李蓉， 鄭雨田， 李春青， 陳艷艷， 楊振升， 陳善元， 肖蘅

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 昆明650091)

基于線粒體COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎的分子鑒定

李蓉#， 鄭雨田#， 李春青， 陳艷艷， 楊振升， 陳善元*， 肖蘅*

(云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 昆明650091)

對蝎類物種的傳統(tǒng)分類主要依靠形態(tài)和行為特征，但由于該類群種間形態(tài)特征極為相似，物種的劃分和鑒定困難。為彌補傳統(tǒng)分類方法的不足，本研究以線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COI)基因作為分子標記，對形態(tài)相似的壯真蝎Euscorpiopsvalidus和普洱真蝎E.puerensis進行分子水平的物種鑒定。采用PCR擴增測序獲得壯真蝎與普洱真蝎共24個樣本的COI基因部分片段序列(660 bp)，進行了遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析。結(jié)果顯示：壯真蝎15個樣本中共檢測到4個單倍型，單倍型之間的相似度為99.3%～99.8%；普洱真蝎9個樣本中共檢測到4個單倍型，單倍型之間的相似度為99.6%～99.8%；2種蝎的種間序列相似度為90.1%～90.6%，單倍型間的穩(wěn)定差異核苷酸位點數(shù)為61個。壯真蝎與普洱真蝎種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.004 0、0.002 3，種間平均遺傳距離為0.103 9，且種間遺傳距離為種內(nèi)的34.6倍。此外，分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示壯真蝎與普洱真蝎的單倍型序列各自聚為2個單系枝，且具有很高的分枝自舉值(100%)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果也顯示壯真蝎與普洱真蝎8個單倍型明顯分為2大類群，且壯真蝎的單倍型HAP2與普洱真蝎的單倍型HAP7之間的突變步數(shù)高達62步。上述結(jié)果不僅進一步確認壯真蝎與普洱真蝎為2個不同的物種，且表明線粒體COI基因可用于開展真蝎屬Euscorpiops物種的分子鑒定。

壯真蝎；普洱真蝎；COI基因；分子鑒定

加拿大分類學(xué)家Hebert于2003年首次提出了DNA條形碼的概念，即將線粒體細胞色素氧化酶亞基 Ⅰ(COI)基因的一段長度約648 bp的片段作為物種鑒定的基礎(chǔ)片段(Hebertetal.，2003a)。對動物界11個門13 320個物種的研究結(jié)果顯示，COI基因序列間的差異能夠?qū)游锝缢形锓N進行有效鑒定(Hebertetal.，2003b)。由于DNA條形碼技術(shù)無需依賴形態(tài)分類就能夠?qū)λ芯康奈锓N進行準確辨別，不僅操作簡單迅速(彭居俐等，2008)，而且減少了物種鑒別的模糊性，因此被廣泛應(yīng)用。Yamashita和Rhoads(2013)基于線粒體COI基因?qū)Υ涛残珜貱entruroides的C.vittatus與C.pantheriensis構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行聚類分析，結(jié)果同形態(tài)學(xué)分類結(jié)果吻合。Barrett和Hebert(2005)利用線粒體COI基因?qū)?68種蜘蛛及其他35種蛛形綱物種(美洲沙漠木蝎Centruroidesvittatus、土耳其斯坦葉螨Tetranychusturkestani、美洲大革蜱Dermacentorvariabilis等)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和遺傳距離的DNA條形碼分析發(fā)現(xiàn)，COI基因能很好地實現(xiàn)對蜘蛛及其他蛛形綱物種的有效鑒定。何靜超等(2016)對小五臺山10屬25種蟹蛛樣本進行劃分及DNA條形碼分子鑒定分析發(fā)現(xiàn)，其劃分及鑒定結(jié)果同形態(tài)學(xué)分類方法得出的結(jié)果一致。Talal等(2015)利用COI及其他基因片段對中東金蝎Scorpiomaurus的S.maurusfuscus和S.mauruspalmatus2個亞種進行形態(tài)特征、系統(tǒng)發(fā)育及遺傳差異分析發(fā)現(xiàn)，中東金蝎是一個復(fù)合種，與先前的分類觀點相符，并證明了S.fuscus、S.kruglovi、S.palmatus、S.propinquus物種分類修訂的合理性。

目前，基于線粒體COI基因?qū)颜嫘c普洱真蝎的DNA條形碼進行物種鑒定的相關(guān)研究還未見報道，因此COI基因能否對壯真蝎與普洱真蝎進行有效鑒定還未曾得知。鑒于此，本研究首次對形態(tài)相似的壯真蝎與普洱真蝎共24個個體進行基因組總DNA提取、PCR擴增及序列測定，并對二者的遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖進行分析，以期為二者及其他蝎類物種的鑒定提供分子水平的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

壯真蝎(編號：HHMZ)與普洱真蝎(編號：PELC)分別采自云南省紅河州蒙自市和普洱市瀾滄縣的潮濕混交林石塊、土堆或廢墟中，總計24個樣本。采樣點的經(jīng)緯度分別為103.0°E，22.9°N和99.9°E，22.5°N，采集后使用數(shù)碼相機記錄樣本的形態(tài)特征，選取較為完整的樣本進行形態(tài)鑒定后，保存于75%乙醇中，標本存放于云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物學(xué)實驗室。

1.2 DNA提取

取樣本蝎腹部肌肉組織約30 mg，將組織剪碎用ddH2O處理為細胞懸液(處理2次)，按照血液細胞組織基因組提取試劑盒(TIANGEN，北京)說明書的步驟提取樣本蝎基因組總DNA，提取后，使用NanoDrop 2000超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測技術(shù)進行DNA濃度和純度檢測，檢測后將提取的總DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及序列測定

PCR擴增所用引物為COI基因通用引物L(fēng)CO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)，HCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)(Folmeretal.，1994)，所有引物均由上海捷瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR擴增體系為50 μL，包括10×Buffer 5 μL，25 mM MgCl25 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.15 μL，2.5 mM dNTP4 μL，10 μM正反引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 31.85 μL。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性1 min，40 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72 ℃延伸5 min。每次PCR擴增均設(shè)置陰性對照，以確保實驗過程不受外源DNA的污染。擴增結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測合格的PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司進行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將2種蝎獲得的測序峰圖利用DNASTAR(Burland，2000)中的SeqMan(Swindell & Plasterer，1997)進行正反鏈校對和編輯，手動去除序列兩端的引物區(qū)，獲得有效片段的樣本序列，用MegAlign(Clewley & Arnold，1997)進行排序后，利用Clustal X(Jeanmouginetal.，1998)進行多序列比對，采用DnaSP v5(Librado & Rozas，2009)計算信息位點、變異位點、單倍型數(shù)，通過BioEdit(Hall，1999)計算單倍型序列間的相似度，利用MEGA 6.06(Tamuraetal.，2013)分析堿基組成、單倍型間變異位點，并基于Kimura-2-parameter(K2P)模型進行遺傳距離分析及采用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹的節(jié)點支持率采用自舉值進行估計，重復(fù)檢測1 000次(Felsenstein，1985)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖采用POPART(Leigh & Bryant，2015)構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于COI基因的序列分析

經(jīng)COI基因通用引物PCR擴增、序列測定，共獲得24條DNA序列，經(jīng)人工校對后，獲得有效序列長度均為660 bp，所測COI基因序列中未發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失。壯真蝎15個樣本的A、T、C、G平均含量分別為21.5%、45.4%、14.0%、19.1%，其中A+T含量(66.9%)大于G+C含量(33.1%)；15條序列共檢測到1個信息位點，占序列總長度的0.15%，4個變異位點，4個單倍型(HAP1～HAP4)，單倍型之間的相似度為99.3%～99.8%。普洱真蝎9個樣本的A、T、C、G平均含量分別為23.1%、42.5%、15.2%、19.2%，其中A+T含量(65.6%)大于G+C含量(34.4%)，9條序列共檢測到2個信息位點，占序列總長度的0.30%，3個變異位點，4個單倍型(HAP5～HAP8)，單倍型之間的相似度為99.6%～99.8%。壯真蝎與普洱真蝎種間相似度為90.1%～90.6%(表1)，2種蝎共8個單倍型中的變異位點數(shù)為68，其中61個位點為二者的穩(wěn)定差異位點，可作為壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的診斷位點(圖1)。

2.2 遺傳距離分析

基于COI基因，利用MEGA 6.06中的雙參數(shù)模型計算壯真蝎與普洱真蝎的遺傳距離。結(jié)果顯示，壯真蝎4個單倍型(HAP1～HAP4)間的遺傳距離為0.002～0.006，平均遺傳距離為0.004 0；普洱真蝎4個單倍型(HAP5～HAP8)間的遺傳距離為0.002～0.003，平均遺傳距離為0.002 3；壯真蝎與普洱真蝎單倍型間的遺傳距離為0.101～0.107，種間平均遺傳距離為0.103 9(表1)。壯真蝎與普洱真蝎種間平均遺傳距離顯著高于種內(nèi)平均遺傳距離，為種內(nèi)平均遺傳距離的34.6倍。

表1 基于COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎單倍型之間的遺傳距離與相似度Table 1 Genetic distance and similarity of haplotypes from Euscorpiops validus and E. puerensis based on COI gene sequences

注： 對角線上方為單倍型間遺傳距離， 對角線下方為單倍型間相似度； HAP1～HAP4為壯真蝎的單倍型， HAP5～HAP8為普洱真蝎的單倍型。

Notes： The genetic distances between haplotypes are above the diagonal， and the similarities between haplotypes are below the diagonal; HAP1-HAP4 are the haplotypes ofE.validus， HAP5-HAP8 are the haplotypes ofE.puerensis.

圖1 基于COI基因序列的壯真蝎與普洱真蝎單倍型之間的變異位點

HAP1～HAP4為壯真蝎的單倍型， HAP5～HAP8為普洱真蝎的單倍型； 陰影部分為非穩(wěn)定變異位點。

HAP1-HAP4 are the haplotypes ofE.validus， HAP5-HAP8 are the haplotypes ofE.puerensis； the shaded regions are non-stable variable sites.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析

以E.flavicaudis(GenBank登錄號：KF548117、JN018212、HM418267)的3條序列為外群，結(jié)合本研究的壯真蝎與普洱真蝎單倍型序列，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)果顯示，二者的單倍型序列都各自聚為獨立的單系枝，且具有較高的分枝自舉值(100%)。為進一步了解二者單倍型之間的關(guān)系，利用POPART的中間結(jié)合法(Median-joining)構(gòu)建了2種蝎的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。結(jié)果顯示，8個單倍型可分為2大類群，普洱真蝎的單倍型為聚類A，壯真蝎的單倍型為聚類B，無共享單倍型。且壯真蝎的單倍型HAP2與普洱真蝎的單倍型HAP7之間的突變步數(shù)高達62步。

圖2 基于COI基因序列構(gòu)建的壯真蝎和普洱真蝎的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于COI基因序列構(gòu)建的壯真蝎與普洱真蝎的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

線粒體基因序列中穩(wěn)定的變異位點或核苷酸診斷位點可作為物種劃分的鑒別位點。朱振華等(2005)基于線粒體Cytb基因?qū)?種果實蠅進行序列比對發(fā)現(xiàn)，基因片段的30個變異位點具有較高的穩(wěn)定性，可作為果實蠅物種分子鑒定的依據(jù)。王康等(2016)通過比較沙果小食心蟲GrapholitadimorphaKomai和梨小食心蟲G.molestaBusck的線粒體COI基因與COⅡ基因序列發(fā)現(xiàn)，COI基因序列中存在30個穩(wěn)定變異位點，COⅡ基因序列中存在26個穩(wěn)定變異位點，并以此作為2種食心蟲鑒定的參考依據(jù)。Li等(2011)對棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙夜蛾H. assulta COI基因序列分析，發(fā)現(xiàn)獨特的17對核苷酸診斷位點可對二者進行區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)，壯真蝎與普洱真蝎COI基因序列間存在61個穩(wěn)定差異核苷酸位點，這些變異位點可作為壯真蝎與普洱真蝎分子鑒定的依據(jù)。

線粒體DNA序列的差異可作為不同物種劃分的依據(jù)(Wiens&Penkrot，2002；Hebertet al.，2003a)。例如，Avise和Walker(1999)基于線粒體Cytb基因序列對252種脊椎動物研究發(fā)現(xiàn)，90%的脊椎動物顯示出超過2%的序列差異。Hebert等(2003a)基于COI基因序列對200種鱗翅目Lepidoptera昆蟲分析發(fā)現(xiàn)，COI基因3%的序列差異可用于鱗翅目昆蟲的物種鑒定。Barrett和Hebert(2005)對203種蛛形綱物種COI基因序列研究發(fā)現(xiàn)，COI基因4%的序列差異可作為鑒定不同物種的標準。本研究中壯真蝎與普洱真蝎的種間平均序列差異為9.6%，同Barrett和Hebert(2005)的研究結(jié)果一致。

種內(nèi)、種間遺傳距離是進行物種鑒別的主要標準。本研究基于COI基因?qū)颜嫘推斩嫘倪z傳距離進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的種內(nèi)平均遺傳距離分別為0.004 0、0.002 3，同Hebert等(2003b)對動物界11個動物門13 320個物種進行分析得出的種內(nèi)遺傳距離大多小于1%，很少大于2%的結(jié)論相符。壯真蝎與普洱真蝎的種間平均遺傳距離(0.103 9)顯著高于種內(nèi)平均遺傳距離(0.003 0)，為種內(nèi)平均遺傳距離的34.6倍，符合種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離10倍以上的原理(Hebertet al.，2004)，且種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離無重疊區(qū)域，符合對物種進行有效性鑒定的檢驗標準(Hebertet al.，2003a；Aliabadianet al.，2009)。因此，基于線粒體COI基因的壯真蝎與普洱真蝎的遺傳距離分析表明，COI基因可用于2種蝎的分子鑒定。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，壯真蝎與普洱真蝎的單倍型序列都各自聚為單系枝，且具有較高的分枝自舉值(100%)，與遺傳距離分析得出的結(jié)論一致。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)所有單倍型明顯分為2大類群，整個單倍型網(wǎng)絡(luò)圖無共享單倍型，且種間的單倍型突變步數(shù)高達62步。以上鑒定結(jié)果同傳統(tǒng)分類結(jié)論吻合(Diet al.，2010a，2010b)。綜上所述，基于線粒體COI基因可實現(xiàn)對壯真蝎與普洱真蝎物種的分子鑒定。

本研究首次利用COI基因的部分片段序列對真蝎屬的壯真蝎與普洱真蝎進行分子鑒定，初步證明了DNA條形碼對壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的有效性。鑒于本實驗的研究利用了COI基因的部分序列片段，與全長序列相比，包含的信息量有限，且只運用了線粒體COI基因進行了分析，難免存在一定的局限性。為此，今后需要考慮全長序列的分析及結(jié)合其他核基因或運用下一代測序技術(shù)開發(fā)更加穩(wěn)定準確的分子鑒定的基因組標記，以此來驗證采用分子手段對壯真蝎與普洱真蝎物種鑒定的有效性。

致謝：感謝羅康、羅正榮、唐天強、黃順福在樣品采集中給予的支持和幫助，感謝楊陽、沈靈、饒峻瑜在實驗技術(shù)方面給予的指導(dǎo)與幫助。

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Molecular Identification ofEuscorpiopsvalidusandE.puerensisBased on MitochondrialCOIGene Sequences

LI Rong#， ZHENG Yutian#， LI Chunqing， CHEN Yanyan， YANG Zhensheng，CHEN Shanyuan*， XIAO Heng*

(School of Life Sciences， Yunnan University， Kunming 650091， China)

The traditional classification and taxonomy of scorpiones are mainly based on morphological and behavioral characteristics. However， due to the similar morphological characteristics among species， it is difficult to classify and identify distinct species among scorpions. To compensate for the insufficiency of traditional taxonomic methodology， this study used mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ (COI) gene as molecular marker to conduct molecular identification of 2 morphologically similar scorpion speciesEuscorpiopsvalidusandE.puerensis. The partialCOIgene sequences (660 bp) from 24 samples ofE.validusandE.puerensiswere amplified by PCR followed by gene sequencing. The genetic distances， phylogenetic and haplotype network analyses were then carried out. The results showed that： 4 haplotypes with similarity of 99.3%-99.8% were detected in 15 individuals ofE.validus， and 4 haplotypes with similarity of 99.6%-99.8% were found in 9 individuals ofE.puerensis； the interspecific similarity was 90.1%-90.6% and the number of stable differentiated nucleotide sites between the haplotypes of 2 species was 61. The intraspecific average genetic distances amongE.validushaplotypes and amongE.puerensishaplotypes were 0.004 0 and 0.002 3， respectively， while the interspecific average genetic distance betweenE.validusandE.puerensiswas 0.103 9， being 34.6 times higher than that of intraspecific values. In addition， molecular phylogenetic tree clearly showed that the haplotype sequences ofE.validusandE.puerensisclustered as 2 reciprocally monophyletic clades with high bootstrap values (100%). The haplotype network also showed that 8 haplotypes ofE.validusandE.puerensiscan be clearly divided into 2 clades， and the mutation steps between HAP2 haplotype ofE.validusand HAP7 haplotype ofE.puerensisreached 62. These results further confirmed thatE.validusandE.puerensiswere 2 distinct species， and indicated that mitochondrialCOIgene was suitable for molecular species identification ofEuscorpiopsspecies.

Euscorpiopsvalidus；Euscorpiopspuerensis；COIgene； molecular identification

2016-11-07 接受日期：2017-01-03

云南省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201310673008)； 云南大學(xué)引進人才科研啟動資金項目(XT412002)

李蓉(1990—)， 女， 碩士研究生， 主要從事動物遺傳學(xué)研究， E-mail：12014000884@mail.ynu.edu.cn； 鄭雨田(1992—)， 女， 本科生， 主要從事動物遺傳學(xué)研究， E-mail：leizhenyu201@163.com#同等貢獻作者

*通信作者Corresponding author， E-mail：chensy@ynu.edu.cn； xiaoheng@ynu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20160305

Q953； Q38

A

1000-7083(2017)02-0139-06