李克躍，石承先，湯可立，魏國微，劉振華，黎濤，張帥民，徐賢剛

（貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002）

良性膽道狹窄（benign biliary stricture，BBS）是由醫(yī)源性膽道損傷等良性疾病引起的膽管腔疤痕性縮窄，常表現(xiàn)為膽管炎、肝功能不全等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者健康及生命[1]，近年來發(fā)病率逐漸增高。報(bào)道[2-4]顯示膽管成纖維細(xì)胞大量增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smads通路的異常表達(dá)在膽管疤痕修復(fù)及BBS形成過程中均發(fā)揮了重要作用。藥物是疤痕治療的選項(xiàng)之一，令人遺憾的是目前臨床上依舊缺乏一種特效、可靠的藥物[5]。白細(xì)胞介素13（interleukin 13，IL-13）具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞I型膠原表達(dá)的作用[6-7]，而膠原的過度沉積是BBS及膽管疤痕的主要生物學(xué)特征之一。地塞米松（Dexamethasone，Dex）已被用于治療皮膚疤痕性疾病[8-9]。但I(xiàn)L-13對(duì)膽管成纖維細(xì)胞的作用尚不清楚，Dex對(duì)IL-13處理的膽管成纖維細(xì)胞的作用也不清楚。本研究對(duì)IL-13干預(yù)的兔膽管成纖維細(xì)胞使用Dex處理，觀察TGF-β1/Smads通路的表達(dá)及細(xì)胞增殖水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)盒、β-actin引物、TRIzol、全蛋白提取試劑盒、UNIQ-10柱式TRIZOL總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；TGF-β1、Smad3及Smad4引物（上海Introgen公司）；TGF-β1上游引物序列為：5'-GGC TCA CCT TCT GCC CGT CT-3'，下游引物序列為：5'-GTC TCG GTA TCC CAC GAA AGA AAC G-3'；Smad3上游引物序列為：5'-CCA GTT CTA CCT CCT GTG CTG-3'，下游引物序列為：5'-GGG GTC TCT GGA ATA TTG CTC-3'；Smad4上游引物序列為：5'-CGC GGA TCA ACC GAG ACA TAT ACT-3'，下游引物序列為：5'-GGC AGG CTG ACT TGT G-3'；β-actin上游引物序列為：5'-CTC TCC ACC TTC CAG CAG AT-3'，下游引物序列為：5'-TGG CTC TAA CAG TCC GCC TA-3'；抗-Smad4單克隆抗體（ab187094）及抗-TGFβ1單克隆抗體（ab99562）（英國abcam公司）；抗-細(xì)胞角蛋白單克隆抗體（C-1801）、抗-波形蛋白單克隆抗體（V2258）、IL-13（編號(hào)I1896）、PVDF膜（美國sigma公司）；HRP標(biāo)記的第二抗體及抗-β-actin單克隆抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑盒（美國Millipore公司）；SYBR?Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)（大連寶生物工程有限公司）；DAPI（瑞士Roche公司）；地塞米松磷酸鈉注射液（武漢華中藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150204）；家兔2只（購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2 動(dòng)物模型的建立、細(xì)胞的獲取及細(xì)胞鑒定

清潔級(jí)家兔2只，術(shù)前12 h禁食。耳緣靜脈注射2.5%戊巴比妥鈉（40～45 mg/kg）麻醉，取上腹部正中4～6 cm長(zhǎng)切口，取出約2 cm長(zhǎng)膽總管后用深麻醉處死動(dòng)物。將膽總管用無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗3次，剪為約2～3 mm3大小，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并加入少量含有20%（v/v）FBS、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)液放入37 °C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[10]。使用差速貼壁法分離純化細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右時(shí)傳代。對(duì)第3代細(xì)胞用細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)其波形蛋白及細(xì)胞角蛋白抗體的表達(dá)進(jìn)行成纖維細(xì)胞的鑒定[10-11]。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為第3～5代成纖維細(xì)胞。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及各組細(xì)胞的處理

分為如下：空白對(duì)照；IL-13組（IL-13 100 μg/L）[12]；低濃度Dex組（IL-13 100 μg/L+Dex 0.01 mg/mL）；中濃度Dex組（IL-13 100 μg /L+Dex 0.05 mg/mL）；高濃度Dex組（IL-13 100 μg /L+Dex 0.25 mg/mL）[13]。將消化好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板或6孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/孔（96孔板）或2×105/孔（6孔板），含10%FBS的培養(yǎng)基先培養(yǎng)4～6 h，然后再用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓過夜，根據(jù)分組的不同加用對(duì)應(yīng)成分試劑分別培養(yǎng)48 h（培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2）。

1.4 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1 細(xì)胞免疫熒光法鑒定成纖維細(xì)胞 將細(xì)胞接種至帶有玻璃片的六孔板中（2×105/孔）培養(yǎng)24 h，接著進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，步驟為：4%的多聚甲醛固定（15 min）；0.1% Triton-100孵 育（10 min）；10%的山羊血清封閉（30 min）；一抗4 ℃過夜；二抗孵育30 min（室溫）；加入l:100稀釋的DAPI；陰性對(duì)照以PBS代替一抗。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.2 CCK-8法測(cè)定成纖維細(xì)胞增殖水平 具體按說明書進(jìn)行。接種成纖維細(xì)胞于96孔板（2×104/孔），每孔 100 μL，做 5個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，然后根據(jù)不同的分組加入含有對(duì)應(yīng)成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8 10 μL培養(yǎng)2.5 h，通過酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞的光密度（optical density，OD）值。采用扣除本底的策略來消除誤差。

1.4.3 real-time PCR測(cè)定各組細(xì)胞中TGF-β1、Smad3及Smad4 mRNA的表達(dá) 將細(xì)胞提取總RNA，用完整性高、純度好的RNA合成cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBRRPremix 10 μL，樣品 cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，雙蒸水 6 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，重復(fù)4次。設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，然后進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s）。ABI Stepone系統(tǒng)收集及分析結(jié)果，引物特異性好時(shí)溶解曲線為單峰，用β-actin為內(nèi)參，目的基因的相對(duì)表達(dá)通過2-△△Ct方法計(jì)算。

1.4.4 Western blot檢 測(cè) 組 細(xì) 胞 中 TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測(cè)蛋白濃度，以聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。蛋白經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行封閉，1:5 000稀釋目的蛋白一抗，在4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）緩沖液清洗PVDF膜3次。1:5 000稀釋二抗，室溫孵育二抗2 h，TBST搖床上洗PVDF膜3次，每次10 min。電化學(xué)發(fā)光后通過顯影、定影方法掃描膠片，β-actin為內(nèi)參，用Quantity one系統(tǒng)分析目的條帶的相對(duì)灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，統(tǒng)計(jì)分析用單因素方差分析（Bonferroni法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成纖維細(xì)胞的鑒定

鏡下可見所培養(yǎng)細(xì)胞含有單個(gè)核細(xì)胞，從原代的不規(guī)則形逐漸變?yōu)樗笮蔚某衫w維樣細(xì)胞。第3代成纖維樣細(xì)胞波形蛋白細(xì)胞免疫熒光陽性，角蛋白細(xì)胞免疫熒光陰性，符合成纖維細(xì)胞的特點(diǎn)（圖1）。

2.2 各組細(xì)胞增殖水平的測(cè)定

膽管成纖維細(xì)胞經(jīng)IL-13處理后的OD值較空白對(duì)照組明顯增加（均P＜0.05）；使用Dex干預(yù)后，IL-13處理的膽管成纖維細(xì)胞的增殖水平受到不同程度的抑制，中、高濃度的Dex對(duì)細(xì)胞增殖的抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且呈一定的濃度依耐性（表1）。

表1 各組細(xì)胞增殖情況（±s）Table 1 Proliferation in each group of cells（±s）

表1 各組細(xì)胞增殖情況（±s）Table 1 Proliferation in each group of cells（±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與IL-13組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. blank control group; 2) P＜0.05 vs. IL-13 group

組別 OD值 相對(duì)IL-13組抑制率（%）空白對(duì)照組 0.332±0.005 13.99 IL-13組 0.386±0.0081) —低濃度Dex組 0.382±0.0041) 1.04中濃度Dex組 0.370±0.0071),2) 4.15高濃度Dex組 0.357±0.0071),2) 7.51

2.3 各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3及Smad4基因mRNA表達(dá)水平

膽管成纖維細(xì)胞經(jīng)IL-13處理后TGF-β1、Smad3及Smad4的mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（P＜0.05）；使用Dex干預(yù)后，IL-13處理的膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1、Smad3及Smad4基因mRNA表達(dá)均明顯的下調(diào)（均P＜0.05），且呈現(xiàn)濃度依耐性（圖2）。

2.4 各組細(xì)胞TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)水平的測(cè)定

IL-13處理的膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（均P＜0.05）；使用Dex干預(yù)后，IL-13處理的膽管成纖維細(xì)胞的TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)受到不同程度的下調(diào)，其中低濃度的Dex對(duì)Smad4蛋白的下調(diào)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），中、高濃度的Dex對(duì)TGF-β1及Smad4蛋白的下調(diào)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3）（表2）。

圖2 各組細(xì)胞TGF-β1、Smad3及Smad4 mRNA表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of TGF-β1, Smad3 and Smad4 mRNA in each group of cells

圖3 各組細(xì)胞TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)檢測(cè)Figure 3 Determination of TGF-β1 and Smad4 protein expressions in each group of cells

表2 各組細(xì)胞TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)水平（±s）Table 2 Expression levels of TGF-β1 and Smad4 protein in each group of cells（±s）

表2 各組細(xì)胞TGF-β1及Smad4蛋白表達(dá)水平（±s）Table 2 Expression levels of TGF-β1 and Smad4 protein in each group of cells（±s）

注：1）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與IL-13組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs. blank control group; 2) P＜0.05 vs. IL-13 group

組別 TGF-β1 Smad4空白對(duì)照組 1.000±0.022 1.000±0.044 IL-13組 2.018±0.0951) 1.919±0.0151)低濃度Dex組 1.968±0.0861) 1.810±0.0211),2)中濃度Dex組 1.825±0.0241),2) 1.666±0.0321),2)高濃度Dex組 1.639±0.0431),2) 1.580±0.0151),2)

3 討 論

不同程度的增生性疤痕的形成是組織損傷修復(fù)不可避免的結(jié)果，輕微的疤痕疙瘩組織可通過塑形得以糾正，但過多的疤痕疙瘩組織難以通過簡(jiǎn)單的塑形予以解決[14-15]。膽道增生性疤痕的形成意味著較高的BBS發(fā)病率。

成纖維細(xì)胞是組織損傷修復(fù)的主要效應(yīng)細(xì)胞。組織損傷后，成纖維細(xì)胞迅速增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）收縮及填補(bǔ)創(chuàng)面，同時(shí)又分泌TGF-β1等多種細(xì)胞因子調(diào)控組織修復(fù)過程[16-17]。正常情況下，當(dāng)創(chuàng)面被完全表皮化，組織修復(fù)過程趨于停止，成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞就開始加速凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的分泌就明顯減少，同時(shí)開始加速降解；病理情況下，一些細(xì)胞因子表達(dá)異常，成纖維細(xì)胞等修復(fù)細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚而導(dǎo)致增生性疤痕形成。成纖維細(xì)胞是膽管疤痕修復(fù)及BBS形成的主要效應(yīng)細(xì)胞[3-4]。

TGF-β1是由成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖、腫瘤形成及進(jìn)展、疤痕形成等生理及病理過程中發(fā)揮了重要作用[18]。膽管疤痕組織及疤痕成纖維細(xì)胞中TGF-β1持續(xù)過表達(dá)，促使成纖維細(xì)胞過度增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，從而分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，同時(shí)調(diào)控其它細(xì)胞因子的分泌，引起瘢痕形成，TGF-β1是目前已知的與膽管疤痕形成最密切的細(xì)胞因子[2-4,10]。TGF-β1主要依賴于它與TβRⅢ、TβRII及TβRI受體、Smad3/Smad2、Smad4、Smad7/Smad6等蛋白形成的TGF-β1/Smads通路發(fā)揮其生物學(xué)作用，該通路中，Smad3及Smad2是R-Smad（受體Smad），Smad4是通用Smad（co-Smad），Smad7及Smad6是抑制Smad（I-Smad），該通路可自行通過正負(fù)反饋進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。TGF-β1/Smads通路的主要成分TβRII、TβRI、Smad4及TGF-β1等在膽管疤痕組織中均明顯高表達(dá)，提示TGF-β1/Smads通路在BBS形成過程中可能發(fā)揮了重要作用[2]。目前治療疤痕的重要措施之一就是調(diào)控疤痕組織及其成纖維細(xì)胞中TGF-β1/Smads通路的表達(dá)[19-20]。

IL-13有IL-13 Rαl和IL-13Rα2兩種結(jié)構(gòu)和功能截然不同的受體，IL-13Rαl通過與IL-4 Rα結(jié)合形成IL-13Rαl-IL-4Rα復(fù)合物參與IL-13的促纖維化作用[21]。IL-13在刺激成纖維細(xì)胞的遷移、增殖及活化并最終引起器官纖維化過程中發(fā)揮了重要作用[22]。IL-13通過調(diào)控氣道成纖維細(xì)胞中TGF-β1及基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2）的表達(dá)誘導(dǎo)I型膠原的產(chǎn)生[6]。并且IL-13在誘導(dǎo)氣道成纖維細(xì)胞產(chǎn)生I型膠原的過程中可能受到了JAK/STAT6/PDGF/ERK1/2 MAPK通路的調(diào)控[7]。研究還發(fā)現(xiàn)，鼠疤痕組織中的IL-13的表達(dá)明顯增高，提示IL-13在疤痕形成過程中可能發(fā)揮了重要作用[23]。IL-13在調(diào)控人的皮膚及疤痕成纖維細(xì)胞的膠原平衡過程中發(fā)揮了重要作用[24]。IL-13通過STAT6途徑促進(jìn)瘢痕成纖維細(xì)胞株膠原合成[25]。干擾素γ（IFN-γ）能抑制IL-13誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞I型膠原蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，從而抑制IL-13對(duì)成纖維細(xì)胞的纖維化作用[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示IL-13能上調(diào)膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的TGF-β1、Smad3及Smad4的mRNA及蛋白的表達(dá)（均P＜0.05），從而刺激膽管成纖維細(xì)胞的增殖（P＜0.05），提示IL-13可能通過活化膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路在膽管疤痕修復(fù)及BBS形成過程中發(fā)揮了重要作用。

報(bào)道[8-9]顯示Dex有抑制疤痕成纖維細(xì)胞增殖、抑制疤痕形成等作用，其機(jī)理可能與調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等因素有關(guān)。筆者[13]的前期研究結(jié)果也提示Dex能抑制BBS模型膽管成纖維細(xì)胞的增殖，調(diào)控BBS模型膽管成纖維細(xì)胞中TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Dex（0.05～0.25 mg/mL）能下調(diào)IL-13誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的TGF-β1、Smad3及Smad4的mRNA及蛋白的表達(dá)（均P＜0.05），從而抑制IL-13誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞的增殖（P＜0.05），提示Dex抑制BBS形成的機(jī)理之一可能與它抑制IL-13對(duì)膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的活化有關(guān)。

綜上所述，IL-13可能通過活化膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路在膽管疤痕修復(fù)及BBS形成過程中發(fā)揮了重要作用，Dex抑制BBS形成的機(jī)理之一可能與它抑制IL-13對(duì)膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1/Smads通路的活化有關(guān)。

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