姚海璐，王 震，邵曉婷，劉 笑，韓 光

河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475000

載穿心蓮內(nèi)酯mPEG-PLA聚合物膠束制備工藝研究

河南大學(xué) 藥物研究所，河南 開封 475000

〔目的〕制備載穿心蓮內(nèi)酯mPEG-PLA聚合物膠束?！卜椒ā骋怨簿畚锊牧暇垡叶?聚乳酸為載體，以穿心蓮內(nèi)酯為模型藥物，用溶劑揮發(fā)法制備膠束。用星點(diǎn)設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化處方；用高效液相色譜法測定穿心蓮內(nèi)酯含量并計算包封率和載藥量；用激光粒度儀測定膠束的粒徑；用透射電子顯微鏡對膠束進(jìn)行形貌觀察?！步Y(jié)果〕最優(yōu)處方為：聚乙二醇-聚乳酸40 mg，有機(jī)相甲醇 2 mL，穿心蓮內(nèi)酯6.68 mg，水相 44.14 mL，包封率為(85.19±3.28)%，載藥量為(12.38±0.80)%。膠束平均粒徑為(147.96±21.79) nm，呈棒狀結(jié)構(gòu)?！步Y(jié)論〕穿心蓮內(nèi)酯聚合物膠束的處方制備工藝簡單易行，膠束可以提高藥物在水中的溶解度。

穿心蓮內(nèi)酯；聚乙二醇-聚乳酸；膠束；星點(diǎn)設(shè)計

穿心蓮內(nèi)酯(Andrographolide，A)是爵床科植物穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm．f．)Nees)中提取得到的二萜內(nèi)酯類化合物，是穿心蓮的主要活性成分之一[1-2]。研究[3-6]表明，穿心蓮內(nèi)酯可通過細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期G1/M期、免疫調(diào)節(jié)等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。但是，穿心蓮內(nèi)酯難溶于水，生物利用度低，患者使用的順從性差，影響了其臨床應(yīng)用[7-8]。聚合物膠束是兩親性聚合物在水溶液中通過分子自組裝原理形成的粒徑均一、具有核殼結(jié)構(gòu)的微粒，通過將難溶性抗腫瘤藥物包載于膠束的疏水內(nèi)核，實(shí)現(xiàn)增加溶解度和腫瘤靶向性的目的[9-11]。聚乳酸具有良好的生物相容性與可生物降解性，已被FDA批準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于手術(shù)縫合線、組織修復(fù)材料、藥物載體材料等方面。聚乙二醇-聚乳酸(mPEG-PLA)納米膠束，作為良好的藥物載體得到廣泛的研究及應(yīng)用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)以mPEG-PLA為載體材料制備穿心蓮內(nèi)酯聚合物膠束，以星點(diǎn)設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化處方，以期提高穿心蓮內(nèi)酯在水中的溶解度及改善其生物利用度。

1 儀器和材料

1.1 儀器

馬爾文激光粒度儀(Nano2S，英國Malvern)；透射電子顯微鏡(JEM-1230，日本JEOL)；恒溫磁力攪拌器(CL-2，鞏義市英峪高科儀器廠)；高效液相色譜儀(2010A，日本島津)。

1.2 材料和試劑

穿心蓮內(nèi)酯(批號：140804，含量在99.8%以上，成都天臺山制藥有限公司)；mPEG2000-PLA1000(濟(jì)南岱罡)；乙腈(色譜純，天津四友)；甲醇(色譜純，天津四友)；純水(杭州娃哈哈)；微孔濾膜(0.22 μm，美國Amerritech Scientific)；微孔濾膜(0.45 μm，天津津騰)。

2 方法和結(jié)果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯共聚物膠束(mPEG-PLA-A)的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備mPEG-PLA-A。取處方量的A和載體材料mPEG2000-PLA1000于EP管中，加入甲醇，超聲使其全部溶解；以滴注的方式加入雙蒸水中，邊滴邊攪拌；待有機(jī)溶劑揮盡后停止攪拌，用0.45 μm微孔濾膜過濾，密封備用。

2.2 穿心蓮內(nèi)酯體外HPLC分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱，thermo C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相，乙腈、水(10∶90～60∶40)； 流速，1.0 mL/min；紫外檢測器檢測波長，205 nm；柱溫，室溫；理論塔板數(shù)，不低于4 000。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，置50 mL容量瓶中；加入乙腈溶解并定容作為儲備液，最終濃度為0.405 mg/mL。依次取標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10 μL進(jìn)樣分析，同一濃度測定3次。分別以峰面積對穿心蓮內(nèi)酯的量(μg)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

SA=2.2×106mA+60 443，R2=0.999 8。

線性范圍為0.812～4.060 μg，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 分別將標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣2、6、10 μL，在同一天內(nèi)連續(xù)測定5次，計算日內(nèi)精密度RSD分別為0.34%、0.57%、0.39%。連續(xù)測定3 d，計算日間精密度RSD分別為0.45%、0.37%、0.65%。精密稱取一定量穿心蓮內(nèi)酯，置容量瓶中，加入空白膠束溶液，加適量乙腈溶解材料后定容，作為供試品溶液。用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)樣2、6、10 μL，所得峰面積與含相同濃度穿心蓮內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品所得的峰面積相比較，計算回收率分別為(97.78±4.00)%、(96.94±2.01)%、(99.79±1.21)%。

2.2.4 膠束包封率和載藥量的測定 將過濾后的載藥膠束溶液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加乙腈稀釋定容；用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣。按照下式分別計算包封率(Entrapping Efficiency， EE)與載藥量(Drug Loading Capacity，DLC)：

2.3 單因素考察

選用mPEG2000-PLA1000作為載體材料，分別考察有機(jī)溶劑體積、投藥量、水相體積對膠束形成的影響；以載藥量和包封率為評價指標(biāo)，確定影響溶劑揮發(fā)法制備膠束的主要因素，為進(jìn)一步的處方優(yōu)化提供依據(jù)。

2.3.1 有機(jī)溶劑體積 固定mPEG2000-PLA100020 mg，投藥量2 mg，有機(jī)相甲醇為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL。結(jié)果顯示，當(dāng)有機(jī)相體積從0.5 mL增加到2.0 mL時，膠束的載藥量和包封率的變化都不是特別明顯。為了使有機(jī)相的量取方便及縮短有機(jī)試劑揮發(fā)的時間，綜合考慮，選用有機(jī)試劑甲醇的體積為1.0 mL。

2.3.2 投藥量 固定mPEG2000-PLA100020 mg，有機(jī)相甲醇1.0 mL，投藥量為1、2、3、4、5 mg。結(jié)果顯示，膠束的載藥量隨著投藥量的增加先增加后降低，包封率隨著投藥量的增加有持續(xù)降低的趨勢。說明投藥量對載藥量和包封率均有顯著影響，需在其后的處方優(yōu)化中進(jìn)一步考察。

2.3.3 水相體積 固定mPEG2000-PLA100020 mg，投藥量2 mg，甲醇1.0 mL，水相為5、10、15、20、25 mL。結(jié)果顯示，膠束的載藥量和包封率均隨水相體積的增加先升高后降低。說明水相體積對實(shí)驗(yàn)結(jié)果有重要影響，將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步考察。

2.4 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 固定mPEG2000-PLA100040 mg，選擇對膠束形成有顯著影響的兩個因素：投藥量(X1)及水相體積(X2)進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)采用2因素5水平的星點(diǎn)設(shè)計效應(yīng)面法優(yōu)化處方，取值范圍見表1。以包封率和載藥量作為考察指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)安排進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，見表2。

表1 穿心蓮內(nèi)酯聚合物膠束2個考察因素的代碼水平及相應(yīng)物理量

表2 星點(diǎn)設(shè)計實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

利用Design-Expert8.0.6.1軟件進(jìn)行方程擬合，結(jié)果為：

DLC=11.834+1.392 77 X1+2.451 27 X2+

EE=89.102-19.785 8 X1+15.425 8 X2+

其中，X1為A的量，X2為水相的體積。

2.4.2 效應(yīng)面優(yōu)化與預(yù)測 根據(jù)二項(xiàng)式方程，采用Design-Expert8.0.6.1軟件分別繪制各指標(biāo)與各因素的等值線和三維響應(yīng)圖，結(jié)果見圖1、圖2。

由圖1、圖2可知，當(dāng)投藥量一定時，包封率和載藥量均隨水相體積的增加而增大；水相體積一定時，包封率隨投藥量的增加而減小,載藥量隨投藥量的增加先增大后減小。

將各效應(yīng)面的等高線進(jìn)行疊加，通過定義投藥量、水相體積所需范圍，疊加圖的重疊部分則定義各指標(biāo)的允許值，結(jié)果見圖3。根據(jù)各指標(biāo)的二項(xiàng)式方程，并考慮膠束制備的實(shí)際情況，在重疊區(qū)域內(nèi)得到mPEG-PLA-A的較優(yōu)處方為：mPEG2000-PLA100040mg，有機(jī)相甲醇1mL，A6.68mg，水相44.14mL。

圖1 投藥量和水相體積對載藥量影響的等值線和三維響應(yīng)圖

圖2 投藥量和水相體積對包封率影響的等值線和三維響應(yīng)圖

圖3 優(yōu)化區(qū)域重疊圖

按較優(yōu)處方制備3 批膠束，對各指標(biāo)進(jìn)行測定，并與預(yù)測結(jié)果比較，結(jié)果見表3。

表3 mPEG-PLA-A優(yōu)化處方下多項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測值與實(shí)際值的比較

由表3可知，各指標(biāo)實(shí)測值與預(yù)測值偏差較小。說明模型預(yù)測良好，優(yōu)化結(jié)果具有較高的可靠性。2.5 載藥膠束的表征

2.5.1 粒徑測定 所得膠束為無色透明溶液，其平均粒徑為(147.96±21.79)nm。

2.5.2 形貌觀察mPEG-PLA-A膠束呈棒狀結(jié)構(gòu)。

2.5.3 膠束增溶效果研究 取過量的A于EP管中，加水超聲溶解，在25 ℃的條件下恒溫震蕩過夜，離心取上清液HPLC測定A的含量，溶解度為68.89μg/mL；按照最優(yōu)處方制備mPEG2000-PLA1000A膠束，HPLC測定膠束溶液中A的含量，溶解度為142.26μg/mL。A在水中的溶解度提高2.06 倍。

3 討論

根據(jù)A和載體mPEG-PLA的溶解性能及A的穩(wěn)定性選擇有機(jī)溶劑。A與mPEG-PLA在甲醇、乙腈和DMSO中的溶解性均較好，但采用溶劑揮發(fā)法制備膠束時要求有機(jī)溶劑有較低的沸點(diǎn)、能與水混溶。甲醇的價格比乙腈低廉，故選用甲醇作為溶解A和載體材料的有機(jī)溶劑。

在處方篩選與優(yōu)化的過程中，需要同時考察多個因素對結(jié)果的影響，然后對結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。一般采用固定其他因素改變某一因素的單因素考察法來考察某種因素是否對結(jié)果有影響。當(dāng)影響因素確定后，采用實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少的實(shí)驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化。國內(nèi)常用正交設(shè)計，但該方法的實(shí)驗(yàn)精密度不夠。國外近年來常用集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法于一體的效應(yīng)面優(yōu)化法進(jìn)行優(yōu)化[14-15]。實(shí)驗(yàn)方法采用星點(diǎn)設(shè)計，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過相應(yīng)軟件的處理形成一個效應(yīng)面，得到最優(yōu)點(diǎn)，從而獲得最優(yōu)處方。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計的方法篩選出藥物的優(yōu)化處方，由于其是通過一個效應(yīng)面來篩選出優(yōu)化點(diǎn)，相對于傳統(tǒng)正交設(shè)計來說精密度更高。

4 結(jié)論

選擇制備工藝簡單的溶劑揮發(fā)法制備穿心蓮內(nèi)酯的mPEG-PLA膠束，以包封率、載藥量為主要考察指標(biāo)，單因素考察投藥量、水相體積、有機(jī)相體積等影響因素。在此基礎(chǔ)上，星點(diǎn)優(yōu)化膠束處方工藝，選用投藥量、水相體積為考察因素，最終確定的優(yōu)化處方為：mPEG2000-PLA100040mg，有機(jī)相甲醇體積 2mL，A6.68mg，水相體積44.14mL，包封率為(85.19±3.28)%，載藥量為(12.38±0.80)%。重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，星點(diǎn)設(shè)計優(yōu)化處方有較高的可靠性，本實(shí)驗(yàn)的制備方法工藝簡單易行，膠束可以提高藥物在水中的溶解度。

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[責(zé)任編輯 段金卯]

The preparation of mPEG-PLA polymeric micelles loading Andrographolide

Pharmaceutical Institute, Henan University, Kaifeng 475000, China

〔Objective〕To prepare mPEG-PLA polymeric micelles loading Andrographolide (mPEG-PLA-A).〔Methods〕Using poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid) (mPEG-PLA) material as the carrier and Andrographolide as the model drug , the micelles are prepared by solvent-evaporation method. Optimization preparation method was gained by central composite design. The drug entrapping efficiency and loading capacity were determined by High Performance Liquid Chromatography(HPLC). The main particle size was determined by zeta sizer H-3000 Laser Particle Size Analyzer. Using transmission electron microscope (TEM) to observe the morphology of the micelles.〔Results〕Optimization preparation method: the mass of mPEG2000-PLA1000was 40mg, the volume of organic phase methyl alcohol was 1ml, the mass of A was 6.68mg, the volume of water was 44.14ml. The drug entrapping efficiency and loading capacity were (85.19±3.28)% and (12.38±0.8)0%. This micelle has a rob structure with the size of (147.96±21.79) nm.〔Conclusion〕The process is practical and simple for the preparation of A loaded mPEG-PLA micelle and the micelles can increase drug solubility.

andrographolide; mPEG2000-PLA1000; micelle; central composite design

1672-7606(2017)01-0014-05

2016-11-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373974)

姚海璐(1991-)，女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與新藥開發(fā)工作。

韓光(1966-)，女，北京人，博士，教授，從事天然活性成分研究及新藥開發(fā)工作。

R284.2

A