隋世燕， 葛亞男， 徐取尉， 蘇晶晶

(大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003)

美洲大蠊醇提物對(duì)大鼠抗氧化應(yīng)激的影響

隋世燕， 葛亞男， 徐取尉， 蘇晶晶

(大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理671003)

目的 研究美洲大蠊Periplanetaamericana醇提物對(duì)大鼠血清和卵巢抗氧化指標(biāo)的影響。方法 17只成年雌性SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組(9 mL·kg-1，生理鹽水)5只、低劑量組(9 mL·kg-1，0.03 g·mL-1美洲大蠊醇提物)6只、高劑量組(9 mL·kg-1，0.09 g·mL-1美洲大蠊醇提物)6只。每2天灌胃1次，共飼養(yǎng)30 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采集大鼠血清和卵巢，檢測(cè)血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)指標(biāo)和卵巢中SOD、GSH-PX、CAT基因表達(dá)的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，高劑量組(P=0.085)、低劑量組(P=0.091)血清中的NO含量均有降低的趨勢(shì)；高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著提高了大鼠血清中的SOD含量(P<0.05)，同時(shí)，高劑量組血清中的MDA含量顯著降低(P<0.05)；此外，高劑量組和低劑量組卵巢SOD基因的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 美洲大蠊醇提物升高了大鼠血清SOD的含量，降低了NO和MDA的含量，同時(shí)，還提高了卵巢SOD基因的表達(dá)，說(shuō)明美洲大蠊醇提物對(duì)大鼠卵巢具有一定的抗氧化應(yīng)激功能。

美洲大蠊醇提物；氧化應(yīng)激；基因表達(dá)；血清；卵巢；大鼠

氧化應(yīng)激是在機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)時(shí)，體內(nèi)生成的活性氧超過(guò)機(jī)體的抗氧化防御能力時(shí)對(duì)細(xì)胞組織造成損害的病理性生物化學(xué)反應(yīng)。氧化應(yīng)激的本質(zhì)在于反應(yīng)性的氧化物與生物抗氧化劑間平衡的破壞，從而造成活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度升高。生理水平的ROS有助于卵子發(fā)生和卵泡形成，但是過(guò)量ROS對(duì)女性生殖健康則有許多不利的影響(Aitken & Koppers，2011)，可以破壞細(xì)胞的DNA、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)，引起細(xì)胞基因、結(jié)構(gòu)及功能受損，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Bausenweinetal.，2010)。很多研究已經(jīng)證實(shí)，卵泡內(nèi)含有內(nèi)源性抗氧化物酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)等，與非酶類(lèi)抗氧化物共同對(duì)抗氧化損傷以降低卵泡中的ROS水平(Agarwaletal.，2005；Goudetal.，2008)；但當(dāng)卵母細(xì)胞中的氧化應(yīng)激產(chǎn)物超過(guò)機(jī)體抗氧化能力時(shí)，就會(huì)引起多種卵巢相關(guān)疾病，如內(nèi)分泌紊亂、卵泡閉鎖、卵巢早衰等，嚴(yán)重危害人類(lèi)和動(dòng)物的生殖健康(Agarwaletal.，2003，2005；Rizzoetal.，2012)。在人類(lèi)輔助的生殖領(lǐng)域，氧化應(yīng)激可引起體外胚胎老化、發(fā)育受阻、凋亡和碎片等(Sikka，2001；Agarwaletal.，2005；Rivaetal.，2007)。因此，減少卵巢氧化應(yīng)激的發(fā)生，對(duì)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量、促進(jìn)胚胎的發(fā)育有積極作用。

機(jī)體中常見(jiàn)的氧化應(yīng)激標(biāo)志物有以一氧化氮(NO)和丙二醛(MDA)為代表的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(Wathesetal.，2007)，它們能反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度。利用機(jī)體內(nèi)源的抗氧化體系在細(xì)胞內(nèi)部協(xié)同對(duì)抗自由基，最終有效消除細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的自由基。若想有效降低自由基對(duì)人體的危害，不僅要依靠?jī)?nèi)源性防御體系，還要利用外源性自由基清除劑，使自由基在侵入機(jī)體之前就被阻斷，避免機(jī)體遭受氧化損害(Bagchietal.，1997)。

美洲大蠊Periplanetaamericana屬于蜚蠊科Blattidae大蠊屬Periplaneta，原產(chǎn)于南美洲，食性廣泛，喜食糖和淀粉，污染食物、傳播病菌和寄生蟲(chóng)，是世界性衛(wèi)生害蟲(chóng)，其分泌物和糞便還含有致癌物質(zhì)，但其藥理作用卻日益造福人類(lèi)，其具有抗肝炎、抗腫瘤、抗菌、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、消炎鎮(zhèn)痛、促進(jìn)血管增生和組織修復(fù)等作用(戴云等，2005；何正春等，2009)。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物在體外具有一定的抗氧化能力(焦春香等，2011)，但是，其在體內(nèi)的抗氧化效果卻未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究以成年SD大鼠為研究對(duì)象，觀察以美洲大蠊醇提物干預(yù)后其血清NO、GSH-PX、CAT、SOD和MDA等氧化或抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，并且測(cè)定了大鼠卵巢中抗氧化相關(guān)基因GSH-PX、CAT和SOD的表達(dá)，以探討美洲大蠊醇提物對(duì)大鼠機(jī)體和卵巢的抗氧化能力，從而為研究美洲大蠊醇提物對(duì)動(dòng)物繁殖功能的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 17只成年SD雌性大鼠，體質(zhì)量230～250 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-017，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXX(滇)2005-0010。

1.1.2 美洲大蠊醇提物的制取 成年美洲大蠊(由大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院贈(zèng)送)處死后，晾干，將蟲(chóng)體粉碎，用15倍量的95%乙醇進(jìn)行冷浸提取3次，然后去除脂肪，沉淀物放入-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 實(shí)驗(yàn)處理 大鼠先進(jìn)行7 d的自由采食飼養(yǎng)，以調(diào)節(jié)生理周期，使其適應(yīng)環(huán)境。按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，對(duì)照組5只灌胃生理鹽水；低劑量組6只灌胃低劑量的美洲大蠊醇提物(0.03 g·mL-1)；高劑量組6只灌胃高劑量的美洲大蠊醇提物(0.09 g·mL-1)；根據(jù)甘平等(2011)的方法，3組大鼠灌胃的劑量均為每千克體質(zhì)量9 mL。所有大鼠均自由飲水和采食。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 NO試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒、GSH-PX試劑盒、SOD試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Trizol試劑盒購(gòu)自上海Life Technologies生物技術(shù)有限公司；DNA酶購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司；dNTP和RNA酶抑制劑購(gòu)自南京生興生物工程有限公司；含SYBR GREEN的DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。10%水合氯醛。反轉(zhuǎn)錄引物、內(nèi)參引物和基因表達(dá)引物由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 主要儀器 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；NanoDrop分光光度計(jì)(ND-1000)，美國(guó)Thermo公司；普通PCR儀(Gene Amp PCR system 9600)，美國(guó)Perkins Elmer公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Mx3000P)，美國(guó)Stratagene公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型建立

大鼠自由取食喂養(yǎng)7 d后灌胃，每2天1次。

2.2 樣本采集

大鼠喂養(yǎng)30 d后開(kāi)始采樣，用10%水合氯醛(每千克體質(zhì)量2 mL)對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔注射，待麻醉后剖開(kāi)腹腔，腹主動(dòng)脈采血，將血注入含有EDTA-Na的抗凝管里，將卵巢放入EP管中，置于-70 ℃保存。血液4000 r·min-1離心10 min，取上清。

2.3 血清中各氧化和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行NO、GSH-PX、CAT、SOD、MDA指標(biāo)的測(cè)定。

2.4 基因表達(dá)測(cè)定方法

2.4.1 RNA提取及質(zhì)量控制 根據(jù)說(shuō)明書(shū)，使用Trizol試劑盒提取卵巢總RNA，DNA酶處理后用NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度，測(cè)得的值應(yīng)在2 000 ng·μL-1內(nèi)，若超過(guò)則稀釋后重測(cè)，OD260/280=1.8～2.2。最后取5 μg RNA稀釋到500 ng·μL-1，每管4 μL，共分裝2套，用于RNA反轉(zhuǎn)錄。

2.4.2 反轉(zhuǎn)錄 反應(yīng)總體積25 μL。第一步，2 μg總RNA，10 mmol·L-1dNTP，2.5 μmol·L-1隨機(jī)引物，加DEPC水至10 μL，在普通PCR儀上70 ℃變性5 min后，立即置于冰上冷卻；第二步，加5 μL5×RT buffer，0.2 μL 1 000 U RNA酶抑制劑，0.1 μL 10 000 U反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)，DEPC水補(bǔ)齊至25 μL，在普通PCR儀上37 ℃反應(yīng)1 h，95 ℃活化5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物短期內(nèi)使用可置于4 ℃，長(zhǎng)期保存需置于-20 ℃。

2.4.3 引物設(shè)計(jì) 內(nèi)參基因GAPDH和目的基因的引物根據(jù)GenBank上豬的相關(guān)cDNA序列，采用Primer premier 5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。

2.4.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 將cDNA原液稀釋至10%，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)目的基因的mRNA表達(dá)，其體系為：cDNA 2 μL，1 μmol·L-1目的或內(nèi)參基因引物2 μL，高壓ddH2O 6 μL，含SYBR Green的DNA聚合酶10 μL，共20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。

統(tǒng)計(jì)方法使用2-ΔΔCt法(Livak & Schmittgen，2001)。計(jì)算公式如下：△△Ct=(CtTarget-CtGAPDH)x-(CtTarget-CtGAPDH)control。

其中，以對(duì)照組的目的基因CtTarget和內(nèi)參基因CtGAPDH差值的平均值為對(duì)照進(jìn)行計(jì)算，x表示任意一個(gè)樣本，通過(guò)上述公式計(jì)算出每一個(gè)樣本目的基因的表達(dá)，即通過(guò)GAPDH校正后相對(duì)于對(duì)照組的目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

表1 基因表達(dá)引物序列Table 1 The primer sequences of gene expression

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0中的單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 美洲大蠊醇提物對(duì)血清中各氧化和抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

3.1.1 對(duì)NO、GSH-PX和CAT含量的影響 與對(duì)照組相比，低劑量組(P=0.085)和高劑量組(P=0.091)均使大鼠血清中NO含量有減少的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均沒(méi)有顯著影響大鼠血清中的GSH-PX和CAT含量(P>0.05)。

3.1.2 對(duì)SOD含量的影響 與對(duì)照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著增加了大鼠血清中的SOD含量(P<0.05)(圖1)。

圖1 雌性SD大鼠血清中SOD含量的測(cè)定

3.1.3 對(duì)MDA含量的影響 與對(duì)照組相比，低劑量的美洲大蠊醇提物沒(méi)有顯著影響大鼠血清中的MDA含量，但高劑量能夠顯著降低大鼠血清中的MDA含量(P<0.05)(圖2)。

圖2 雌性SD大鼠血清中MDA含量的測(cè)定

3.2 美洲大蠊醇提物對(duì)卵巢中抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的影響

3.2.1 對(duì)GSH-PX和CAT基因表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，高劑量與低劑量的美洲大蠊醇提物均沒(méi)有顯著影響大鼠卵巢GSH-PX和CAT基因的表達(dá)(P>0.05)。

3.2.2 對(duì)SOD基因表達(dá)的影響 由圖3可知，與對(duì)照組相比，高劑量和低劑量的美洲大蠊醇提物均顯著增加了雌性大鼠卵巢中SOD基因的表達(dá)(P<0.05)。

圖3 雌性SD大鼠卵巢組織中SOD基因的表達(dá)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量的美洲大蠊醇提物能夠降低大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)NO及MDA的含量，并且能夠增加大鼠血清中SOD的含量及其基因表達(dá)，說(shuō)明美洲大蠊醇提物對(duì)大鼠機(jī)體和卵巢具有一定的抗氧化應(yīng)激功能。

美洲大蠊醇提物使大鼠血清中MDA及NO的含量減少，顯示了體內(nèi)抗氧化酶防御系統(tǒng)能力的增強(qiáng)，使機(jī)體清除自由基的能力加強(qiáng)，從而使過(guò)多的自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而產(chǎn)生的MDA的含量也得到了控制，細(xì)胞膜不再受到過(guò)多自由基的侵襲，保證了其正常的組織形態(tài)和完整的功能，說(shuō)明美洲大蠊醇提物具有增強(qiáng)抗氧化能力的功能。增強(qiáng)對(duì)NO及MDA的抑制作用，提高SOD的含量和基因表達(dá)，可能是美洲大蠊醇提物對(duì)機(jī)體抗氧化功能的保護(hù)機(jī)理所在。這與鄒俊波等(2016)的研究相似，美洲大蠊醇提物能夠顯著降低乙醇致急性胃潰瘍小鼠胃黏膜組織內(nèi)MDA和NO的水平，提高CAT、SOD和GSH-PX的活性，進(jìn)而預(yù)防急性胃潰瘍。

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Influence ofPeriplanetaamericanaExtract on Antioxidant Stress in Rats

SUI Shiyan， GE Yanan， XU Quwei， SU Jingjing

(College of Agronomy and Bioscience， Dali University， Dali， Yunnan Province 671003， China)

Objective To study the effect ofPeriplanetaamericanaalcohol extract on antioxidant index of serum and ovary in rats. Methods A total of 17 adult female SD rats were randomly assigned to 3 groups after a week of adaption in the laboratorial environment. The rats of control group (n=5) were fed with physiological saline (9 mL·kg-1) through stomach perfusion. The rats of experimental groups (6 per group) were treated with low-dose (9 mL·kg-1， 0.03 g·mL-1) and high-dose (9 mL·kg-1， 0.09 g·mL-1)P.americanaalcohol extract as described above. Rats were treated every other day for 30 days. Subsequently， the serum and ovaries of rats were collected， and the levels of malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT)， nitric oxide (NO)， glutathione (GSH-PX) in the serum， the expression of geneSOD，GSH-PXandCATin the ovary were detected. Results Compared with control group， the NO content in rats serums of high-dose group (P=0.085) and low-dose group (P=0.091) showed a decreasing trend but not significant; the content of SOD in rats serums were significantly increased (P<0.05). Moreover， the content of MDA in rats serums were significantly decreased in the high-dose group (P<0.05). In addition，P.americanaalcohol extract treatment significantly increased the expression ofSODgene in ovary (P<0.05). ConclusionP.americanaalcohol extract can significantly increase the content of antioxidant index SOD and reduce levels of the oxidative stress indicators NO and MDA， and can also significantly increase the expression ofSODgene in ovary. Therefore，P.americanaalcohol extract has a certain antioxidant stress function to the ovary of rats.

Periplanetaamericanaalcohol extract; oxidative stress; gene expression; serum; ovary; rats

2016-10-14 接受日期：2016-12-15

云南省教育廳項(xiàng)目(2014C110Y); 大理大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(KYBS201406)

隋世燕(1981—)， 男， 博士， 講師， 主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與繁殖方面的研究， E-mail：sysui569@163.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160279

Q95-33

A

1000-7083(2017)02-0198-05