮肺腫瘤組織，用PBS液沖洗，制成單細胞懸液，調整細胞數為1×109/L；加入70%的乙醇4 ℃固定12 h；PBS液沖洗2次；加入RNase A(終濃度50 mg/L)，37 ℃孵育30 min；加入PI(終濃度為50 mg/L)， 4 ℃避光染色30 min后上機檢測；用CellQuest 軟件分析各組細胞的周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細胞所占比例；Annexin V-FITC/PI 法測定細胞凋亡，并計算凋亡百分率。

2.4 用熒光定量PCR(FQ-PCR)技術檢測PTEN、P-gp、PI3K、AKT和mTOR mRNA的表達情況 A549/DDP肺癌組織100 mg勻漿后加入TRIzol試劑提取總RNA。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，進行40個循環(huán)，在ABI 7500實時定量PCR系統(tǒng)上進行，收集反應熒光信號，并建立PCR 產物的熔解曲線。實驗重復3次。數據采用2-ΔΔCt法，計算每1 μL cDNA所含目的基因的拷貝數與1 μL cDNA所含β-actin的拷貝數的比值，進行半定量比較。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 15.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數據以均數±標準差(mean±SD) 表示，多組比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較，采用 Bonferroni 校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 采用流式細胞術分析參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞周期的影響

各治療組與對照組比較，肺癌細胞增殖均受到抑制，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，細胞明顯阻滯于G2/M期，而處于S期的細胞數目則明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組人肺腺癌A549/DDP細胞周期的變化

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

2 采用流式細胞術分析參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡的影響

流式細胞術分析人肺腺癌A549/DDP細胞DNA的含量，結果顯示對照組亞二倍體凋亡峰不明顯，各治療組出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，凋亡細胞的數量明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。參慈膠囊組、順鉑組與參慈膠囊+順鉑組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1、表2。

Figure 1.Apoptosis of A549/DDP cell in various groups detected by flow cytometry.

3 參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PTEN mRNA表達的影響

各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PTEN mRNA的表達均增加，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較， PTEN mRNA的增加更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表3。

4 參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織P-gp mRNA表達的影響

各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織P-gp mRNA的表達均降低，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，P-gp mRNA的表達進一步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表4。

表2 各組人肺腺癌A549/DDP細胞凋亡的變化

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

表3 各組人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PTEN mRNA的表達

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

表4 各組人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織P-gp mRNA的表達

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

5 參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PI3K mRNA表達的影響

各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PI3K mRNA的表達均降低，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，PI3K mRNA的表達進一步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表5。

6 參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織AKT mRNA表達的影響

表5 各組人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織PI3K mRNA的表達

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織AKT mRNA的表達均降低，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，AKT mRNA的表達進一步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表6。

表6 各組人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織AKT mRNA的表達

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsShenci capsule+DDP group.

7 參慈膠囊與順鉑對人肺腺癌A549/DDP肺癌組織mTOR mRNA的表達的影響

各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP肺癌組織mTOR mRNA的表達均降低，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，mTOR mRNA表達進一步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表7。

表7 各組人肺腺癌A549/DDP細胞移植瘤組織mTOR mRNA的表達

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsShenci capsule+DDP group.

討 論

DDP是NSCLC化療中有效且廣泛應用的一線藥物，DDP不僅通過細胞毒作用直接殺傷癌細胞，還可以通過誘導細胞凋亡而發(fā)揮作用，但是由于耐藥性問題的存在，嚴重影響其進一步療效。PI3K是一種可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂類激酶。AKT是一個絲/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K下游的作用靶點。mTOR是一種與PI3K/AKT通路相關的蛋白激酶，mTOR作為AKT的一個底物而被激活。PI3K/AKT/mTOR信號通路在惡性腫瘤發(fā)生、侵襲、轉移及化療耐藥中具有重要的影響，其作用主要是促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，促進腫瘤血管生成[5-7]。本研究采用流式細胞術分析各組人肺腺癌A549/DDP細胞周期與細胞凋亡。結果顯示對照組亞二倍體凋亡峰不明顯，各治療組出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，凋亡細胞的數量明顯增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。參慈膠囊組、順鉑組與參慈膠囊+順鉑組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。細胞周期分析顯示，各治療組對肺癌細胞增殖具有抑制作用，導致細胞阻滯于G2/M期，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。研究結果提示參慈膠囊能夠直接抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖，從順鉑耐藥具有直接的對抗作用。

PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因，在多種腫瘤細胞中異常表達，PTEN通過負調控PI3K/AKT通路從而抑制mTOR活性。PTEN的異常表達可導致PI3K/AKT通路的激活，上調mTOR表達，促進了腫瘤細胞的增殖，抑制細胞的凋亡, 介導細胞的多藥耐藥[8]。因此，上調PTEN的表達，或使用PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制劑，可逆轉腫瘤細胞的多藥耐藥，提高化療的療效。本研究顯示，各治療組與對照組比較，人肺腺癌A549/DDP肺癌組織PTEN mRNA的表達均增加，其中參慈膠囊+順鉑組與其它治療組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。由此推測，參慈膠囊通過上調PTEN的表達，從而負向調控PI3K/AKT/mTOR信號通路，逆轉順鉑耐藥。

此外，PI3K/AKT/mTOR信號轉導通路介導的多藥耐藥與經典多藥耐藥，如P-gp介導的多藥耐藥存在密切的聯(lián)系，抑制AKT表達能夠下調P-gp的表達，從而逆轉P-gp介導的多藥耐藥[9]。本研究顯示，各治療組與對照組比較，均能降低人肺腺癌A549/DDP肺癌組織P-gp mRNA的表達，其中參慈膠囊+順鉑組與其它各組比較，差異具有統(tǒng)計學意義。推測參慈膠囊可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而逆轉P-gp介導的順鉑耐藥。

綜上所述，本研究建立人肺腺癌A549/DDP荷瘤裸鼠模型，通過PI3K/AKT/mTOR信號通路探討參慈膠囊、順鉑和參慈膠囊+順鉑3種不同的給藥方式，對人肺腺癌A549/DDP荷瘤裸鼠體內順鉑耐藥的影響。結果顯示參慈膠囊+順鉑組較其它治療組能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡，增加PTEN的表達，抑制P-gp、PI3K、AKT和mTOR的表達，提示中藥聯(lián)合化療，較單純中藥或者單純化療更能在臨床獲益，可能在一定程度上能夠減輕或者延緩多藥耐藥的發(fā)生。下一步可深入探討參慈膠囊聯(lián)合順鉑在不同的給藥時間、不同的給藥周期，對人肺腺癌A549/DDP荷瘤裸鼠體內順鉑耐藥的影響。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Mechanism of Shenci capsule combined with cisplatin in reversing DDP resistance of human lung adenocarcinoma via PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

XU Li-qun1, ZHANG Rong-hua2, ZOU Ying1, PAN Jing-jie3, WU Xiao-dong1, YU Li-jian1, LIANG Kun1

(1AffiliatedCancerHospital&InstituteofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofOncology,Guangzhou510095,China;2PharmacyCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;3GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China.E-mail:xuliqun99@163.com)

AIM: To investigate the effect of Shenci capsule combined with cisplatin (DDP) in reversing DDP resistance by PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in nude mice bearing A549/DDP tumor.METHODS: The patient-derived lung adenocarcinoma A549/DDP cell xenograft model was established. The tumor-bearing nude mice were randomly divided into control group, Shenci capsule group, DDP group and Shenci capsule combined with DDP group. The mice in control group was treated with normal saline, while the mice in other groups were treated with different drugs for 21 d. After treatment, the mice were killed and lung cancer tissues were collected. Flow cytometry was used to analyze the cell cycle and apoptosis. FQ-PCR was used to determined the mRNA levels of PTEN, P-glycoprotein, PI3K, AKT and mTOR in A549/DDP lung tumor.RESULTS: Compared with control group, the cell proliferation in all the drug treatment groups was inhibited. Compared with other drug treatment groups, Shenci capsule combined with DDP blocked the cell cycle of A549/DDP cells at G2/M phase, promoted the apoptosis rate, increased the mRNA expression of PTEN and inhibited the mRNA expression of P-glycoprotein, PI3K, AKT and mTOR. CONCLUSION: Shenci capsule increases the sensitivity of A549/DDP resistant cells in nude mice to DDP by blocking PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, increasing the expression of PTEN or inhibiting P-glycoprotein-mediated resistance pathway.

Lung cancer; Shenci capsule; DDP resistance; PI3K/AKT/mTOR signaling pathway; PTEN; P-glycoprotein

1000- 4718(2017)03- 0500- 05

2016- 07- 18

2016- 12- 13

廣東省中醫(yī)藥局科研項目(No. 20141176； No. 20151279)

△通訊作者 Tel: 020-66673660； E-mail: xuliqun99@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.019