蔣世強　潘能慶　鄢航

摘要 眼鏡蛇毒神經毒素（Cobrotoxin，CT）是一種短鏈神經毒素，最早是從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到的。因其在鎮(zhèn)痛和抗癌方面有著顯著的效果而成為研究的熱點，本文通過對近年來CT的結構、藥理作用、鎮(zhèn)痛、抗癌研究進展進行綜述，旨在為各位研究者提供基礎參考資料。

關鍵詞 眼鏡蛇；神經毒素；藥理作用；體外表達

中圖分類號 R282 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0255-02

Abstract The cobra venom neurotoxin（Cobrotoxin，CT） is a kind of short chain neurotoxin that is isolated from the Taiwan cobra venom at the earliest.Because of its significant analgesic and anti-cancer effect，CT is becoming a hot research.This article summarized the research progress of structure，pharmacological effect，analgesic and anticancer of CT in recent years，aimed to provide basic references for researchers.

Key words cobrotoxin；pharmacological effect；in vitro expression

眼鏡蛇神經毒素（Cobrotoxin，CT）不但在鎮(zhèn)痛作用上具有持久、無耐受性、無成隱性和不良反應少等優(yōu)點，同時具有抗癌作用。因此，其可開發(fā)成新型的鎮(zhèn)痛藥和抗癌藥，應用前景廣闊[1]。

1 眼鏡蛇神經毒素的結構

1965年，Yang等通過CM-cellulose柱和Sephadex G-25柱從臺灣眼鏡蛇蛇毒中分離得到一種棒狀晶體蛋白，將其命名為神經毒素，其毒性為粗毒的6.7倍，并具有熱穩(wěn)定性，但是通過胰蛋白酶消化后活性喪失[2]。CT的分子量約為7 KDa，由15種常見氨基酸組成，缺乏丙氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸，其空間結構為三指形，分子結構中一端為4個二硫鍵形成的致密內核，由內核向外伸出3對互為平行的肽鏈成三指形展開，分子中4個二硫鍵分別為Cys3-Cys24、Cys17-Cys41、Cys43-Cys54、Cys55-Cys60[3-6]。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn)CT的二硫鍵可以發(fā)生改變從而變成其同分異構體Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ，Cobrotoxin Ⅱ和Cobrotoxin Ⅲ二硫鍵分別變?yōu)镃ys43-Cys55、Cys54-Cys60和Cys43-Cys60、Cys54-Cys55（圖1）[8]。

2 眼鏡蛇神經毒素的藥理作用

眼鏡蛇神經毒素屬于短鏈突觸后神經毒素，能以極強的親和力與突觸后膜上的煙酰胺型乙酰膽堿受體結合，阻止神經-肌肉通路的去極化，阻礙神經沖動傳導[9]。若過量的CT將神經傳導完全阻礙時，生物個體將會死亡，Meng等[10]從孟加拉眼鏡蛇毒液中純化得到的CT對小鼠的LD50僅為0.08 mg/g。關于CT的作用機制及其作用的位點一直是研究的熱點，許多研究工作者已經做了不少探究工作。Chang等[11]對CT分子中的酪氨酸殘基與其生物活性的關系進行了研究，發(fā)現(xiàn)Tyr-25殘基的完整性在保持CT的活性構象中起著至關重要的作用。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CT分子中精氨酸殘基的修飾與CT的致死性和抗原性相關，Arg-30和Arg-33與CT的致死性有關，而Arg-30和Arg-36則與CT的抗原性有著密切關系。此外，還有類似的研究發(fā)現(xiàn)，完整的Trp-29、His-32、Lys-47、Glu-21都對CT活性構象的保持起著重要作用[13]。目前，盡管找到了不少可以改變CT活性構象的因素，但是還是沒有確定CT的作用位點，因而其與乙酰膽堿如何結合的機制尚不清楚。Aoyagi等[14]通過人工合成與CT相似的肽鏈并進行相關試驗，能夠得到一些與CT相類似的反應，并且合成肽具有CT 20%的毒性活性。

3 眼鏡蛇神經毒素的研究與應用

3.1 鎮(zhèn)痛研究及應用

眼鏡蛇神經毒素的鎮(zhèn)痛研究歷史悠久，自從1965年CT從臺灣眼鏡蛇中分離純化之后，CT的鎮(zhèn)痛研究就開始了，因其在鎮(zhèn)痛方面具有高效性、無耐受性、無成隱性、不良反應少而被廣泛研究。Chen等[15]的研究揭示了CT作用的機制。CT主要是通過作用于乙酰膽堿受體，從而阻礙神經傳導達到鎮(zhèn)痛的作用，對于CT鎮(zhèn)痛過程中發(fā)揮作用的位點至今還不確定，這也是今后的研究重點與難點，更是CT能否得到應用的關鍵點。

蛇毒鎮(zhèn)痛的應用早在我國20世紀70年代就出現(xiàn)了，曾才銘[16]用云南動物研究所用眼鏡蛇毒提純的神經毒素制成的針劑克痛靈用于臨床治療慢性腰腿痛，共治療了100余例，取得一定的效果。同樣的，蒲道學[17]將克痛靈用于治療神經性頭痛、三叉神經痛、坐骨神經痛共96例病人并且都取得了一定療效。這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑的主要成分便為蛇毒神經毒素，CT便是其鎮(zhèn)痛的主要成分之一。盡管我國蛇毒制劑的應用當時得到一定程度的推廣，但是這個名為“克痛靈”的蛇毒制劑并沒有得到更好的發(fā)展和升級，最后被市場淘汰，導致其淘汰的主要原因有4個：其一，當時蛋白分離技術的限制，導致得到的蛇毒制劑中含有其他成分，從而導致蛇毒制劑的效果不一致，有時還會有較大的副作用；其二，對蛇毒制劑的檢測及監(jiān)管不到位，導致蛇毒假制劑四處橫行，最終導致這個行業(yè)的沒落；其三，蛇毒分離成本過高，分離過程中回收率低，損失較多，因而無法產生更廉價的商品；其四，蛇毒的作用機制研究進展緩慢限制了蛇毒的應用。

3.2 抗癌研究

目前，CT在抗癌方面的研究報道還不像其鎮(zhèn)痛報道那樣多，不過在抗癌方面的研究并沒有停止過，最近Shen等[18-19]報道了CT的抗癌作用，其研究結果顯示，CT能夠明顯抑制A549細胞的體外生長，并且在CT作用過程中，通過激活P38-MARK信號通路上調細胞自噬的作用。此外，CT還能抑制A549細胞在裸鼠體內轉移。盡管CT的抗癌研究還不夠深入，但是從目前的研究報道來看，CT在抗癌的開發(fā)方面具有一定的潛力。人們期待在CT的抗癌效果、范圍、機制方面進行更深入的研究，以便為CT的抗癌應用打下堅實的基礎。

4 眼鏡蛇神經毒素體外表達的研究

眼鏡蛇神經毒素的克隆和表達始于20世紀90年代，主要得益于分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的基因被克隆，以及克隆的效率越來越高。對于CT的克隆與表達的研究目的主要有2個，一是為了方便對CT本身的研究，例如對其序列進行分析，或是對CT序列進行定點突變，再進行表達，從而確定某個點對CT的活性、結構的影響，Chang等[20]對特定的氨基酸進行改變，研究了單個氨基酸替換對整個分子結構的影響；二是為了獲得CT蛋白，以便應用于實踐中。由于蛇毒資源有限、蛇毒分離成本高、蛇毒成分復雜藥理作用不同，因而通過基因工程技術產生成分單一的蛇毒是破解這幾個難題的重要途徑，鄢航等[21-22]利用原核表達系統(tǒng)和真核系統(tǒng)對CT進行了表達，獲得了該蛋白，并檢測了其活性，結果發(fā)現(xiàn)，原核表達的CT活性不理想，而真核表達的CT具有較好的鎮(zhèn)痛活性，然而其采用的是昆蟲細胞表達，盡管表達蛋白的活性及產量都還不錯，但是該方法的成本較高，并不適合規(guī)?；a[23-27]。

5 展望

眼鏡蛇神經毒素作為突觸后神經毒素，有著非常好的鎮(zhèn)痛效果及無成隱的優(yōu)點，已經被研究了幾十年，也取得了不錯的成果，但是就目前情況來看，其鎮(zhèn)痛的機制及體外表達還有待進一步研究。人們期待早日在這2個方面取得突破性的成果，為CT的廣泛應用鋪平道路。

6 參考文獻

[1] 黃立峰，許云祿.蛇毒神經毒素的鎮(zhèn)痛作用[J].福州總醫(yī)院學報，2005（增刊1）：355-357.

[2] 王重洋，顏培鋼.眼鏡蛇神經毒素藥理作用實驗研究進展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009（8）：165-167.

[3] YANG C C，CHANG C C，HAYASHI K，et al.Amino acid composition and end group analysis of cobrotoxin[J].Toxicon，1969，7（1）：43-47.

[4] YANG C C，YANG H J，HUANG J S.The amino acid sequence of cobr-otoxin[J].Biochim Biophys Acta，1969，188（1）：65-77.

[5] YANG C C，YANG H J，CHIU R H.The position of disulfide bonds in co-brotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1970，214（2）：355-363.

[6] YANG C C.Structure and function of cobrotoxin[proceedings][J].Toxicon，1976，14（6）：421-422.

[7] YU C，BHASKARAN R，CHUANG L C，et al.Solution conformation of cobrotoxin：a nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing study[J].BIOCHEMISTRY-US，1993，32（9）：2131-2136.

[8] CHANG L，LIN S，CHANG C，et al.Disulfide isomerization within the C-terminus of cobrotoxin decelerates by thiol compounds and trinitrophen-ylation，but accelerates by modification of carboxyl groups[J].Arch Bioc-hem Biophys，1998，358（1）：164-170.

[9] ENDO T，TAMIYA N.Current view on the structure-function relationship of postsynaptic neurotoxins from snake venoms[J].Pharmacol Therapeut，1987，34（3）：403-406.

[10] MENG Q X，WANG W Y，LU Q M，et al.A novel short neurotoxin，cobr-otoxin c，from monocellate cobra （Naja kaouthia） venom：isolation and purification，primary and secondary structure determination，and tert-iary structure modeling[J].Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2002，132（1）：113-121.

[11] CHANG C C，YANG C C，HAMAGUCHI K，et al.Studies on the status of tyrosyl residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1971，236（1）：164-173.

[12] YANG C C，CHANG C C，LIOU I F.Studies on the status of arginine residues in cobrotoxin[J].Biochim Biophys Acta，1974，365（1）：1-14.

[13] 常梅艷，韓麗萍，蔣琳蘭.眼鏡蛇（Naja naja atra）神經毒素與心臟毒素分離純化研究進展[J].藥物生物技術，2009（6）：595-599.

[14] AOYAGI H，YONEZAWA H，TAKAHASHI N，et al.Synthesis of a pep-tide with cobrotoxin activity[J].Biochim Biophys Acta，1972，263（3）：823-826.

[15] CHEN R Z，ROBINSON S E.The effect of cholinergic manipulations on the analgesic response to cobrotoxin in mice[J].Life Sci，1990，47（21）：1949-1954.

[16] 曾才銘.新藥“克痛寧”治療慢性腰腿痛80例療效觀察[J].云南醫(yī)藥，1980（1）：26-28.

[17] 蒲道學.克痛靈治療血管神經性頭痛、坐骨神經痛、三叉神經痛共96例臨床療效觀察[J].云南醫(yī)藥，1980（2）：37-39.

[18] SHEN J，HE J，TANG X，et al.Role of autophagy on cobrotoxin induced cell death of A549[J].Chinese Journal of Lung Cancer，2013，16（7）：339-344.

[19] SHEN J，XIE Y，SUN M L，et al.Antitumor activity of cobrotoxin in human lung adenocarcinoma A549 cells and following transplantation in nude mice[J].Oncol Lett，2014，8（5）：1961-1965.

[20] CHANG L S，CHEN K C，WU B N，et al.Expression and mutagenesis st-udies of cobrotoxin from Taiwan cobra[J].Biochem Biophys Res Comm-un，1999，263（3）：652-656.

[21] 鄢航，楊秀榮，鄧繼賢，等.廣西眼鏡蛇神經毒素的原核表達[J].廣東農業(yè)科學，2012（10）：145-147.

[22] 鄢航.廣西眼鏡蛇CT和PLA_2基因的真核表達和鎮(zhèn)痛活性檢測[D].南寧：廣西大學，2013.

[23] 葉勇，邢海婷，郭亞.白藜蘆醇二聚體與眼鏡蛇神經毒素的作用機制[J].華南理工大學學報（自然科學版），2014（2）：21-26.

[24] 郝永龍，陳美榮，黃銘.中華眼鏡蛇神經毒素微球的制備及鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國藥理學通報，2014（5）：676-679.

[25] 郝永龍，陳美榮，劉啟萍，等.眼鏡蛇神經毒素配伍咖啡因鎮(zhèn)痛作用研究[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2010（7）：565-567.

[26] 班建東，湯圣希.眼鏡蛇神經毒素中樞性鎮(zhèn)痛作用的研究[J].廣西醫(yī)科大學學報，2000（2）：192-194.

[27] 高紅瑾，許云祿，王少明，等.中華眼鏡蛇神經毒素的活性研究[J].藥學研究，2014（6）：315-318.