曹昕偉,劉瀟童,范宏成,黃 鑫,郭彥彥,沈世萍,丁書茂

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430079)

DIDP和DINP暴露對(duì)小鼠的免疫毒性作用

曹昕偉,劉瀟童,范宏成,黃 鑫,郭彥彥,沈世萍,丁書茂*

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430079)

為了探究增塑劑鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)聯(lián)合暴露對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)毒性有無協(xié)同作用,實(shí)驗(yàn)采用56只SPF級(jí)雄性Balb/C小鼠,隨機(jī)分為7 組,用同種濃度(200mg/kg)不同質(zhì)量配比的DIDP和DINP混合藥劑對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃,染毒暴露周期為28d.染毒結(jié)束后,取耳組織,測(cè)定耳腫指數(shù)和雙耳重量差;取耳組織和血清,檢測(cè)生物因子IgE,IFN-γ,IL-4等.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DIDP與DINP聯(lián)合口腔暴露使小鼠皮膚炎癥明顯加劇(P＜0.01),且隨著DINP質(zhì)量比例增大,免疫毒性逐漸增強(qiáng).這表明,DIDP和DINP聯(lián)合暴露,對(duì)小鼠有免疫系統(tǒng)毒性作用.但是,聯(lián)合暴露時(shí),各指標(biāo)均是呈遞增或遞減趨勢(shì),并未出現(xiàn)以某種比例混合時(shí)加強(qiáng)或減弱免疫毒性作用的現(xiàn)象.這表明,D IDP和D INP聯(lián)合暴露時(shí)并未有拮抗或協(xié)同作用.

鄰苯二甲酸二異癸酯；鄰苯二甲酸二異壬酯；免疫毒性作用；口腔暴露；小鼠

鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)和鄰苯二甲酸二異癸酯(DIDP)是常見的2種增塑劑.在環(huán)境污染物中,它們起到環(huán)境佐劑效應(yīng).環(huán)境佐劑是一種進(jìn)入人體內(nèi)可以使機(jī)體出現(xiàn)反應(yīng)性過敏體質(zhì)(IL-4和IgE水平增高)的環(huán)境污染物,能誘導(dǎo)發(fā)生免疫相關(guān)疾病,具有免疫毒性[1].過敏性皮炎是由過敏原引起的皮膚病屬于免疫性疾病的一種,主要是指人體接觸到某些過敏源而引起皮膚紅腫、發(fā)癢、風(fēng)團(tuán)、脫皮等皮膚病癥.其病因與發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2].口腔接觸和皮膚接觸是鄰苯二甲酸酯類常見的暴露方式之一[3],但易被忽視.人造化學(xué)品很可能是近年來人類過敏性疾病發(fā)病率上升的主要因素[4-5].過敏性皮炎在皮膚病中占相當(dāng)大的比重,但在臨床工作中卻往往被忽視,造成許多慢性復(fù)發(fā)性難治性濕疹[6].近年來,對(duì)于單一的增塑劑暴露對(duì)小鼠毒性方面的研究報(bào)道較多,但對(duì)多種增塑劑聯(lián)合作用對(duì)小鼠過敏性皮炎的研究卻鮮有出現(xiàn).為了探討增塑劑聯(lián)合暴露對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)毒性作用,本研究選取增塑劑DINP和DIDP為研究對(duì)象,采用聯(lián)合暴露方式,探討增塑劑聯(lián)合作用對(duì)小鼠過敏性皮膚炎癥影響并探明其有無協(xié)同作用,以期為控制和預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生、保障人們健康提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Balb/C小鼠,5～6周齡,體重(20±1.5)g,由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)所提供.整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間,保持動(dòng)物管理中心鼠房無菌狀態(tài)并給予充足的飲水與飼料,墊料與飼料更換速率為1次/d,并每日進(jìn)行稱重記錄.實(shí)驗(yàn)開始前,先對(duì)小鼠進(jìn)行一周的適應(yīng)性喂養(yǎng).

1.1.2 主要儀器 5415R低溫冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、FLx800熒光酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、HH-42三用電熱恒溫水箱(北京市長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)儀器廠)、超聲處理器、DNM-9602酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)、-70℃冰箱(日本三洋)、干燥箱(上海索普儀器有限公司)、調(diào)速調(diào)溫?fù)u床(太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司).

1.1.3 主要試劑 DIDP(美國Sigma-Aidrich公司),(DINP,美國Sigma-Aidrich公司)、FITC(美國Sigma-Aidrich公司)、丙酮(美國Sigma-Aidrich公司)、吐溫80(美國Amresco公司)、4%多聚甲醛溶液(美國Sigma-Aidrich公司),IgE、IL-4和IFN-γ試劑盒(上海源葉生物科技有限公司),其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí).

1.2 染毒方法

1.2.1 溶液的配制 DIDP染毒液的配制(20d染毒量):DIDP與吐溫80按照1:1的比例混勻,然后用滅菌的生理鹽水將其配制成200mg/kg的原液.

0.5%FITC的配制:0.5%FITC(W/V)致敏劑是以FITC為溶質(zhì),DBP(鄰苯二甲酸二正丁酯, Di-n-butyl ortho-phthalate,簡(jiǎn)稱DBP)和丙酮(1:1)為溶劑均勻混合而成,室溫超聲混勻并現(xiàn)配現(xiàn)用.單純使用0.5% FITC不能使小鼠成為敏感模型,DBP 充當(dāng)著必要的誘導(dǎo)作用[7].

1.2.2 確定致敏劑與效果顯著濃度 根據(jù)文獻(xiàn)[8],本項(xiàng)目的致敏劑選擇0.5% FITC,實(shí)驗(yàn)濃度選取質(zhì)量比例不同的總濃度為200mg/kg.

1.3 口腔暴露動(dòng)物模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 將56只Balb/C小鼠隨機(jī)平均分為7組,每組8只.(增塑劑后數(shù)字為質(zhì)量百分比)如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)分組與染毒流程Table 1 The experimental groups and the exposure process

將小鼠以灌胃染毒的方式暴露在相同濃度(200mg/kg)但不同配比的DIDP與DINP混合溶液和0.5%FITC中進(jìn)行模擬試驗(yàn).每天用各組相對(duì)應(yīng)劑量的DIDP與DINP混合物進(jìn)行灌胃注射,共20d.第21～22d,所有組均染毒0.5%FITC以致敏,第27d所有組的右耳涂抹20μL 0.5%FITC進(jìn)行激發(fā),左耳涂對(duì)照溶劑.第28d開始檢測(cè)各指標(biāo).

1.4 耳腫脹程度的檢測(cè)

耳腫脹程度用耳腫指數(shù)和雙耳重量差來表示,分別使用電子游標(biāo)卡尺和分析天平測(cè)量.小鼠耳腫指數(shù)用28d時(shí)小鼠左右耳同一位置厚度差來表示;分別用8mm打孔器在小鼠雙耳對(duì)稱位置取下相同表面積(直徑均為8mm)的耳部組織,分析天平稱重并計(jì)算小鼠雙耳質(zhì)量差.

1.5 組織勻漿和各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

組織勻漿的制備:收集小鼠右耳全耳,將其在預(yù)冷的PBS溶劑(phosphate buffer saline,磷酸緩沖鹽溶液,起溶解保護(hù)試劑的作用,pH7.5)中漂洗,濾紙拭干,然后在冰上用玻璃勻漿器將其和預(yù)冷的PBS 進(jìn)行勻漿,制成10%勻漿液,于4℃, 10000r/min離心后取上清,保存于-70℃冰箱,用于生物因子IgE,IFN-γ,IL-4相應(yīng)檢測(cè).

IgE、IL-4和IFN-γ含量的測(cè)定:按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.均采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),隨后采用LSD法進(jìn)行兩兩對(duì)比,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.用于表示結(jié)果的柱狀圖均是由origin6.1統(tǒng)計(jì)分析軟件繪圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 耳腫脹程度

通過測(cè)量雙耳的耳腫指數(shù)和雙耳重量差來反映小鼠的耳部腫脹程度.

圖1 小鼠雙耳耳腫指數(shù)結(jié)果Fig.1 The result of ear swelling index

如圖1、圖2所示,每組小鼠的耳部均出現(xiàn)了不同程度的腫脹和病理學(xué)變化.與1組相比,4、5、6、7組在耳腫指數(shù)和耳重差方面均是極顯著差異(P＜0.01).值得注意的是,2組與6組耳腫脹程度也均是極顯著差異(兩者DIDP, DINP比例呈對(duì)稱形式,P＜0.01).1組與3組在耳腫指數(shù)方面是顯著差異(P＜0.05),耳重差則是極顯著差異(P＜0.01).1組～7組呈遞增趨勢(shì),隨著DINP質(zhì)量比例的提高,耳腫脹程度更加嚴(yán)重,所以DINP炎癥作用比DIDP炎癥作用大.但從兩圖的趨勢(shì)來看,并未表現(xiàn)出DIDP和DINP有相互拮抗或協(xié)同的作用.

圖2 小鼠雙耳耳重差結(jié)果Fig.2 The result of difference of bilateral ear weight

2.2 IgE水平的檢測(cè)

圖3展示了各組小鼠血清當(dāng)中的IgE含量變化.可以看出,隨著DINP質(zhì)量比例的增加,IgE含量逐漸增加.與第1組相比,2、3、4、5、6、7組都有明顯增大,均是極顯著差異(P＜0.01),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.第2組～第6組均為混合組,可以發(fā)現(xiàn)它們均比第1組高,而比第7組低.

2.3 IL-4水平的檢測(cè)

圖4展示了各組小鼠右耳耳組織勻漿中IL-4含量變化.可以看出,隨著DINP的質(zhì)量比例增加,IL-4含量逐漸增加.與第1組相比,5、6、7組均有較明顯增大,均是極顯著差異(P＜0.01),3、4組增大不明顯,4組為顯著性差異(P＜0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.第2組和第6組為比例反向?qū)?yīng)組,2、6組對(duì)比為極顯著差異(P＜0.01).第2組～第6組均為混合組,它們均比第1組高,比第7組低.

圖3 小鼠血清中IgE含量結(jié)果Fig.3 The result of IgE content in mice serum

圖4 小鼠右耳IL-4含量結(jié)果Fig.4 The result of IL-4content in mice right ears

2.4 IFN-γ水平的檢測(cè)

圖5展示了各組小鼠右耳耳組織勻漿中IFN-γ含量變化.可以看出,隨著DINP質(zhì)量比例增加,IFN-?含量逐漸降低.與第1組相比,2、3、4、5、6、7組均有較明顯下降,而2、3組為顯著差異(P＜0.05),4、5、6、7組則為極顯著性差異(P＜0.01),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.第2組～第6組的混合組,均比第7組高,比第1組低.

圖5 小鼠右耳IFN-γ含量結(jié)果Fig.5 The result of IFN-γ content in mice right ears

3 討論

3.1 DIDP和DINP對(duì)小鼠皮膚炎癥作用

耳腫脹程度是本實(shí)驗(yàn)中最直接的觀測(cè)指標(biāo),也是評(píng)價(jià)該暴露模型嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)之一[9].可以看出隨著DINP質(zhì)量百分比的增加,小鼠對(duì)于過敏原的刺激更加敏感,表現(xiàn)為耳朵平均厚度增加,重量加重,耳腫脹程度嚴(yán)重,而在DINP的劑量達(dá)到100%時(shí),耳腫脹程度最嚴(yán)重.已有研究表明增塑劑DIDP和DINP兩者均有過敏性皮炎的佐劑作用[8-10],而本實(shí)驗(yàn)這些變化直觀的表明了DINP相較于DIDP免疫佐劑效應(yīng)更加明顯,從柱形圖趨勢(shì)也可看出兩者無相互作用的關(guān)系.

3.2 DIDP和DINP對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)作用

從血清中的IgE實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,隨著DINP質(zhì)量比例的升高,DIDP質(zhì)量比例的下降,IgE逐漸增大.說明作為過敏反應(yīng)的介質(zhì),有明顯的佐劑效應(yīng),會(huì)導(dǎo)致更多的Th2型反應(yīng)的產(chǎn)生.

而從耳組織勻漿中IFN-γ、IL-4的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,隨著DINP質(zhì)量比例的升高,DIDP質(zhì)量比例的下降,IL-4含量逐漸增大,IFN-γ含量逐漸減少.由于IL-4促進(jìn)IgE的合成,而IFN-γ抑制IL-4所誘導(dǎo)的IgE合成,所以更加促進(jìn)了IgE合成,有更多Th2型反應(yīng),從而更加促進(jìn)了IgE介導(dǎo)的過敏,有明顯的佐劑效應(yīng).

綜合3種生物因子的數(shù)據(jù),2、3、4、5、6組中IgE和IL-4含量均大于1組且小于7組,呈遞增趨勢(shì).2～6組中IFN-γ含量均小于1組且大于7組,呈遞減趨勢(shì).這些有規(guī)律的趨勢(shì)表明,以某種比例混合時(shí),并未出現(xiàn)協(xié)同或拮抗作用.但由于本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量比例設(shè)置仍有一定跨度,不排除以本實(shí)驗(yàn)質(zhì)量比例之外的比例出現(xiàn)相互作用的可能性.

另外,3種生物因子數(shù)據(jù)圖表明,在混合口腔暴露時(shí),DINP和DIDP不受互相影響,且DINP的過敏佐劑效應(yīng)強(qiáng)于DIDP.

4 結(jié)論

4.1 不同質(zhì)量百分比的DIDP和DINP配比劑量混合暴露時(shí)對(duì)小鼠過敏性皮膚炎癥有明顯的佐劑效應(yīng),比單一DIDP作用時(shí)更能增強(qiáng)小鼠過敏炎癥反應(yīng).同時(shí),DINP的免疫毒性高于DIDP,在兩者混合暴露時(shí),DINP更能增強(qiáng)小鼠的皮膚炎癥.

4.2 DIDP和DINP以不同質(zhì)量比例混合暴露時(shí),并未出現(xiàn)拮抗或協(xié)同作用.

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致謝：感謝環(huán)境生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的精心指導(dǎo)和大力支持,感謝團(tuán)隊(duì)中每一個(gè)成員付出的努力,也感謝丁書茂老師的指導(dǎo).最后,也感謝我們求助過的每一位師兄師姐,以及向小白鼠們致敬.

Effect of combined exposure of DIDP and DINP on the immune toxicity in mice.

CAO Xin-wei, LIU Xiao-tong, FAN Hong-cheng, HUANG Xin, GUO Yan-yan, SHEN Shi-ping, DING Shu-mao*
(School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China). China Environmental Science, 2017,37(2)：740～744

In order to study the adjacent benzene two formic acid di isononyl ester (DINP) and adjacent benzene dicarboxylic acid diisodecyl ester (DIDP) combined exposure toxicity effect on immune systemin mice with and without cooperativity. The 56SPF BALB/c mice, were randomly divided into 7groups, with the different mass ratio of DIDP and DINP mix of chemicals at the same concentration (200mg/kg) on mice were intragastric exposure, the period was 28days. After the end of exposure, the ear tissues were taken to measure the ear swelling index and ear weight differences. The tissues and serumwere taken to detect the biological factors IFN-γ, IgE, IL-4and so on. The experimental results showed that the combined exposure of DIDP and DINP made the skin inflammation of mice significantly increased (P＜0.01), and with the increase of the proportion of DINP, the immune toxicity gradually increased. This suggested that DIDP and DINP were associated with an immune systemthat was toxic to mice. However, when the combined exposure, each index was presented increasing or decreasing trend regularly, did not appear in a certain proportion of the phenomenon of strengthening or weakening of the immune toxicity. This suggested that DIDP and DINP did not have antagonistic or synergistic effects when combined with exposure.

di-isodecyl ester (DIDP)；di-isonony l phthalate (DINP)；immune toxicity；mouth exposure；the mice

X503.22,R7582

A

1000-6923(2017)02-0740-05

曹昕偉(1994-),男,四川廣元人,華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院在讀本科生,研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué).

2016-05-26

華中師范大學(xué)教育部資助大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2015020175)

* 責(zé)任作者, 副教授, dingsm@mail.ccnu.edu.cn