王 燕， 晏 勇， 鐘 珊， 阮雄中， 陳壓西， 趙 蕾

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

棕櫚酸刺激的巨噬細胞對HepG2細胞侵襲和遷移的影響*

王 燕， 晏 勇， 鐘 珊， 阮雄中， 陳壓西， 趙 蕾△

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室，脂質(zhì)研究中心，重慶 400016)

目的： 研究棕櫚酸刺激的巨噬細胞對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響,并進一步探討其作用機制。方法: 應(yīng)用棕櫚酸(0.16 mmol/L)刺激人急性單核細胞白血病細胞系THP-1來源的巨噬細胞，并取其上清液處理HepG2細胞。細胞遷移實驗檢測巨噬細胞的遷移能力，侵襲實驗和劃痕實驗分別觀察HepG2細胞的縱向遷移能力和橫向遷移能力；RT-qPCR檢測巨噬細胞和HepG2細胞的炎癥/趨化因子及HepG2細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白(E-cadherin和N-cadherin) 的mRNA表達水平。結(jié)果: 棕櫚酸促進了巨噬細胞遷移，顯著上調(diào)巨噬細胞白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白1 (MCP-1)的mRNA表達；用棕櫚酸刺激巨噬細胞的上清液處理HepG2細胞，其縱向遷移能力和橫向遷移力明顯強于未經(jīng)棕櫚酸處理組，且HepG2細胞的多種炎癥因子和N-cadherin表達上調(diào)，E-cadherin表達下調(diào)。結(jié)論: 棕櫚酸可以增強巨噬細胞的遷移能力，刺激巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥因子/趨化因子，進一步通過旁分泌/內(nèi)分泌作用于HepG2細胞，促進HepG2細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強HepG2細胞的侵襲與遷移能力。

棕櫚酸； HepG2細胞； 巨噬細胞； 炎癥因子； 細胞侵襲； 細胞遷移

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的高致死率惡性腫瘤之一，是我國癌癥死亡的第二大原因。影響肝癌患者預(yù)后的因素眾多,但腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的最關(guān)鍵因素之一。近年研究提示肥胖及糖尿病患者的乳腺癌、前列腺癌、肝癌等發(fā)病率高于正常對照組[1]。因此歐洲癌癥預(yù)防研究機構(gòu)提出了避免超重/肥胖、積極減肥能預(yù)防腫瘤發(fā)生的觀點[2]。

肥胖狀態(tài)下，脂肪組織的脂肪水解增強，導(dǎo)致血清游離脂肪酸含量增加，尤其是飽和脂肪酸顯著增加。16碳的飽和脂肪酸——棕櫚酸(palmitate，PA)作為游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸成分，是誘導(dǎo)機體產(chǎn)生胰島素抵抗的主要因素之一[11]，但其對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響及作用機制尚不清楚[3]。研究已經(jīng)證實：巨噬細胞浸潤和炎癥因子與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。因此本研究擬采用PA刺激THP-1來源的巨噬細胞，觀察其對HepG2細胞的浸潤遷移的影響并初步探討其分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細胞株HepG2由重慶醫(yī)科大學(xué)肝病研究所惠贈；人單核細胞株THP-1購自于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；Transwell 共培養(yǎng)體系購自Corning；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基和1640培養(yǎng)基購自Gibco；PBS緩沖液、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、胰蛋白酶和青-鏈霉素購自上海生工生物工程股份有限公司；PA和佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma-Aldrich；RNAiso Plus、PrimeScript RT試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自TaKaRa；PCR 引物采用ABI Primer Express 軟件設(shè)計，由北京華大基因公司合成。

2 方法

2.1 實時熒光定量PCR實驗(RT-qPCR) 用RNAiso Plus按試劑說明書提取細胞總RNA。標(biāo)化RNA 濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑按20 μL體系混勻，瞬時離心后放于逆轉(zhuǎn)錄儀中，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。然后取2 μL cDNA以β-actin為內(nèi)參照進行qPCR，反應(yīng)體系為25 μL。擴增條件：95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 15 s，共39個循環(huán)。引物序列見表1。

2.2 巨噬細胞的遷移實驗 將處于對數(shù)生長期的THP-1細胞，常規(guī)離心、去上清液后，加入含PMA(160 nmol/L)的完全培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞濃度至4×108/L，將300 μL細胞懸液滴至孔徑大小為5 μm Transwell小室中，常規(guī)誘導(dǎo)THP-1細胞48 h，得到分化成熟的巨噬細胞。向各組巨噬細胞中加入300 μL的0.2% BSA培養(yǎng)基饑餓12 h；去掉小室內(nèi)陳舊培養(yǎng)基，向?qū)嶒灲M加入300 μL新鮮的含PA(0.16 mmol/L)的0.2% BSA培養(yǎng)基,對照組給與0.2% BSA培養(yǎng)基，置孵箱中培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，去除陳舊的培養(yǎng)基，用新鮮PBS洗滌細胞，用棉簽擦去小室內(nèi)面未遷移的細胞，再向每孔加入200 μL 4%多聚甲醛，室溫下固定10 min；去掉多聚甲醛溶液，PBS洗滌細胞3次。將小室底面朝上，1%結(jié)晶紫染色30 min；顯微鏡觀測THP-1巨噬細胞染色情況并拍照。

表1 引物序列

2.3 Transwell 侵襲實驗分析肝癌細胞的縱向遷移能力 在Transwell上層小室(24 孔，直徑5 μm)底部膜的下表面包被10 μL 纖維連接蛋白(40 mg/L)，4 ℃放置48 h；把50 μL Matrigel (用無血清DMEM 培養(yǎng)液1∶3 稀釋)加入Transwell 嵌套內(nèi)，37 ℃孵育30 min。將HepG2細胞用無血清培養(yǎng)液制成細胞懸液接種于Transwell 上室(每孔1×106細胞)，向HepG2細胞中加入300 μL的0.2%BSA培養(yǎng)基饑餓12 h。去掉小室內(nèi)陳舊培養(yǎng)基，向各組細胞分別加入300 μL巨噬細胞上清液和PA(0.16 mmol/L)處理巨噬細胞后的上清液。置孵箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽去除Transwell 上室內(nèi)的基質(zhì)膠，用5%多聚甲醛固定Transwell 上層小室膜下表層的侵襲細胞10 min 后，用1%結(jié)晶紫染色20 min，置于顯微鏡下拍照。實驗結(jié)果通過ImageJ 軟件分析。

2.4 劃痕實驗分析肝癌細胞的橫向遷移能力 在鋪滿匯合度達95%的單層HepG2 細胞的Transwell(24孔板)小室內(nèi)，用10 μL 移液槍尖端輕輕筆直劃痕，PBS 緩沖液輕輕洗去脫落細胞，在無血清的共培養(yǎng)體系中，向24孔板內(nèi)相應(yīng)加入有PA處理和無PA處理的巨噬細胞的上清液，劃痕后的HepG2細胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)0 h、24 h和48 h的細胞，觀察細胞的遷移情況并用倒置顯微鏡拍照,測量共培養(yǎng)前后劃痕的寬度，通過ImageJ 軟件分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用獨立樣品t檢驗對兩樣本進行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PA對THP-1來源巨噬細胞遷移的影響

用0.16 mmol/L PA處理THP-1來源的巨噬細胞24 h后，巨噬細胞的遷移數(shù)量較對照組顯著增加(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.Palmitate promoted macrophage migration. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs control group.

2 PA對THP-1來源巨噬細胞炎癥因子和趨化因子表達的影響

用0.16 mmol/L PA處理THP-1來源的巨噬細胞并收集進行相應(yīng)檢測，處理后的巨噬細胞IL-1β、TNF-α和IL-6 的mRNA含量較對照組有升高(P<0.01)；同時，巨噬細胞的趨化因子 MCP-1的表達較對照組也明顯增加(P<0.01)。這說明PA刺激能促進THP-1來源的巨噬細胞IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的表達，見圖2。

Figure 2.Relative mRNA expression in the macrophages. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

3 PA處理的巨噬細胞對HepG2細胞遷移和侵襲的影響

通過測量各組0 h、24 h和48 h 3個時點的HepG2細胞的相對遷移距離評估細胞劃痕實驗結(jié)果。結(jié)果顯示，相比對照組，用PA刺激后的巨噬細胞上清液處理的HepG2細胞橫向遷移能力顯著提高，表明PA激活的巨噬細胞可顯著促進HepG2細胞的橫向遷移，見圖3。

Transwell 侵襲實驗結(jié)果顯示：相比control組，實驗組HepG2細胞的縱向遷移能力也有顯著提高(P<0.05)，說明PA刺激下巨噬細胞上清液可顯著促進HepG2細胞的縱向遷移，見圖4。

4 PA處理的巨噬細胞對HepG2細胞相關(guān)因子表達的影響

用0.16 mmol/L PA刺激THP-1來源的巨噬細胞后的上清液處理HepG2細胞，并收集HepG2細胞進行相應(yīng)檢測。我們發(fā)現(xiàn)相比control組，實驗組HepG2細胞IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1 的mRNA表達升高(P<0.01)；另外我們還發(fā)現(xiàn)實驗組HepG2的E-cadherin表達較control組明顯降低(P<0.01)，而N-cadherin的表達較對照組明顯升高(P<0.01)。以上結(jié)果提示，PA刺激巨噬細胞的上清液可顯著促進HepG2細胞產(chǎn)生炎癥/趨化因子，并能促進HepG2細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，見圖5、6。

Figure 3.Migration assay of the HepG2 cells. Mean±SEM. n= 3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

Figure 5.Relative mRNA expression in the HepG2 cells. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

Figure 6.Relative mRNA expression of epithelial-mesenchymal transition markers in the HepG2 cells. Mean±SEM. n=4. **P<0.01 vs control group.

討 論

腫瘤微環(huán)境是決定腫瘤細胞行為的主要影響因素，在腫瘤發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用[6]。炎癥對腫瘤微環(huán)境的形成具有非常重要的作用，多種炎癥介質(zhì)都可以促進腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[7-8]。肥胖狀態(tài)下，脂肪組織巨噬細胞分泌大量炎癥因子(如TNF-α、MCP-1、 IL-6和IL-1β)，使機體長期處于持續(xù)的、全身性的、低水平的炎癥狀態(tài)[4]。最新研究提示：肥胖可以增加肝細胞癌的發(fā)病率，降低患者生存率，但機制尚未完全揭示[9-10]。

PA是游離脂肪酸組成成分中含量最高、致炎能力強的一種飽和脂肪酸，常用于建立體外的胰島素抵抗和炎癥模型。PA是TLR4的天然內(nèi)源性配體，當(dāng)PA水平升高時，可以上調(diào)TLR4受體的表達和/或激活TLR4/NF-κB 信號通路[12-13]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：棕櫚酸刺激THP-1來源的巨噬細胞，能促進巨噬細胞的浸潤，并使巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥因子/趨化因子。許多上皮腫瘤細胞都具有EMT的能力，這一過程可由旁分泌/內(nèi)分泌/自分泌的多種炎癥因子(比如IL-1β、IL-6和TNF-α)所誘導(dǎo)[14]。我們的結(jié)果表明：用棕櫚酸刺激巨噬細胞的上清液處理HepG2細胞，可促進HepG2細胞自身也產(chǎn)生大量炎癥/趨化因子，進一步地放大了炎癥效應(yīng)。在炎癥因子的作用下，HepG2細胞的浸潤遷移能力顯著增強。既往研究已經(jīng)表明：IL-1β等炎癥因子可通過NF-κB等途徑，抑制上皮細胞黏附分子E-cadherin表達，促進肝癌細胞EMT，從而影響細胞的轉(zhuǎn)移潛能[15]。本研究也證實：與對照組相比，經(jīng)棕櫚酸刺激巨噬細胞的上清液處理的HepG2細胞的E-cadherin表達下調(diào)，N-cadherin表達上調(diào)，提示HepG2的轉(zhuǎn)移潛能得到了增強。

綜上所述，本研究表明棕櫚酸刺激作用下可以增加巨噬細胞的局部浸潤，促進巨噬細胞產(chǎn)生大量炎癥因子/趨化因子；進一步地巨噬細胞通過旁分泌/內(nèi)分泌作用于HepG2細胞，促進HepG2細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，加重HepG2細胞的浸潤與遷移。因此，本研究在細胞模型上初步探討了高棕櫚酸血癥狀態(tài)下，巨噬細胞促進HepG2細胞浸潤轉(zhuǎn)移的可能機制，為解讀肥胖等伴代謝性疾病與腫瘤的復(fù)雜關(guān)系提供一定的實驗依據(jù)和參考。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of palmitate-stimulated macrophages on invasion and migration of HepG2 cells

WANG Yan, YAN Yong, ZHONG Shan, RUAN Xiong-zhong, CHEN Ya-xi, ZHAO Lei

(CentreforLipidResearch,ChongqingKeyLaboratoryofLipidandGlucoseMetabolism,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:laleinlz@hotmail.com)

AIM: To investigate the impact of palmitate-stimulated macrophages on the invasion and migration of HepG2 cells and to explore the underlying mechanism. METHODS: Human acute monocytic leukemia cell line THP-1 were induced to macrophages by phorbol myristate acetate and were stimulated with palmitate (0.16 mmol/L). The culture supernatants were collected and used to incubate HepG2 cells. The effect of palmitate on migration of the macrophages was detected by Transwell chamber assay. The mRNA expression of target genes was measured by RT-qPCR. The invasion and migration of the HepG2 cells were assessed by invasion assay and scratch test. RESULTS: Palmitate promoted the migration of the macrophages and increased the mRNA levels of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in the macrophages. The invasion and migration of the HepG2 cells incubated with conditioned media from palmitate-stimulated macrophages were greater than those of the HepG2 cells incubated with conditioned media from macrophages without palmitate. The media of palmitate-stimulated macrophages up-regulated the mRNA expression of cytokines and N-cadherin, and down-regulated the mRNA expression of E-cadherin in the HepG2 cells. CONCLUSION: Palmitate-stimulated macrophages promote the invasion and migration of HepG2 cells through paracrine/endcrine loop.

Palmitate; HepG2 cells; Macrophages; Inflammatory cytokines; Cell invasion; Cell migration

1000- 4718(2017)03- 0495- 05

2016- 10- 26

2016- 12- 12

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 31540029); 重慶市科委科技計劃(No. cstc2016jcyjA0545)

△通訊作者 Tel: 023-68486780; E-mail: laleinlz@hotmail.com

R363.2; R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.018