王園園， 曹新冉， 楊 旻， 王曉瓊， 于奎鵬， 董 波△， 傅余芹△

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟南 250033；2山東省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟南 250021)

ACE2內(nèi)源性激動劑DIZE對糖尿病腎病大鼠的保護作用*

王園園1, 2， 曹新冉2， 楊 旻2， 王曉瓊2， 于奎鵬1， 董 波2△， 傅余芹1△

(1山東大學(xué)第二醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 濟南 250033；2山東省立醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟南 250021)

目的： 觀察血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)內(nèi)源性激動劑乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(DIZE)對糖尿病腎病(DN)大鼠的保護作用。方法: 30 只Wistar大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、DN組和DIZE處理組(DIZE組)。DN組與DIZE組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(65 mg/kg)建立糖尿病模型，12 周后糖尿病腎病大鼠模型建立后給予DIZE 15 mg·kg-1·d-1或等量生理鹽水皮下注射4 周處理。16 周末稱量體重和腎重，計算腎質(zhì)量體質(zhì)量比(KW/BW)，收集血、尿標(biāo)本，檢測血糖(GLU)、24 h尿蛋白(24UP)及血清肌酐(SCr)等指標(biāo)。通過PAS染色觀察各組腎臟病理變化；ELISA法檢測大鼠AngⅡ、Ang-(1-7)、TGF-β1及VCAM-1水平的變化；通過免疫組化觀察collagen I和FN蛋白表達的變化；利用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測大鼠腎組織collagen I和FN mRNA含量的變化；Western blot觀察各組大鼠ACE2蛋白表達的變化。結(jié)果: DIZE顯著提高了糖尿病大鼠ACE2的表達(P<0.05)，降低了糖尿病大鼠血漿AngⅡ含量(P<0.05)，提高了Ang-(1-7)的水平(P<0.05)。與NC組大鼠相比，DN組與DIZE組大鼠的24UP、SCr和KW/BW明顯升高(P<0.05)，collagen I和FN mRNA水平及蛋白表達量增加，腎臟組織TGF-β1及VCAM-1明顯上升(P<0.05)。DIZE組與DN組大鼠相比， 24UP和SCr水平降低(P<0.05)，GLU和KW/BW無明顯差異，collagen I和FN mRNA含量及蛋白表達量減少，腎臟組織TGF-β1及VCAM-1水平降低(P<0.05)。結(jié)論: ACE2內(nèi)源性激動劑DIZE顯著提高了ACE2的活性，增加了Ang-(1-7)的含量，從而降低了腎臟纖維化及炎癥水平，并對糖尿病腎病大鼠起到保護性作用。

糖尿病腎?。?血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2； 乙酰甘氨酸重氮氨苯脒

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是最常見的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)主要的病因[1]。研究指出腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotesin system，RAS)經(jīng)典軸的過度激活，尤其是血管緊張素Ⅱ (angiotesin Ⅱ, AngⅡ)的產(chǎn)生增多在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[2]。近年來發(fā)現(xiàn)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的同源類似物，是新型的獨立的RAS成員[3-4]。國內(nèi)外研究表明ACE2與心腎疾病密切相關(guān)，主要功能是將AngⅡ水解為Ang-(1-7)，從而起到抗炎及抗氧化應(yīng)激等作用[5-6]。新近研究指出經(jīng)典的抗錐蟲藥物乙酰甘氨酸重氮氨苯脒(diminazene aceturate，DIZE)是ACE2的內(nèi)源性激動劑[7]。DIZE能夠提高ACE2的活性，進而激活RAS的保護軸 ACE2/Ang-(1-7)/Mas。DIZE作為ACE2內(nèi)源性激動劑在糖尿病腎病中對機體是否具有保護性作用尚未有明確報道。本研究主要探討DIZE對糖尿病腎病大鼠是否具有保護性作用，從而為臨床防治糖尿病腎病提供新的思路。

材 料 和 方 法

1 動物

健康成年雄性Wistar大鼠30只，體重200～220 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供。

2 主要藥品與試劑

DIZE購自Fluka；鏈脲佐菌素購自Sigma；高碘酸-希夫染色(periodic acid-Schiff，PAS)染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；抗collagen I抗體購自Abcam；抗ACE2抗體購自Abcam；抗纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)抗體購自博奧森公司；TRIzol 試劑盒購自Invitrogen;RT-qPCR體系和SYBR Premix Ex Taq DRR041S試劑盒為TaKaRa產(chǎn)品;引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成；大鼠AngⅡ檢測試劑盒和Ang-(1-7)檢測試劑盒購自北京冬歌偉業(yè)科技有限公司；大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)和血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) ELISA試劑盒購自北京達科為生物技術(shù)有限公司；大鼠尿蛋白ELISA 試劑盒和大鼠血清肌酐ELISA 試劑盒購自武漢新啟迪生物科技有限公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；RIPA 裂解液和苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購自北京索萊寶科技有限公司。Tween-20 和 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司。

3 儀器設(shè)備

酶標(biāo)儀為Thermo產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光儀(Amersham Imager 600)購自GE；Olympus熒光顯微鏡購自O(shè)lympus。普通PCR儀為Eppendorf產(chǎn)品，RT-qPCR擴增儀為Roche產(chǎn)品。

4 主要方法

4.1 糖尿病腎病大鼠模型制備、分組及藥物干預(yù)

30只Wistar雄性健康大鼠，體重200～220 g，隨機分為正常對照(normal control, NC)組、DN組和DIZE組，每組10只。動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，禁食12 h，DN組及DIZE組大鼠腹腔一次性注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)65 mg/kg，正常對照組注射相同劑量的檸檬酸鹽緩沖液。72 h后監(jiān)測大鼠血糖，以血糖>16.6 mmol/L為糖尿病模型動物。大鼠維持性飼料繼續(xù)喂養(yǎng)12 周，建立糖尿病腎病模型。DIZE組給予DIZE 15 mg·kg-1·d-1皮下注射4周，DN組取等量生理鹽水皮下注射4周。其中DN組與DIZE組各有2 只死亡。

4.2 標(biāo)本采集 16周末將大鼠置于代謝籠中，收集24 h尿液后準(zhǔn)確稱量大鼠體重，腹腔麻醉后心臟取血。取兩側(cè)腎臟稱重，左側(cè)腎臟置于-80 ℃冰箱中保存，右側(cè)腎臟置于4%多聚甲醛中固定，用于石蠟切片制備。

4.3 一般指標(biāo)檢測 腎質(zhì)量體質(zhì)量比(%)=兩側(cè)腎重(g)/體重(g)×100%。代謝籠收集24 h尿，腹腔麻醉后心臟取血，利用ELISA試劑盒測定尿蛋白及血清肌酐濃度。

4.4 PAS染色觀察腎臟病理變化 甲醛固定組織后脫水浸蠟，石蠟包埋，切片3 μm，利用PAS染色試劑盒進行PAS染色，光學(xué)顯微鏡拍照觀察各組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

4.5 大鼠血漿AngⅡ和Ang-(1-7)含量的測定 心臟取血約5～10 mL， 存放于EDTA 抗凝管中，3 000 r/min， 離心 15 min后取上清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA測定血漿Ang Ⅱ和Ang-(1-7)水平，按試劑盒說明書操作，加樣、孵育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀在 450 nm波長上讀出各孔吸光度 (A)， 并根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計算各組大鼠血漿Ang Ⅱ和Ang-(1-7)的含量。

4.6 大鼠腎組織TGF-β1和VCAM-1含量的測定 ELISA測定腎組織TGF-β1和VCAM-1水平。稱取約50 mg大鼠腎組織，加入生理鹽水 0.5 mL，用勻漿器在冰上將標(biāo)本研磨成勻漿，4 ℃、 3 000 r/min離心15 min后，吸取組織勻漿的上清液于-20 ℃保存。 依照試劑盒說明書操作，加樣、孵育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)，于波長 450 nm 的全光譜分光光度計上讀取各孔A值，根據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制回歸曲線，依次計算各組大鼠腎組織TGF-β1和VCAM-1含量。

4.7 免疫組化觀察腎組織collagen I和FN的表達 腎臟組織切片經(jīng)過脫蠟至水、EDTA液抗原修復(fù)、3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉等步驟后，分別加入抗collagen I和FN的Ⅰ抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，滴加 Ⅱ 抗，37 ℃孵育20 min，DAB 顯色。顯色后呈棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。

4.8 實時熒光定量PCR檢測大鼠腎組織collagen I和FN mRNA的表達 采用TRIzol法提取大鼠腎組織總RNA，取1 μg總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。使用Light Cycler 儀器進行PCR擴增，采用SYBR Green I染料法檢測各目的基因的相對表達量，引物序列見表1。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，循環(huán)40 次。記錄熒光信號到達設(shè)定閾值時達到的循環(huán)數(shù)(theshold cycle,Ct),采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

4.9 腎組織ACE2蛋白表達的測定 取-80 ℃保存的腎組織，稱重、剪碎，每100 mg加入預(yù)冷的裂解緩沖液 1.0 mL，超聲破碎儀中(冰浴)勻漿3 次后置于冰上放置30 min，使其裂解充分； 4 ℃、14 000 r/min 離心15 min；吸取上清。取上清并用BCA法測定蛋白濃度。上清充分混合加 5×蛋白上樣緩沖液后于100 ℃煮沸變性 10 min，于-20 ℃冰箱保存。將變性好的組織樣品冰上溶解后上樣，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V電泳。 電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜 1.5 h(經(jīng)甲醇處理的 PVDF膜)，置于 5% 脫脂牛奶封閉1.5 h后，置于Ⅰ抗(ACE2及β-actin抗體分別用Ⅰ抗稀釋液1∶1 000稀釋)中，置 4 ℃搖床振蕩過夜，1×TBST 洗 3 次，每次 15 min。 置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗( 用5%脫脂牛奶1∶5 000 稀釋)中孵育 1 h，1×TBST，每次 15 min，化學(xué)發(fā)光儀發(fā)光，采用ImageJ軟件處理圖像。

表1 PCR引物序列

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間差異采用單因素方差分析比較，兩兩比較采用Bonferroni校正后的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

NC組大鼠飲水、攝食、精神、皮毛及大小便均無異常；與NC組大鼠相比。DN組和DIZE組大鼠活動減少，體重減輕，血糖升高(P<0.05)。而DN組與DIZE干預(yù)組大鼠的體重和血糖差異均無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

2 DIZE對大鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比及生化指標(biāo)的影響

與NC組比較，DN組與DIZE組大鼠的腎質(zhì)量體質(zhì)量比、24 h尿蛋白和血清肌酐均明顯上升(P<0.05)；與DN組比較，DIZE組大鼠的 24 h尿蛋白和血清肌酐水平降低(P<0.05)，腎質(zhì)量體質(zhì)量比的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表2。

表2 各組大鼠生化指標(biāo)的變化

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDN group.

3 PAS染色觀察各組大鼠腎臟組織的病理學(xué)變化

PAS染色下可見，與NC組大鼠相比，DN組及DIZE組大鼠的腎小球系膜區(qū)系膜細胞及細胞外基質(zhì)增生，且腎小球基底膜增厚；與DN組相比，DIZE組大鼠腎小球系膜細胞增多及系膜基質(zhì)增生明顯減輕，且基底膜增厚也明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The representative images of PAS staining in each group under light microscope (×400).

4 ELISA測定DIZE對DN大鼠血漿AngⅡ和Ang-(1-7)含量的影響

與NC組大鼠相比，DN組大鼠血漿AngⅡ水平上升，Ang-(1-7)水平下降(P<0.05)；而與DN組大鼠相比，DIZE干預(yù)組大鼠血漿AngⅡ水平下降，Ang-(1-7)水平上升(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.Comparison of plasma AngⅡ and Ang-(1-7) in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

5 大鼠腎臟TGF-β1和VCAM-1含量的變化及分析

ELISA檢測大鼠腎組織TGF-β1和VCAM-1含量，結(jié)果可見DN組大鼠腎組織中的TGF-β1和VCAM-1含量均較NC組明顯升高(P<0.05)，而DIZE干預(yù)組較DN組大鼠明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The changes of renal VCAM-1 and TGF-β1 in each group detected by ELISA. Mean±SD. n= 8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

6 各組大鼠腎組織collagen I和FN表達的變化

Collagen I和FN為腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)的主要成分，免疫組化染色下，DN組及DIZE組大鼠的collagen I和FN的表達較NC組增加，DIZE組較DN組大鼠腎臟組織的collagen I和FN表達明顯降低，見圖4。

Figure 4.The representative image of immunohistochemical staining for collagen I and FN in each group under light microscope (×400).

實時熒光定量PCR檢測也顯示DIZE組大鼠腎組織collagen I和FN的 mRNA水平較DN組明顯下降(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of collagenⅠand FN in different groups. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs DN group.

7 Western blot 實驗觀察各組大鼠ACE2表達

DIZE可明顯增加DN大鼠ACE2的表達水平(P<0.05)，見圖6。

討 論

DN發(fā)病機制復(fù)雜，RAS系統(tǒng)激活、慢性炎癥及間質(zhì)纖維化等都在DN的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。研究表明DN時AngⅡ水平升高，VCAM-1、TGF-β1等因子表達增加[8]，進而促進細胞外基質(zhì)如collagen I和FN的產(chǎn)生，促進腎臟纖維化，加重糖尿病導(dǎo)致的腎臟損傷。而ACE2是最近發(fā)現(xiàn)的RAS新成員，ACE2主要將AngⅡ 轉(zhuǎn)化為Ang-(1-7)。Ang-(1-7)被認為是 AngⅡ的內(nèi)源性拮抗因子，過往研究表明Ang-(1-7)可以抑制 AngⅡ引起的腎間質(zhì)纖維化[9]。已經(jīng)有研究指出ACE2基因過表達可減輕糖尿病導(dǎo)致的腎損害，其機制可能是Ang-(1-7)水平上升，進而減輕了氧化應(yīng)激水平及降低了炎癥因子的表達[10]。DIZE被認為是ACE2內(nèi)源性激動劑，可提高ACE2的活性。已有研究指出DIZE能夠通過抗氧化應(yīng)激改善大鼠腎缺血再灌注損傷[11]。且DIZE在肺動脈高壓及缺血導(dǎo)致心臟重塑的動物模型中起到保護作用[7,12]，提示DIZE可能通過抗氧化應(yīng)激及抗炎改善糖尿病導(dǎo)致的腎臟纖維化。

Figure 6.The protein expression of ACE2 in each group by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs DN group.

本課題組成功誘導(dǎo)DN模型后予以DIZE 15 mg·kg-1·d-1皮下注射4周，結(jié)果顯示DIZE能夠增加DN大鼠ACE2與血漿Ang-(1-7)水平的表達，明顯改善DN大鼠的腎臟纖維化及炎癥。我們分別稱重了各組大鼠的體重、腎重，計算了腎質(zhì)量體質(zhì)量比，檢測了血糖、24 h尿蛋白、血肌酐等指標(biāo)， DIZE組大鼠的24 h 尿蛋白、血肌酐較DN組明顯下降。ELISA檢測DN組及DIZE組大鼠腎組織TGF-β1及VCAM-1的含量明顯高于NC組，而DIZE組大鼠TGF-β1和VCAM-1含量較DN組降低。免疫組化及實時熒光定量PCR顯示DIZE組的collagen I和FN的表達水平較DN組明顯下降。這提示DIZE能減輕糖尿病導(dǎo)致的腎損害，其機制可能是DIZE提高了ACE2的活性，增加了體內(nèi)Ang-(1-7)水平，進而降低了腎組織炎癥及纖維化水平。

ACE2是新發(fā)現(xiàn)的能拮抗RAS經(jīng)典軸的保護性肽酶，具有腎臟保護性作用。DIZE作為ACE2的內(nèi)源性激動劑，能促進ACE2的表達活性，國外已有許多研究指出DIZE具有心腎方面的保護作用。本課題研究結(jié)果表明，DIZE能通過提高ACE2的活性，增加體內(nèi)Ang-(1-7)水平，下調(diào)腎臟炎癥及纖維化水平，從而延緩糖尿病腎病的進展，為臨床上糖尿病腎病的防治提供了新的思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effect of DIZE, an ACE2 activator, on rats with streptozotocin-induced diabetic nephropathy

WANG Yuan-yuan1, 2, CAO Xin-ran2, YANG Min2, WANG Xiao-qiong2, YU Kui-peng1, DONG Bo2, FU Yu-qin1

(1DepartmentofNephrology,TheSecondHospitalofShandongUniversity,Jinan250033,China;2DepartmentofCardiology,ShandongProvincialHospital,Jinan250021,China.E-mai:yuqinfuhappy@sina.com;dbsh2004@163.com)

AIM: To observed the protective effect of diminazene aceturate (DIZE), an angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) activator, on diabetic nephropathy (DN) rats. METHODS: Male Wistar rats (n=30) were randomly divided into normal control (NC) group, DN group and DIZE group (each group consisted of 10 rats). The rats in DN group and DIZE group were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin at dose of 65 mg/kg. After 12 weeks, the rats in DIZE group and DN group received subcutaneous injection of DIZE (15 mg·kg-1·d-1) or vehicle for 4 weeks. The samples of blood and urine were collected at week 16, and ratio of kidney weight to body weight (KW/BW), plasma glucose (GLU), 24 h urinary protein (24UP) and serum creatinine (SCr) were measured. The renal pathological changes in each group were observed by periodic acid-Schiff (PAS) staining and immunohistochemistry. The levels of AngⅡ and Ang-(1-7) in the plasma, and TGF-β1 and VCAM-1 in the renal tissues were measured by ELISA. The mRNA and protein levels of collagen I and FN were determined by quantification real-time PCR and immunohistochemistry. The effects of DIZE on the expression of ACE2 in DN rats were determined by Western blot. RESULTS: DIZE remarkably increased the expression of ACE2 and Ang-(1-7) in DN rats. Compared with NC group, the GLU, KW/BW, 24UP, SCr, and the expression of collagen I, FN, TGF-β1 and VCAM-1 in DN group and DIZE group were increased. However, after treatment of the DN rats with DIZE, these indicators were decreased except the KW/BW. The GLU showed no significant change. CONCLUSION: DIZE raised the activity of ACE2 and increased the expression of Ang-(1-7), thus alleviating fibrosis and inflammation in the kidney and having therapeutic potential for diabetic nephropathy.

Diabetic nephropathy; Angiotensin-converting enzyme 2; Diminazene aceturate

1000- 4718(2017)03- 0469- 06

2016- 09- 18

2016- 12- 09

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81170207)

△通訊作者 Tel： 0531-85875451； E-mail： 傅余芹 yuqinfuhappy@sina.com； 董 波 dbsh2004@163.com

R587.2;R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.014